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方法論記事

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定

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DOI:

10.3791/50401

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2013年6月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Perinatal Pharmacology, University Hospital Zurich, 2Laboratory for Materials - Biology Interactions, EMPA Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

この記事について

サマリー

ザ ex vivoでデュアル再循環ヒト胎盤灌流モデルはヒト胎盤を横切る異物およびナノ粒子の移動を調査するために使用することができる。このビデオプロトコルでは、胎盤の血流を正常に実行するために必要な機器や技術について説明します。

要約

十年前にヒト胎盤は母親と胎児の間に不可解な障壁であると考えられた。しかし、サリドマイド誘発性の先天性欠損症や多くのその後の研究の発見は、その後、反対のことを証明した。ニコチンのような今日、いくつかの有害な異物、ヘロイン、メタドンまたは薬物と同様の環境汚染物質は、この障壁を克服するために記載された。ナノテクノロジーの使用が増えていると、胎盤は、誤って露出を介して、または意図的に潜在的なナノ医療アプリケーションの場合における新規ナノ粒子と接触する可能性があります。胎盤は、ほとんどの種特異的な哺乳類の臓器1であるため、動物実験からのデータは、ヒトに外挿することはできません。したがって、Panigel らによって開発されたex vivoでのデュアル循環ヒト胎盤灌流、1967 2と連続シュナイダーらによって修正された、1972年 3において、優れたモデルTとして機能することができoが生体異物または粒子の移動を検討する。

ここでは、再現性のある結果を取得するために、ヒト胎盤灌流プロトコルおよびさらなる発展を再循環させるex vivoでの二重焦点を当てる。

胎盤は帝王切開を受け合併症長期妊娠から母親のインフォームドコンセント後に得られた。無傷の子葉の胎児と母体の血管が少なくとも5時間カニューレを挿入し、灌流した。モデル粒子として、直径80〜500nmのサイズを有する蛍光標識ポリスチレン粒子は、母体回路に加えた。 80 nmの粒子は胎盤関門を通過し、500 nmの粒子は胎盤組織または母性回路に保持している間、胎児に胎盤を介して転送された物質のための完璧な例を提供することができました。 ex vivoでヒト胎盤灌流モデルは、約信頼できる情報を提供するいくつかのモデルの一つである予測と臨床関連データを提供しています重要な組織関門における生体異物の輸送挙動。

概要

胎盤は、酸素、二酸化炭素、栄養素および廃棄物と母と互いに分離成長する胎児の二血液回路を維持することができ、同時に交換を担当する複雑な器官である。さらに、母体の免疫系による子供の拒絶反応を防止し、妊娠を維持するホルモンを分泌する。セルラバリアは4,5横細胞膜なしで真シンシチウムを融合して形成栄養膜細胞によって形成される。全体の胎盤は、一胎児絨毛ツリーが含まれており、胎盤の一つの機能単位を表すいくつかの子葉、で構成されています。

胎盤のバリア機能の研究は、1960年代にサリドマイド誘発さ奇形の発見で激化しました。明白な理由のために妊娠中の女性との転座の調査を行うことができない。したがって、様々な代替モデルは6,7開発されているまで。最も有望な、おそらくほとんどの臨床関連モデルはPanigelや同僚2,3によって開発されたex vivoでヒト胎盤灌流モデルです。

多くの女性は、妊娠8時の薬物や環境汚染など、さまざまな異物にさらされている。既に妊娠中に定期的に投与されたいくつかの薬については、 インビボ試験で臍帯血中のそれと母体血中濃度と比較することによって行うことができる。しかし、一般的に胎児およびこれらの物質の催奇形性における薬物動態と力学に関する限られた情報があります。

例えば、ヘロインのようなアヘンを簡単胎盤関門を通過し、子宮内発育制限、早産や自然流産9,10につながることができます。だから、妊娠中行方不明禁欲の場合メタドンによる補充療法が推奨される。 前のインビボでヒト胎盤灌流モデルは、胎児循環へのメタドンの転送が配達12後算出臍帯血対母体血中濃度比とよく相関ごくわずか11であることが明らかになった。

