方法論記事

高塩ダイエットとルイスラットにおける慢性腎臓病を誘発するために一酸化窒素合成酵素阻害と組み合わせた5/6thの腎摘出

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DOI：

10.3791/50398

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2013年7月3日

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology & Hypertension, University Medical Center Utrecht

この記事について

サマリー

外科的腎腫瘤の5/6thを除去することによりルイスラットの慢性腎臓病（CKD）を確立するために二段階法が記載されている。外科手術、NOS阻害および高塩食の組み合わせは、因果メカニズムと新たな治療介入の開発の研究を可能にし、人間のCKDに似たモデルにつながる。

要約

慢性腎臓病（CKD）は、グローバルな問題である。 CKDの進行を遅くすることは主要な健康上の優先順位です。 CKDの恒常性の複合撹乱することを特徴とするので、統合的な動物モデルは、CKDの発症および進行を研究するために必要である。 CKDにおけるCKDおよび新規治療的介入の開発を研究するために、我々は人間のCKDのいくつかの側面に似ている、5/6th腎アブレーションモデル、進行性腎疾患のよく知られた実験モデルを使用しています。腎質量の総減少はプログレッシブ糸球体と尿細管間質傷害、残留ネフロンの損失と全身および糸球体高血圧の開発を引き起こす。また、進行性の腎内毛細血管損失、炎症や糸球体硬化症に関連付けられています。の危険因子は、常に内皮機能への影響をCKD。これを模倣するために、私たちは、一酸化窒素（NO）の枯渇と高塩分食を腎腫瘤の5/6thの除去を兼ね備えています。到着と順応した後、動物は、再右サイドuninephrectomy続い4週間の期間のために飲料水（20 mg / Lで）に補充NO合成酵素阻害剤（NG-ニトロ-L-アルギニン）（L-NNA）は、ceiveん。一週間後、小計腎（SNX）は左側に行われます。 SNX後、動物を4週間のさらなる期間の飲料水（20 mg / Lで）でLNNA、続いて二日間回復させる。グランド飼料（タイムライン図1参照）に補充高塩食（6％）は、実験を通して継続される。腎不全の進行は、プラズマ尿素、収縮期血圧およびタンパクを測定することによって、経時的に追跡される。 SNX後6週間で、腎不全が開発しました。腎機能は、 'ゴールドスタンダード'イヌリンおよびパラ - アミノ馬尿酸（PAH）クリアランス技術を用いて測定される。 CKDのこのモデルは、糸球体濾過率（GFR）の減少と有効腎血漿流量（エルプ）、高血圧（収縮期血圧> 150 mmHgで）、タンパク尿（> 50 mg/24時間によって特徴付けられる）と軽度の尿毒症（> 10 mm）である。組織学的特徴は、炎症、管状の萎縮と線維症とレムナント人口（<10％）以内に健康球体の大規模な削減につながる巣状糸球体硬化によって反射された尿細管間質損傷も含まれます。 SNXはCKDのさらなる進行を示した後、12週までフォローアップ。

概要

その進歩的な性質、その後の末期腎疾患、および関連する心血管系の罹患率および死亡率のため、CKDは、成長公衆衛生上の問題1です。 CKDの進行を遅くするので、主要な健康上の優先順位です。 CKDの恒常性の複合撹乱することを特徴とするので、統合的な動物モデルは、CKDの発症および進行を研究するために必要である。腎臓は、互いに相互作用の異なる細胞型の広い範囲から構成される。この複雑さは、 インビトロで模倣することができない。

CKDの新たな治療介入を研究するために、我々は人間のCKD 2,3のいくつかの側面に似ている、5/6th腎アブレーションモデル、進行性腎疾患のよく知られた実験モデルを使用しています。腎質量の総減少はプログレッシブ糸球体と尿細管間質傷害、残留ネフロンの損失と全身および糸球体高血圧の開発を引き起こす。これは、プログララマブルに関連付けられてい様格腎内毛細血管損失4、炎症や糸球体硬化症。の危険因子は、常に内皮機能5への影響をCKD。我々は、CKDの開発に比較的抵抗であるため、我々は一酸化窒素（NO）枯渇6、図7、図8及び高塩食9腎腫瘤の5/6thの除去を組み合わせたラット系統（ルイス）を使用した。到着と馴化後、動物は、2日後にL-NNAの継続と右サイドuninephrectomy（UNX）が続いて4週間の期間のために飲料水（20 mg / Lで）に補充NO合成酵素阻害剤（L-NNA）は、受信しません。一週間後、腎質量の3分の2の小計腎摘出術（SNX） すなわち除去は左側に行われます。 SNX後、動物を4週間の期間の飲料水に20 mg / LでLNNA続いて再び2日間回復させる。グランド飼料（タイムライン図1参照）に補充高塩食（6％）は、実験を通して継続される。 T彼は右側にUNXを実行する理由および左側SNXは、腎臓が身体の外部に露出されたとき、腎血管がそれが簡単すぎて血管を伸ばすことなく、腎臓にアクセスできるようになり左側に長いということである。文献で ​​は、モデルは、一週間後10,11,12右腎のUNX続いて、左腎の極を最初に除去されるで説明されています。我々の手では、このモデルは、腎不全のはるかに急速な発展を示したが、さらに腎機能の損失をはるかに大きい変化を示す。腎不全の進行は、プラズマ尿素、収縮期血圧およびタンパクを測定することによって、経時的に追跡される。 SNX後6週間、腎不全は、開発した糸球体濾過率（69％）および有効腎血漿流量の顕著な減少（62％）13高血圧（収縮期血圧> 150 mmHgで）ことを特徴とする、タンパク尿（> 50 mg/24時間）と軽度の尿毒症（> 10 mm）である。組織学的特徴はtubul含める炎症、管状の萎縮と線維症とレムナント人口（<10％）以内に健康球体の大規模な削減につながる巣状糸球体硬化によって反射されたO-間質損傷。フォローアップ12週後までSNXは、治療介入の評価のための機会の窓を提供し、CKDのさらなる進行を示しています。

