胚心室内皮細胞の単離

サマリー

初代細胞培養物は、特に、特定の発達段階におけるトランスジェニックマウス胚からの細胞の特定の集団を分析するのに有用な技術である。ここでは、胚の心室を切開し、解離、および抗体結合ビーズを認識し、さらなる分析のために内皮細胞を分離しています。

要約

細胞培養が大幅無数培養条件下で細胞の個々の集団を評価するために我々の能力を強化しています。不死化細胞株の使用の容易さのために重要な利点を提供するが、これらの細胞株は、すべての潜在的な細胞タイプでは使用できない。特にトランスジェニックマウスからの関心の特定の領域から一次細胞を単離することにより、より微妙な研究を行うことができる。基本的なテクニックは、臓器や、興味のある部分的器官（心臓や心臓の特定の領域など ）を解剖し、単一細胞に臓器を解離が含まれます。これらの細胞は、その後、その他の細胞型を認識する抗体に結合した磁気ビーズと共にインキュベートする。関心のある細胞を、次いで、ビーズから細胞をトリプシン解離短いインキュベーションでは、磁石を用いて単離することができる。これらの単離された細胞は、次いで培養し、必要に応じて分析することができる。この手法はもともと成体マウスオルガンのために設計されましたsがなく、簡単にここに実証されるように、胚の器官で使用するために縮小することができます。我々の関心は、途上冠状血管系であるため、我々は特定胚の段階で細胞のこの集団を勉強したかった。従って、オリジナルのプロトコルは、胚心室のサイズが小さく、これらの発達段階における内皮細胞の低電位収率と互換性を持つように変更しなければならなかった。このスケールダウンのアプローチを利用して、我々は、トランスジェニック胚心室内皮細胞における冠状動脈神経叢リモデリングを評価しました。

概要

不死化細胞株の出現は、基本的な細胞生物学^1に革命^をもたらした。現在入手可能な細胞株は広範囲の器官に由来し、すべての主要な細胞型を包含している。しかし、確立された細胞株はいくつかの制限があります。不死化の方法は、具体的に明らかに寿命および増殖に関して、細胞の挙動を変化させるだけでなく、例えば²細胞骨格タンパク質などの予期しないタンパク質の発現に影響を与えることができる。多くの異なる細胞株が利用可能であるが、さらに、全体生物内であっても単一の細胞型間に有意な多様性がある。特定の番組多様な行動の内皮細胞は、動脈や静脈と流れの種類、容器³に存在している、彼らはラインかどうかに基づいて。発達の観点から、さらに押圧しかしながら、（参照、 例えば、t利用できる細胞株の大部分は、成体組織から誘導されるということであるATCCから入手彼がコレクション）。これらの成人の細胞株は、おそらく彼らの胚性前駆体の動的な性質を要約するしないでください。開発中に観測された、急速に変化する時空間的遺伝子発現パターンはまた、与えられた発達段階で1つの器官からの内皮細胞は、異なる発達段階で、同じ臓器の内皮細胞と同じように動作しない可能性を示唆している。

市販の不死化細胞株を使用する代わりに、一次細胞は、関心のある特定の組織から単離することができる。この手法の利点の中に、これらの一次電池であっても、特定の器官ま....

プロトコル

1。抗体結合ビーズを準備

1. 前解剖へある日、製造元の指示に従って適切なダイナビーズ（ラットで育った抗体について例えばラットIgGダイナ、4×10 ⁸ビーズ/ ml）で選択した抗体を兼ね備えています。 BDのラット抗CD31抗体（0.5μgの/μL、内皮細胞を分離するために使用される）の場合は、3μlの抗体は、最終1.5μgの抗CD31抗体の濃度及び/ 1×10 ⁷ビーズのため、すべての25μlのビーズのために追加されます25μlのバッファー。
2. 4℃でビーズと一晩抗体をインキュベート