ナノテクノロジーは、特に医学の成長分野である。だから、自然に細かい発生（直径<2.5μm）で、森林火災、火山噴火の煙でと砂漠の塵に超微粒子（直径<0.1μm）で、工業ナノ材料への暴露（少なくとも一次元<0.1μmの13の下）増加している。これは、工業ナノ材料の毒性可能性について疑問を提起した。全く人間の危険がまだ証明されなかったものの、工業ナノ粒子は毒性結果14につながる有害な生物学的反応を引き起こす可能性があることを示す主な実験的研究があります。最近では、いくつかの研究では、への出生前暴露を示した大気汚染は、新生児と子供15,16が高い呼吸必要性と気道炎症にリンクされています。また、小型のナノ粒子は、特に胎児や妊婦のいずれかを治療するための薬物担体として使用されるかもしれない。そのため、異なる生体異物やナノと胎盤関門を通過する能力を広範囲の研究が必要であることが明らかになります。工業ナノ材料への胎盤透過性に関する現在の研究の実際の概要はメネゼスらに要約され、2011年17 Buerki-Thurnherr らは 2012年7。

ex vivoでデュアル循環ヒト胎盤灌流モデルでは、様々な内因性および外因性化合物3,11,12,18,19の胎盤輸送との責任のメカニズムのような胎盤の他の機能の広い範囲を研究するための制御された信頼性の高いシステムを提供しています子癇前症のような病理学的状態の開発<> 20-22（商標）。このプロトコルでは、蓄積効果や生体異物やナノ粒子の広範なセットの転率の研究を可能に設定し、扱い、そして方法に主に焦点を当てています。

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プロトコル

1。灌流システムの準備

  1. 水浴、灌流チャンバー、酸素化のための2つの列が、2蠕動ポンプ、2バブルトラップ、2つの流ヒーターやつの圧力センサ（ 図1）で構成される灌流システムをセットアップします。 図2のスキームに従ってシリコーン及びポリ塩化ビニル材料から成るチューブセクションで、これらのコンポーネントを接続します。最後にそれぞれ、胎児と母体の回路を表す2つの回路があります。
  2. 水浴、フローヒーターや灌流チャンバーの加熱をオンにします。温度は37℃であるべき
  3. 灌流媒体を暖める（NCTC-135組織培養培地は、アールのバッファ（6.8グラム/ L塩化ナトリウム、0.4グラム/ L塩化カリウム、0.14グラム/ Lリン酸一ナトリウム、0.2グラム/ L硫酸マグネシウム、0.2グラムで1:2に希釈したグルコース（1g / Lの）を補充/ Lの塩化カルシウム1,2グラム/ Lグルコース）、デキストラン40（は10g / L）、（10グラムウシ血清アルブミン/ L）、ヘパリンナトリウム（2,500 IU / L）、amoxicilline（250ミリグラム/ L）および重炭酸ナトリウム（2.2グラム/ L）、水浴のpH 7.4）。
  4. - 20ミリリットル15：連続して再び200ミリリットルの蒸留水（流量）を200ミリリットルの蒸留水を用いて胎児および母体回路の動脈系、b）は、50ミリリットルの1％水酸化ナトリウム、c）が1％のリン酸と、d）リンス/分）。
  5. 胎児の動脈管に、胎児のカニューレ（鈍針が修正翼針輸液セットに接続されるべきであるØ1.2ミリメートル）を接続します。
  6. すべてのチューブが培地（:15-20 ml /分の流量）が含まれているまで、灌流媒体と胎児と母体の回路の動脈システムをすすぐ。このステップの間にバブルトラップを埋めると、トラップのすべての泡下流を削除します。その後、ポンプを停止します。これは、求心性動脈管は常に気泡の自由であることが本当に重要である、そうでない場合は挿管後、特に細かい胎児の血管が破裂することができます。
  7. ガス流量をオンにします。母性回路が無線酸素化され第5％の二酸化炭素および95％合成空気および5％の二酸化炭素および95％の窒素と胎児の回路。
  8. 圧力センサの記録を開始します。