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プロトコル

全ての実験は、ユトレヒト実験動物委員会の動物実験の倫理的なガイドラインに基づいて実行されます。プロトコルは、著者の機関の動物のケアと使用委員会の指導と承認の下で行われる。

CKDは、8週齢の雄の近交系Lewisラット（チャールズリバー、ズルツフェルト、ドイツ）に誘導される。ラットには、光、温度および湿度制御された環境での標準条件下で飼育されています。

1。手術の準備

  1. 手術器具を殺菌する：
    • 1学生組織鉗子1-2歯12センチメートル
    • 1学生の標準パターンの鉗子
    • 2 Semken鉗子
    • 1マヨはさみ
    • 1生徒アイリスはさみ
    • ハサミで1オルセン-ヘーガル針ホルダー
    • 毛布
  2. インベントリリストをチェックします。
    • 温暖化パッドとランプでテーブルを操作する
    • O の2、イソフルラン
    • 組織
    • シェーバー
    • 秤
    • 無菌操作セット
    • 滅菌ガーゼの5×5と10×10
    • 70％アルコール
    • 0.9％NaCl溶液
    • 、1mlの注射器
    • 針（25G）
    • ゲルフォームパッド：spongostan
    • VICRYL 4.0および5.0
    • ブプレノルフィン0.03 mg / kgを（生理食塩で1:10に希釈）
    • 手術後のラットクリーンケージ

2。右サイドUninephrectomy

  1. 70％アルコールでテーブルを消毒。
  2. 場所は、インダクションボックスにラットおよび4％イソフルランとO 2の1リットル流れに麻酔を誘導する。注：使用されるラット系統に応じて、事前と周術期鎮痛が処方されて、これは地元の獣医師と協議する必要があります。
  3. テーブルと場所ノーズコーンににラットを移す。ラットおよびノー​​ズコーンは、ラットの体温を維持するために、加熱パッド上に配置される。ラットIsが2％イソフルラン1リットルとO 2との混合物で換気。
  4. ラットの側面を剃るとアルコールで消毒。洗って消毒の手を、無菌手術用手袋を着用してください。ヘッドキャップとマスクを着用してください。 1を作る - 解剖鉗子と鈍いハサミを使って肋骨に平行1.5センチメートル切開。背中の筋肉の鈍的切開によって腎臓を公開します。
  5. 腎臓の下極が表示され、慎重に腎周囲脂肪組織を把持する小さな鈍鉗子を使用しています。優しく鉗子と腎周囲脂肪を引いて腎臓を外部化。この手順の実行中に副腎を妨げないように注意してください。副腎は容易に脂肪組織における中間部位に鉗子を配置することにより除去し、 図2に示すように穏やかに副腎と腎臓との間を上方に移動させることができる。
  6. ガーゼや脂肪と結合組織の周囲の明確に優しく腎臓を置きます。腎動脈と静脈を特定し、合字（5.0を配置船の周りにシングルノットとVICRYL）が、結び目を縛るません。
  7. 腎臓と結び目の間にスペースを作成するために、およそ0.5㎝大動脈に向かって血管に沿って慎重に緩い結び目を移動します。これは、切削後に結紮糸抜けを防ぐために行われる。
  8. 2ダブルノットで結び目を作る。灌流が停止された場合、腎臓の色はすぐに茶色に変わります。合字の両端を切断しないでください。
  9. 腎臓に近い腎血管をカットし、腎臓を削除します。優しく腎血管の出血をチェックするリガチャーの長い両端を引っ張る。リガチャーは、容器上の場所に滞在する必要があります。リガチャーの長い端をカットします。注意、残存腎血管がすぐに腹腔内に収納されます。
  10. しみ摘出腎臓が乾燥し、それを重量を量る。
  11. VICRYL 5.0で縫合を実行すると骨格筋切開を閉じます。 0.10ミリリットル（0.03 mg / kg）を後肢でブプレノルフィンIMを注入。クローズ皮内縫合とVICRYL 4.0と肌。これは傷口を開くラットを防ぐことができます。注：ルイスラットの呼吸抑制のために、我々はばかりイソフルランをオフにする前に、術後鎮痛を与える。
  12. 食べ物や水へのアクセスが簡単きれい孤独なケージにラットを収容。温暖化パッドO / Nでケージ半分を置き、慎重にラット翌日を確認してください。創傷は、通常、手術後6〜12時間である、閉じられ、ラットがアクティブであるときに、ラットをグループハウジングに戻って配置することができる。