2。コラーゲンプレートの準備

1. 単にコラーゲンコートプレートとは対照的に、コラーゲンゲル上で増殖させたときに単離された細胞は、より迅速に細管を形成する。 ⁶で説明したようにそのため、コラーゲンゲルは、解剖前の晩に行われる。組織培養フード内で氷の上で、以下の試薬（十分に19の井戸のために）結合：206.4μlの滅菌Hを<サブ> 2 O、140.4μlのコラーゲンタイプI（4.08 mg / ml）で、38.4μlの10倍M199、及び1.15μlの5 MのNaOH。
2. 384ウェル組織培養プレートのウェル減らすこのコラーゲンゲルのピペットを20μl。 30分間37℃の組織培養インキュベーターでプレートを置きます。
3. 各....

結果

CD31を認識する内皮細胞特異的抗体を使用して、内皮細胞が胚（E）13.5（ 図1A）および18.5（ 図1B-1D）の心室胚から単離した。未処理の培養皿で増殖させた場合、これらの細胞は丸められたままと近コンフルエント（ 図1A）場合、石畳のパターンを形成するであろう。希薄コラーゲンはまた、ウェルコーティングするために使用されており、内皮細胞が（ 図1B）に付着するが、それらはより少ない鎖を形成する際コラーゲンゲル上にめっき（ 図1Cおよび1D）。ウェルコラーゲンゲルを含有する中で増殖させた内皮細胞（ 図1Cおよび1D）フォーム細胞-細胞相互作用およびコラーゲンコートと比較して、コラーゲン上に成長したときに分岐するように開始し、コラーゲンゲル上に成長したときに、このプロセスがより速く発生するフォーム鎖プレート。これらの内皮鎖は血管内皮マーカーISO-レクチンと正のラベル（ 図1D）。単離された細胞は培養液中で1週.......

ディスカッション

プライマリー胚細胞での作業小説実験は、開発のin vitro重要なステップに対処することができます。しかし、単離手順は簡単ではありません。細胞はどのような種類の単離するための重要なステップは、細胞が十分にコラゲナーゼ消化により分離されていること、およびそれらがよく洗浄工程中に懸濁されることを確実に挙げられる。ピペッティングによる機械的切開が大幅コラゲナーゼステップ中に細胞を分離するのに役立ち、そしてフィルタリングステップは、細胞の塊を除去します。これらの手順では、人口の純度を向上させ、得られます。

播種密度も小さく器官からの細胞を単離する重要な関心事である。チューブの形成は、内皮細胞密度⁷に依存するため、我々は播種密度を高めるために384ウェル組織培養プレートに依存していた。これさえ考慮して、私達はより低い細胞密度（ダイアーとパターソン、プロでに対応するために、いくつかの分析を修正しなければならなかったグレス）。細胞数が懸念される場合にこのように、より小さいサイズの文化はよく問題を軽減することがあります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
REAGENTS
時限妊娠マウス			目的の胚期で解剖する
抗マウス CD31	BD Bioscience	553370
ラット IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
コラーゲン	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
コラゲナーゼ、I型	Worthington Biochemical	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
内皮細胞増殖培地	(注に記載されているように実験室で製造)		20% FBS、5 μMβ-mercapt–タノール、50 μg/ml 心電図、および1x ペニシリン/ストレプトマイシン
β-メルカプト–タノール	Sigma-Aldrich	M6250
ECGS	Biomedical Technologies, Inc.	BT-203
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140
トリプシン-EDTA	Gibco	25300
384 ウェル培養プレート	Greiner	T-3037-6	プレートは、6; 作業表面積 10 mm2コラーゲン タイプ I BD 354236 で説明したように、薄いコラーゲンゲルで調製しました
			濃度 1.5 mg/ml
M199, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	どおりに使用 13
EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110
DynaMag	Invitrogen	123-21D
卓上遠心分離機	Thermo	75002430

指示