2。プラセンタをカニューレ挿入

  1. プライマリー帝王切開後の合併症のない長期の妊娠から無傷の胎盤を入手。書面による同意は、配信前に母親（私たちの研究の場合に得られた）が与えられなければならず、研究は（我々の研究でそうだった）地元の倫理委員会によって承認されなければならない。最初のビジュアルコントロールは、健康と無傷胎盤を保証するために助産師が行ってください。
  2. 胎盤のカニュレーションは重要なステップです！灌流時に組織内のすべての小さな混乱は母体と胎児の循環間のリークにつながることができます。胎盤は分娩後30分以内に取得する必要があります。
  3. 母親の側に見える混乱することなく、胎盤の辺縁帯に無傷子葉を選択します。絨毛膜板で、臍動脈および外科縫合材料を使用して後でカニューレ側（へその緒に向かって）に上流の静脈の両方に関連する枝を縛る​​。常に2つの結び目を作る。
  4. 最初の胎児の動脈カニューレを挿入。胎児胎盤動脈は常に静脈より小さく、薄い。
  5. 胎児の動脈の周りに縫合糸を作ることが、それをすぐにタイアップされません。鉗子で容器を持ち、慎重に容器をカットし、動脈に小さなカニューレ（Ø1.2ミリメートル）を置く。次に（2ノット）縫合糸を結ぶ。
  6. 同じように胎児の静脈に進みますが、大きめのカニューレ（ミリメートルØ1.5から1.8、鈍針が修正翼針輸液セットに接続する必要があります）を使用します。
  7. 胎児のポンプ（2 ml /分）をオンにします。そこには目に見える漏れはありませんと、血液が胎児の静脈カニューレの外に発する場合は、徐々に4ミリリットル/分まで流量を増加。胎児の動脈内の圧力を守って、それが70 mmHgのを超えてはならない。胎児またはメイトで流体が漏れる場合外部カニューレは別の縫合糸で固定します。
  8. 胎児側にティッシュホルダーに胎盤を置き、スパイク以上胎盤膜および組織を引っ張る。最後に灌流子葉はティッシュホルダーの穴の真ん中にする必要があります。
  9. 唯一の膜はシリコン膜（Ø1ミリメートル）あるいは、2パラフィルムの部分と胎盤を保持している部分を安定させる。
  10. 完全なティッシュホルダーを組み立て、ネジを締めると張り出した組織を切断する。静脈と動脈カニューレが挟まれていないが、代わりにティッシュホルダーの小さなチャネルにあったことに注意してください。
  11. 、逆さまにティッシュホルダーを回し灌流チャンバーに入れ、カバーを追加します。さて、母親の側が一番上にある必要があります。胎児の回路はまだそのままであると媒体が胎児の静脈管から流出されている場合は、必ず確認してください。
  12. 母性ポンプ（12 ml /分）をオンにします。番目で3鈍カニューレ（Ø0.8ミリメートル）を導入脱落膜プレートを貫通することにより絨毛空間に母親の動脈管の電子終わり。母性回路に灌流液を戻すにしても灌流チャンバー上部の最も低い位置に母親のポンプに接続されている静脈ドレインとして一本のチューブを入れた。
  13. 胎児の静脈管に胎児の静脈カニューレを接続します。

3。灌流の前および実験フェーズを実行する

  1. 組織は、出産後虚血期から回復すると絨毛空間で血を洗い流すようにするには、20分のプレオープン段階が必要である。母体と胎児の静脈を意味する灌流媒体を含む動脈リザーバに戻ってつながるされていない。瓶の中に胎児と母体の静脈流出を収集し、事前フェーズの後に、それを捨てる。
  2. 灌流の整合性を評価する20分の別のプレフェーズを実行しますが閉回路にする。灌流培地で2つの別々の貯水池を使用胎児と母体の回路用と胎児の貯水池と母性貯水池における母性静脈流出裏に戻って胎児の静脈流出を導くことによって回路を閉じます。
  3. メイン灌流実験では120ミリリットル灌流培地（妊産婦のためのものと胎児の貯水池のためのもの）を持つ2つのフラスコを準備します。 1つは母親のリザーバーに分析したいと考えている蛍光標識生体異物またはナノ粒子：放射性標識された14 C-アンチピリン（放射性物質;、陽性対照として注意4 NCI / ml）を追加します。よく母親の灌流液を混ぜる。
  4. 2準備フラスコ（胎児と母体の貯水池）で純粋な灌流培地を交換することによって、実験を開始します。胎児の貯水池とバック母性貯水池における母性静脈流出に戻って胎児の静脈流出を導くことによって回路を閉じます。
  5. 6時間灌流を継続し、定期的にサンプルを取る。常に胎児と母体の中の培地を再懸濁し撤退前の貯水池。
  6. 灌流時の胎児の動脈（70 mmHgのを超えてはならない）、両方の回路内のpH（生理的範囲7.2から7.4にする必要があります）や貯水池の両方のボリューム（胎児のボリュームの損失は4ミリリットル/時を超えてはならない）内の圧力を制御。必要ならば、塩酸または水酸化ナトリウムのいずれかを使用してpH値を調節​​する。
  7. 胎児のリザーバ内容積損失が4を超える場合ミリリットル/時そこに、組織内のリークであり、1つは、灌流を停止する必要があります。漏れなしで6時間灌流の成功率は15〜20％程度である。
  8. 6時間後の血流を停止します。ポンプ、水浴、フローヒーターやガスの流れをひっくり返す。
  9. ティッシュホルダーから胎盤を外し、灌流子葉をカット（unperfused組織よりも明るい）、それを重量を量る。
  10. unperfused（初めにカットされた胎盤の一部、すでにプレフェーズ中に取ることができる）からサンプルを取り出し、灌流組織（各約1g）、-20℃で保管し均質化されるまで以降の分析のために液体窒素である。組織病理学的評価のための4％ホルマリンで別の組織サンプルを修正。サンプルは胎盤のすべての層を含める必要があります。
  11. ）50mlの1％水酸化ナトリウム、cが再び））を順次）200ミリリットルの蒸留水、bを加え胎児および母体回路の動脈系をすすぐことによって灌流した後、200ミリリットルの蒸留水を50ミリリットルの1％リン酸と、dチューブをきれい（流量:15-20 ml /分）。