3。左側小計腎摘出

  1. 2.1から2.5に説明されているように7日後、同製剤は、右側用と左側に作られています。手術前、右腎臓の重量の約3分の2に相当除去する必要がある腎組織の量が算出される。手術前にゲルフォームの小片（Spongostan、ジョンソン＆ジョンソン、ニュージャージー州）を準備。
  2. 左腎上極の周りに鋭いハサミを置き、1ストローク（はさみ位置については、 図3を参照）、上部ポールを切除。ゲル泡の部分ですぐにカバーし、滅菌ガーゼと軽度の圧力をかける。
  3. 3.3のように、腎臓の下極と繰り返します。
  4. 皮膚上の凝固を防止するために腎臓を持ち上げます。出血が止まるまで、滅菌ガーゼでゲルフォームパッドの両方で軽度の圧力を維持する。出血が持続する場合は、別のフォームパッドを追加します。
  5. 腹部内部の付着ゲルフォームパッドと残存腎臓を置きます。筋肉と皮膚を閉じて、2.9から2.12に従ってください。

4。偽手術

  1. 偽手術コントロールは、腎臓を露出させるために同じ手順を受ける。代わりに腎臓を摘出または一週間後極の切断、腎臓両方が副腎を乱さないように注意しながら、1週間間隔でカプセル化が解除されています。創傷閉鎖と術後のケアは、idである2.11と2.12にentical。

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結果

小計腎摘出後、全腎質量の約6分の1が残っている。 図4は 、前の2つの実験の平均と標準偏差が右腎の取り外された部品の重量を示しています。削除する必要がある重量は5/6th除去足らずで右腎常に結果の重量に基づいて計算されたことを示す、一つはUNX週間後に、左腎の肥大が起こるということを覚えておいてください。しかしながら、手術中に左腎の量を測定することは不可能であるので、これは元の腎腫瘤の約5/6thを除去する最も正確な方法である。

時間が経つにつれて、CKDとラットは高血圧症、尿毒症、貧血、蛋白尿とGFRとエルプの有意な減少を開発。 6週間後、確立されたCKDは、救助介入をテストするための適切な時間点を開発しました。時間が経つにつれて、高血圧と蛋白尿の強い進行はヘマトクリットながら観察され及び腎機能（GFRとエルプ）が軽度の劣化（ 図5）を示す。我々は我々の実験ではに焦点を当てていないことを他の症状は、カルシウム - リン酸と脂質代謝の撹乱、および多くの他を含む。ラットの歪みに応じて、CKDの開発が著しく1...

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ディスカッション

高塩食と一時的NOS阻害と組み合わせルイスラットにおける腎腫瘤の5/6thの外科的除去は、人間に似ているCKD CKDのモデルにつながり、CKDにおける治療的介入の因果メカニズムと有効性の研究を可能にします。

5/6thの腎摘出モデルでは、CKDのためのよく知られており、広範囲に記述されたモデルです。しかし、単に腎腫瘤の5/6thを削除すると、すべてのラット系統における即時の腎不全につながるものではない。我々はGFP +ルイスラット21の可用性としてCKDにおける細胞ベースの治療薬の効果を研究するためにルイスラットを使用すると、受信者に投与したドナー細胞の細胞トラッキング（nonGFP +）ラットができます。ルイスラットは、CKDの腎傷害と開発の発展に比較的耐性のある他の株22、15に比べて遅いです。これは人間のCKDのいくつかの側面に似ているので、そのため我々はNO枯渇と高塩食と腎腫瘤の5/6thの除去を組み合わせた高塩分の摂取量および内皮機能不全のような。読者は、高塩分食および/またはNO枯渇と5/6th腎摘出...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

私たちは、彼女の優れた技術支援のためのKristaデンOudenに感謝します。この手法は、財政的にオランダの腎臓財団、助成C06.2174によってサポートされていました。 MCVは、科学研究のためのオランダ組織（NWO）ビディ·助成金016.096.359によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
   試薬
L-NNAシグマアルドリッチN5501 
Spongostan dental:ジェルフォームパッド1x1x1 cmジョンソン&ジョンソンMS0005 
エチコン ビクリル FS-2S ナールド 4/0 V392H p/36エチコンV303H 
エチコン ビクリル RB-1+ ナールド 5/0 V303H p/36エチコンV392H 
ブプレノルフィン(0.3 mg / ml)レキットベンキーザー製薬が注文した地元の薬剤師経由不明 
   Equipment
学生組織鉗子 - 1x2歯12 cmファインサイエンスツール(FST)91121-12 
学生用標準パターン鉗子FST91100-12 
メイヨーシザーズFST14010-15 
2Xセムケン鉗子FST11008-13 
学生用アイリスハサミFST91460-11 
オルセン・ヘガーニードルホルダーFST12002-14 

参考文献

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