このビデオの記事では、セットアップの細胞体とどのように全体のマウントマウス網膜における神経節細胞からのダイナミッククランプ記録を実装するにパッチを適用する手順を示しています。この手法は、興奮性と抑制性シナプス入力の正確な貢献の調査、および神経スパイクに対する相対的な大きさとタイミングを可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
神経節細胞は、網膜の出力ニューロンであり、その活性は、特定の神経回路から生じる複数のシナプス入力の統合を反映している。パッチクランプ技術は、電圧クランプ、電流クランプ構成では、一般に神経細胞の生理学的特性を研究し、そのシナプス入力を特徴付けるために使用される。これらの技術の適用は非常に有益であるが、それらは様々な制限をもたらす。例えば、興奮性および抑制性入力の正確な相互作用が応答出力を決定する方法を定量化することは困難である。この問題に対処するために、我々はコンダクタンスクランプ1、2、3とも呼ばれる修正された電流クランプ法、動的クランプを使用し、神経細胞の興奮性に興奮性および抑制性シナプス入力の影響を検討した。この技術は、セルに電流注入を必要とし、その時の膜電位のリアルタイムフィードバックに依存する。 injectedは電流が所定の興奮性および抑制性シナプスコンダクタンス、その反転電位とセルの瞬間的な膜電位から計算される。実験手順の詳細については、ダイナミッククランプ法の全細胞の構成と雇用を達成するために、細胞をパッチクランプは、このビデオの記事に示されている。ここでは、制御条件または薬物の存在下における生理学的実験から得られた様々なコンダクタンスの波形にマウス網膜神経節細胞の応答を示している。さらに、細胞の応答を調べるために、αの関数を用いて生成された人工興奮性および抑制性のコンダクタンスの使用を示す。
概要
網膜は、眼の後部に並ぶ近透明な神経組織である。多くの研究では、視覚処理とシナプス伝達のメカニズムの最初のステップを検討するモデルとして網膜を使用しています。ホールマウントの準備における網膜ネットワークは解剖後に無傷のままであるので、その生理反応がインビボ条件下に非常に類似しているとして、シナプスの相互作用を研究するための理想的なシステムを表しています。したがって、そのニューロンの特性はパッチクランプ技術（技術の上でレビューのために、6,9,13を参照）を使用して研究することができる孤立網膜を用いた。薬剤は、様々な部位に作用するような特定の回路や神経節細胞応答に神経伝達物質の正確な寄与の同定は、しかしながら、通常は妨げられる。
光に網膜神経細胞の生理学的反応、自然な刺激が、細胞内液で満たされたガラスピペットで記録することができます。パッチCLを使用してアンプ技術、光刺激に対するニューロンの応答は、膜電位変動（電流クランプ）または電流（電圧クランプ）として記録することができます。異なる電圧で膜電位を保持し、 事後コンダクタンス分析を実施することにより、抑制性および興奮性シナプス入力5,12を単離することができる。実験のこのタイプは、通常の入浴中に、異なる神経伝達物質および神経応答に対する受容体の寄与を分離するために、異なる薬剤の存在下で行うことができる。多くの研究室からの研究の富は、このような大きさ、....
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プロトコル
1。全般設定と組織の準備
- 30分（そのストレスレベルを減少させることを目指して）のために暗闇の中でマウスをおいてください。待っている間、外液の1 Lを用意。第ミリQ水の半分リットルの重炭酸ナトリウム1.9gを溶解する。そのpHを95％O 2および5％CO 2でバブリングすることにより7.4に維持される。 5分後、ミリQ水で1 Lまでの上部、重炭酸ナトリウム溶液に加える、ミリQ水100mlにエイムス媒体の8.8グラムを溶解し、よく混合する。実験の残りのcarboxygenatedこのソリューションを保つ。
- carboxygenatedエイムス培地250mlのを取るとセットアップ電気生理学的に流体灌流システムを設定。ソリューションはcarboxygenated保つ。
- 灌流チャンバーの底部上に均一に塗沫真空グリースを薄く。カバースリップでそれを封印し、それが気密であることを確認します。グリースの少量（直径約2 mm）を取り、上にそれを置き、ボトムは、チャンバの端。これらのボールの場所にグリッド（デンタルフロスで張らプラチナフレーム）を保持し、それが網膜上にあまりにもハード押す防ぐことができます。プラットフォームにチャンバーを修正し、両方の開口部の位置を合わせます。
- 動物は2分間イソフルランとの最初の麻酔され、その後頸椎脱臼により屠殺。迅速に、小さなハサミ（湾曲した刃）で目を取り除く小さなビーカーにcarboxygen....