胎盤灌流実験の全体の作業手順を図3に示されている。

4。サンプルの分析

  1. 残留赤血球を除去するために分析の前に800×gで10分間灌流液のサンプルを遠心分離します。さらに分析するために、上清を取る。サンプルは4℃で一晩放置することができますレプチンとhCGの生産の分析のための試料を-20℃で保存することができます
  2. の透過性を評価するために、胎盤は、液体シンチレーションによって14 C-アンチピリンを分析。ベータカウンターで5分間3ミリリットルのシンチレーションカクテルとメジャーで胎児と母体のサンプル300μlのを混ぜる。
  3. 蛍光ナノ粒子の移転や、興味のある異物がマイクロプレートリーダー（示された波長は、我々は、ナノ粒子に使用黄緑色のラベルの分析のためのもの）で485 nmの励起と528 nmの放射で蛍光を読み取るを評価する。
  4. 灌流時の胎盤組織の実行可能性を判断するには、自動化された血液ガスシステムと胎児と母体の回路中のグルコース消費量と乳酸産生を測定します。また、胎盤ホルモンヒトchoriongonadotropin（hCGの）および酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によって均質化された組織サンプル及び灌流液中のレプチンの産生を評価する。

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結果

図4Aは、胎児のコンパートメントに移管されていない大きなポリスチレン粒子（500nm以下）に比べて胎盤を通過して輸送された小さなポリスチレン粒子（80 nm）での灌流プロファイルを示しています。各データポイントは、少なくとも3つの独立した実験の所定の時点までの平均粒子濃度を表す。ポリスチレンの場合は胎盤転送はサイズ依存19であるナノ粒子。 500 nmのポリスチレン粒子も灌流6時間後に胎児の回路に登場されていないながら、胎盤灌流3時間後、最初に追加された80 nmのポリスチレン粒子のすでに20〜30％が、母性から胎児の回路に移した。それにもかかわらず、500nmの粒子の母体濃度が減少している。灌流後の組織の組織切片上の蛍光画像は、これらの粒子は胎盤（データは示さず）の絨毛に蓄積することを示した。 図4B 放射性標識14 C-アンチピリンの特性灌流プロファイルを示しています。小親油性分子としてアンチピリンは受動拡散経由胎盤関門に分散や回路の整合性のためのコントロールとして機能します。灌流の4-6時間後、...

