ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Summary

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。

Abstract

クライオ電子線トモグラフィー（cryoET）が近い対生理状態¹の分子分解能で細胞構造の3次元可視化を可能にします。しかし、cryoETとの宿主細胞環境内の個々のウイルスの複合体の直接可視化は、特にHIV-1の場合には、ウイルスの侵入のまれと動的な性質のために^、2に挑戦^している。タイムラプスライブセルイメージングは、HIV-1 ^3-7のライフサイクルの様々な側面についての多くの情報が得られているが、生きた細胞の顕微鏡検査によって得られる分解能は（〜200 nm）で制限されています。私たちの仕事は、生細胞蛍光顕微鏡、低温蛍光顕微鏡、およびcryoETを組み合わせることにより、HIV-1感染の初期のイベントの直接可視化を可能に相関法を開発することを目的とした。このようにして、生細胞とクライオ蛍光シグナルを正確にcryoETにおけるサンプリングを導くために使用することができる。さらに、構造情報はcryoET缶Bから得られeは、蛍光標識された標的の生細胞イメージングを通じて得ダイナミック機能データで補完。

このビデオの記事では、我々は、HIV-1と3D相関高速ライブセルイメージングと高解像度cryoET構造解析を用いた宿主細胞の相互作用の構造的な調査のための詳細な方法とプロトコルを提供します。 HIV-1粒子に感染したHeLa細胞を、生細胞の共焦点顕微鏡法によって特徴付けられた第一及びそのウイルス粒子を含む領域は、その後、3次元構造の詳細については、低温電子断層撮影法によって分析した。撮像データは、光学撮像と電子撮像、の2つのセットの間の相関が自作低温蛍光顕微鏡ステージを使用して達成された。ここで詳述アプローチは、ウイルス宿主細胞の相互作用の研究のためだけでなく、そのような細胞シグナル伝達、膜受容体の輸送、および他の多くの動的な細胞プロセスのような細胞生物学の広範な用途に限らず、貴重であろう。</ P>

Introduction

クライオ電子線トモグラフィー（cryoET）は細胞や組織の三次元（3D）の可視化を可能にし、クローズに生理的状態¹の分子分解能でネイティブ小器官と細胞構造の組織に洞察力を提供する強力なイメージング技術である。しかしながら、それらの放射線感受性と組み合わせた染色凍結水和した検体の本質的に低いコントラストは難しい細胞内の関心のある領域を特定し、続いて標的領域に損傷を与えることなく、正常に傾斜シリーズを行うことができる。これらの問題を克服するために、光学および電子顕微鏡法を組み合わせた相関アプローチが必要である。蛍光標識によって強調され、特定の機能を特定し、蛍光顕微鏡で配置した後、それらの座標は、高解像度の3D構造データの取得のための電子顕微鏡に転送されます。この相関方法は、標的を見つけるのに役立ちます対処すべき関心のREAS。電子顕微鏡（<300 nm）を有する試料の厚さに制限があるため、現在のセルの周辺領域のみがCryoETによる3次元構造解析に適している。さらに^8を区画またはクライオ集束イオンビーム（FIB）加工⁹によって相関イメージングの能力を拡大する硝子によって凍結された水和試験片の厚さを減らすことができます。

以前は、相関の方法は、主に大規模な静的構造^10-13用cryoETデータ収集を容易にするために使用された。これらの研究では、クライオステージは電子顕微鏡グリッドを受け入れ、正立....

Protocol

1。カーボンコーティングされた上でのHeLa細胞培養、ゴールドEMファインダーグリッド

1. グロー放電25秒25ミリアンペア下200メッシュR2 / 2 Quantifoil金EMファインダーグリッドの炭素側。
2. コー​​トフィブロネクチンとEMグリッドは、カーボン側、それを下に浮かんで、50μgの/ mlのフィブロネクチン溶液を40μlの液滴にし、組織培養フード内で2時間、UV光の下でそれを消毒。
3. プレートのHeLaグラスボトム培養皿で2×10 ⁴細胞/ ml（合計2 mlの培養液）の密度でグリッド上のセルとDMEM中で、5％CO _2、37℃で細胞を成長させるには、4.5で補充約18時間グラム/ L L-グルタミンおよびグルコース、10％熱不活性化ウシ胎児血清、100単位/ mlのペニシリン、および100μg/ml/ mlのストレプトマイシン、。 HeLa細胞は、O / N培養後に感染している。

2。 HIV-1感染症とライブセルイメージング

1. グラスボトム文化に蛍光細胞トラッカー（赤CMTPX、1μlの/ 2 ml）を追加ディッシュ（ステップ1.3から）と蛍光色素のアップテイクできるように、10分間37℃で皿をインキュベート。
2. PBSで細胞を洗浄し、50μlの予め温めておいた新鮮な培地を追加します。
3. 37°C、....

Results

ウイルス粒子の動的挙動を特徴づけるために、HIV-1に感染したHeLa細胞を、高速共焦点生細胞顕微鏡によって撮像され、粒子の動きは、自動化された3次元粒子追跡（ 図1）によって分析した。最後の共焦点ライブセルイメージとプランジ凍結（相関HIV-1粒子を失うことに十分な長さであるかもしれない）、クライオ蛍光顕微鏡ステージ（ 図3のコレクションの間に発生することができ、数分の時間経過を回避するために、光）顕微鏡で、低温電子顕微鏡カートリッジ内に、イメージング凍結水和サンプル¹⁵のために設計され、建設された。銅ブロックのプラットフォーム（図3b、黒矢印）と銅リング（ 図3d、矢じり）は、非Polara電子顕微鏡で使用するために追加されました。共焦点生細胞、クライオ蛍光顕微鏡との間の相関、及びcryoETはインデックス金Quantifoilグリッドと0.2＆ムーを使用して達成されたであり、m蛍光ラテックスビーズ（ 図2）。まとめると、 図4.......

Discussion

我々はcryoET続いタイムラプス共焦点、生細胞蛍光イメージングを用いた動的な細胞事象を分析するための高度な相関的アプローチを提供するために、プロトコルの簡単なセットを提示している。高解像度のcryoETで3D生細胞イメージングを相関する我々の方法論の開発は多くの困難な生物学などの（非静的、以前に報告されているように）、稀な動的可視などの問題、および回折限界ウイルス粒子および宿主細胞との相互作用を調査することが重要である。生きた細胞内の特定の粒子の空間的および時間的挙動は、生細胞分析することを特徴とする、定義された感染段階でのウイルス - 細胞相互作用の詳細構造が検討されている。自家製、クライオ光学顕微鏡ステージは、電子顕微鏡によって撮像生細胞及び画像から蛍光画像間の直接的な相関関係を容易にするために使用される。

に心に留めておくべきいくつかの重要なポイントがあります最適なデータの収集と分析を持つように命ずる。グリッドのエッジがでチルトシリーズの取得のための視野を妨げるので、まず、時間経過共焦点ライブセルイメージングのための複数のポジションを選ぶ際に、選択された位置は、EMグリッド.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	EMグリッド上のHeLa細胞培養
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm 直径
0.2 μm 蛍光マイクロスフィア	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	黄緑色蛍光
熱不活性化子牛胎児ウシ血清	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
ガラス底培養皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
金quantifoil finder EMグリッド	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment
>Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun FEI	,オレゴン州		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 顕微鏡	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm 作動距離) 対物レンズ
Nikon TiE 顕微鏡	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA 油浸対物レンズ
スイープフィールド共焦点顕微鏡	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
クライオ蛍光サンプルステージ	自作		機械工場による自作、デザインについては参考文献15を参照してください。