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結果
神経節細胞応答を阻害する異なる入力源の寄与は、様々なコンダクタンス波形を適用することにより実証される。これらの波形は通常の状態にし、ブロックアクションのみ抑制性網膜ニューロンのサブセットで電位発生。 図2Aはの注入に代表的な反応を示していることTTX、電圧依存性Na +チャネル遮断薬の存在下で異なる輝度の刺激が得られた興奮性と抑制性のコンダクタンス波形は通常の状態で灰色の背景に小さな黒点による刺激に反応して記録した。 TTXの存在下で異なるサイズの黒点で得られたコンダクタンス波形は弱い応答が（ 図2B）が観察された、同一の細胞に注入したとき。
図2Cは、様々な対の注入に別の神経節細胞の応答を示しているコントロール興奮性と抑制性のコンダクタンスの比を（：G INH比 ：午前1時00分〜1:2 G EXC）を操作されたコンダクタンス波形。これは、阻害レベルに減少細胞の応答が増加したことが明らかである。したがって、興奮と.......
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ディスカッション
ここでは、比の影響と網膜神経節細胞の出力に興奮と抑制の相対的なタイミングを評価するためのダイナミック·クランプを使用することを示しています。ダイナミッククランプは生きているニューロンに生理的に記録されたまたは人工シナプスコンダクタンスを導入するためのコンピュータシミュレーションを利用しています。この方法論はコンダクタンスが変更され、ニューロンの応答への影響を計算するための神経細胞に注入することのできるインタラクティブなツールを提供しています。コンダクタンス波形を視覚刺激は、制御条件および特定の細胞や回路の寄与を分離する薬剤の存在下で感光体を活性化するために使用される実験から求めることができる。これらのコンダクタンス波形の異なる組み合わせの注射は、出力をスパイクへの貢献を明らかにする。動的クランプ記録の使用はまた、異なる光適応conditio下で行うことができる背景雑音のレベルの操作を可能に NS。また、コンダクタンス波形はまた、α関数などのシナプス入力のモデルから、また、電圧依存性（ すなわち、NMDA受容体）を有するだけでなく、電位依存性イオンチャンネル又は電気的に結合さ細胞に対するシナプス入力のために生.......
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開示事項
すべての手順は、最初にシドニー大学の動物実験倫理委員会によって承認された後、科学的な目的のために、動物のケアと使用のための実践のオーストラリアのコードのガイドライン（国民健康オーストラリアの医学研究評議会に合わせて行われた）。
謝辞
この作品は、オーストラリア研究会議（ARC DP0988227）とバイオメディカルサイエンスの調教からバイオメディカルサイエンス研究イニシアティブ助成、シドニー大学でサポートされています。機器のパッチクランプアンプEPC 8はバイオメディカルサイエンスの調教からスタートアップ基金、シドニー大学によって資金を供給された。機器InstruTECH LIH 8 +8データ収集システムは、レベッカL.クーパー財団とバイオメディカルサイエンスの調教からスタートアップ基金、シドニー大学からの資金で購入した。我々は彼らの洞察に満ちた提案やコメントのために匿名の査読に感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| イソフルラン吸入麻酔 | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES ナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | ||
| 塩化マグネシウム溶液 (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| シン 5'-三リン酸 (ATP) 二ナトリウム塩水和物 | Sigma-Aldrich | ||
| グアノシン 5'-三リン酸ナトリウム塩水和物 | Sigma-Aldrich | ||
| エチレングリコール-ビス(2-アミン–thylether)-N,N,N',N',n'-四酢酸 | Sigma-Aldrich | ||
| パラホルムアルデヒド粉末, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX株式会社ラボラトリーズ | ||
| Equipment | |||
| キャピラリーガラスチューブ、炎研磨端部付き(OD = 1.50 mm、ID = 0.86 mm、長さ= 15 cm) | ワーナーインスツルメンツ | 64-0794 | |
| シングルステージガラスマイク–レクトロードプーラー | ナリシン 日本 | 型 PP-830 | |
| ミニパルス2 | ギルソン | ||
| ミレク-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| ルアーロック 再利用可能な皮下注射針:30G | スミス 甥 (オーストラリア) | ||
| シングルインラインソリューションヒーター | ワーナーインスツルメンツ | モデル SH-27B | |
| デュアルオートマチック温度コントローラー | ワーナーインスツルメンツ | TC-344B | |
| オリンパス 実体顕微鏡 SZ61 | オリンパス株式会社 | ||
| オリンパス顕微鏡BX50WI:40倍対物レンズ付き | リンパス株式会社 | ||
| 0-30 V 2.5 ADC電源 | ディックスミスエレクトロニクス | Q1770 | |
| デジタル顕微鏡カメラProgResMFクール | イエナオプティック | ||
| マイクロマニピュレーターMP-225 | ッター機器会社 | ||
| パッチクランプアンプEPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8データ収集システム | HEKA Elektronik | ||
| コンピュータ: DELL | Dell Corporation |
参考文献
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E.
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再版と許可