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ディスカッション

デュアル循環灌流下に答えなければならない質問に応じて可能な他のいくつかの実験的な構成がありますが、ここに示しました。特にオープン胎盤灌流は、一般的に定常状態濃度3に薬物クリアランスを評価するために使用される。再循環血流のセットアップはまた、内因性又は外因性物質の能動輸送を確認するために適用することができる。このアプローチのために生体異物の同じ濃度は、母体および胎児循環に添加されなければならない。濃度勾配に対して能動輸送が存在すると仮定し、両方の回路のいずれかで試験物質の蓄積は24を観察することができる。注目すべきは、唯一の胎児の回路に被験物質を添加することも可能であり、この特定の物質25の胎盤関門を横切る輸送のメカニズムを明らかにすることができる。

プロトコルは、ティムをかけて進化してきたeおよび特に流量、灌流媒体の組成、酸素及び加熱26,27の形態に係る別の研究グループ間で変えることができる。特に流量は胎盤転写が発生する時間に影響を与えることができる。これを制御するために、アンチピリンのような...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

この作品は、財政的にスイス国立財団、（NRP 64プログラム、全く4064から131232を付与しない）によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
NCTC-135 ミディアムICN バイオメディカルズ(株)10-911-22Cは、シグマ(M3769)
塩化ナトリウム(NaCl)シグマ-アルドリッチ、フルーカ71381
カリウム(KCl)病院薬局:シグマ(P9541)
リン酸一ナトリウム(NaH2PO4·H2O)メルク106346
硫酸マグネシウム (MgSO<>sub4 ·H2O)Sigma-Aldrich, Fluka63139
塩化カルシウム (CaCl, 無水)メルク102388
D(+) グルコース (無水)Sigma-Aldrich, Fluka49138
重炭酸ナトリウム (NaHCO3)Merck106329
Leuconostoc spp.Sigma-Aldrich31389
ウシ血清アルブミン (BSA)ApplichemA1391
アモキシシリン (クラモキシル)グラクソ・スミスクライン AG2021101A
ヘパリンナトリウムB. Braun Medical AG3511014
水酸化ナトリウム (NaOH) ペレットメルク106498
注意: 腐食性オルトリン酸 85% (H3PO4)Merck100573注意: 腐食性
母体ガス混合物: 95% 合成空気, 5% CO2PanGas AG
胎児ガス混合物: 95% N2, 5% CO2PanGas AG
アンチピリン (N-メチル-14C)アメリカン放射性標識化学品株式会社アーク0108-50 μCI注意:放射性物質(比放射能:55mCi / mmol)
シンチレーションカクテル(IrgaSafe Plus)Zinsser Analytic GmbH1003100
ポリスチレン粒子80 nmPolyscience, Inc.17150
ポリスチレン粒子 500 nmポリサイエンス17152
EQUIPMENT
ウォーターバスVWR462-7001
サーモスタットIKA-Werke GmbH Co. KG3164000
蠕動ポンプIsmatecISM 833
バブルトラップ(ガラス)UNI-GLAS Laborbedarf
フローヒーターUNI-GLAS Laborbedarf
圧力センサー+分析用ソフトウェアMSR Electronics GmbH145B5
NotebookHewlett Packard
ミニチュアガス交換酸素装置リビングシステム計装LSI-OXR
タイゴンチューブ (ID: 1.6 mm;外径:4.8 mm)IsmatecMF0028
用チューブ(PharMed BPT;ID:1.52 mm)IsmatecSC0744
Blunt Cannulae(0.8 mm)Polymed Medical Center(ポリメッドメディカルセンター)03.592.81
Bluntカニューレ(1.2 mm)Polymedセンター03.592.90
Bluntカニューレ(1.5 mm)Polymedセンター03.592.94
Blunt Cannulae(1.8 mm)ポリメッドメディカルセンター03.952.82
パラフィルムVWR291-1212
ティッシュホルダー付き灌流チャンバー(プレキシガラス)内部技術部門同様の機器は、英国のHemotek Limitedから入手可能
外科用縫合材料(PremiCron)B. Braun Medical AGC0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly)Hospira, Inc.ASN 2102
多方向ストップコック (ディスコフィックス C-3)B. Braun Medical AG16494C
手術用ハサミB. Braun Medical AGBC304R
解剖ハサミB. Braun Medical AGBC162R
ニードルホルダーB. Braun Medical AGBM200R
解剖用鉗子B. Braun Medical AGBD215R
血液ガス自動装置 ラジオメーター メディカル ApSABL800 FLEX
マルチモードマイクロプレートリーダーBioTekSynergy HT
液体シンチレーションアナライザーGMI, Inc.Packard Tri-Carb 2200
シンチレーションチューブ5.5 mlZinsser Analytic GmbH3020001
Tissue HomogenizerOMNI, Inc.TH-220
pHメーター+電極VWR662-2779
塩化からのミディアム199に置き換えることもできますポンプメディカルメディカルです

参考文献

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