抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

Summary

溶菌ファージバイオセンサーと抗体ビーズメチシリン耐性（MRSA）と敏感ブドウ球菌の細菌を区別することができます。ファージを水晶振動子マイクロバランスセンサーの表面上にラングミュア·ブロジェット法で固定し、広範囲のブドウ球菌プローブとして働いていた。抗体ビーズはMRSAを認識しています。

Abstract

黄色ブドウ球菌株の広い宿主範囲およびペニシリン結合タンパク質（PBP 2a）の抗体共役ラテックスビーズは、メチシリン耐性（MRSA）および感受性（MSSA）Sの識別用に設計されたバイオセンサーを作成するために利用されているを有する構造的に形質転換された溶菌バクテリオファージ。ブドウ種 ^1,2。溶菌ファージは、水 - クロロホルムインタフェースとの接触によりファージスフェロイドに変換されている。ファージスフェロイド単層をラングミュア·ブロジェット（LB）法³でバイオセンサー表面上に移動されました。作成されたバイオセンサーは、細菌ファージの相互作用を評価するための放熱追跡と水晶振動子マイクロバランス（QCM-D）によって検討されている。細菌スフェロイド相互作用が減少し、共振周波数とMRSAとMSSA株の両方の消費エネルギーの上昇につながった。細菌結合した後、これらのセンサは、さらにペニシリン結合タンパク質抗体ラテックスビーズにさらされているS。 MRSAで分析センサーは2A抗体ビーズをPBPに応え、MSSAで検査センサーが応答を与えませんが。この実験的な区別は、メチシリン耐性と敏感S.間に明確な区別を決定黄色ブドウ球菌株 。同じようにバインドされ、バインドされていないバクテリオファージは、表面上、水懸濁液中の細菌の増殖を抑制する。溶菌ファージをスフェロイドに変更されると、彼らは強力な溶解活性を保持し、高い細菌の捕獲能力を示しています。ファージとファージスフェロイドは、抗生物質耐性微生物のテストおよび滅菌のために利用することができる。他のアプリケーションは、バクテリオファージ療法および抗菌面での使用を含むことができる。

Introduction

黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株は、本質的な感染症や院内アウトブレイク^4-8の要因として示唆されている。このようなディスク拡散オキサシリン寒天スクリーンテスト、または微量液体希釈としてメチシリン耐性の認識の一般的な方法は、耐性の発現量を高めるために合わせた培養条件に依存している。変化は、成長培地に30または35でオキサシリン、インキュベーションの活用°Cではなく37℃以上、およびNaClのインクルージョンが含まれています。さらに、これらの種類の技法が正しい検出のため、24時間の代わりに16〜18時間の長い潜伏期間が必要である。メチシリン耐性を同定するための感度の適切な（> 96％）レベルの急速な技術は、バイテックGPS-SAカード、ラピッドATB黄色ブドウ球菌システム、及び3-11時間後に結果を生成する高速マイクロスキャンパネルシステムのような自動化された微量希釈法を含む^9-11。クリスタルMRSA IDシステムは、Sの成長の認識に基づいて迅速な方法である2％NaClおよび酸素感受性蛍光センサー付リットルあたりオキサシリン4mgの存在下での黄色ブドウ球菌 。 91から100パーセントの間で感度の範囲は、インキュベーション^12-14の4時間後に主張した。これらの表現型の方法は、異種の抵抗を発現普及している菌株の影響によりその精度が制限されている。したがって、メチシリン耐性の認識のための最高の広く受け入れられている方法はmecAの遺伝子¹⁵のPCRまたはDNAハイブリダイゼーションである。しかしこの手法は、精製されたDNAを必要とし、細胞の破片^16を含む様々な混和剤（不純物）に非常に敏感です。

さらに、これらの技術は実行するのに長い時間を必要とする。 mecAの遺伝子産物、蛋白質PBP 2aとの認識戦略は抵抗を決定するために利用することができ、標準試験法¹⁷に比べて信頼性があってもよい。

これは、以前のバクテリオファージ12600がメチシリン耐性^1,2,18を有するものを含む黄色ブドウ球菌株の認識プローブとして利用することができることが示された。本研究ではこのようなリアルタイムでMRSAのコンフォメーションと一緒に細菌の認識などのMRSAの特異的認識と検出における新規手法を提案した。この特定の目的のためのS.タンパク質に対するモノクローナル抗体と組み合わせたホストの広いスペクトル（MRSA株を含む）と黄色ブドウ球菌バクテリオファージは、（PBP 2a）が使用されている。 PBP 2aは、細胞壁タンパク質であり、それはMRSAの抗生物質抵抗性の原因である。しかしPBP 2aの抗体は、S.のために固有のものではありませんいくつかの他の細菌から黄色ブドウ球菌は、PBP 2A ^19,20に配列類似性と抗生物質結合タンパク質を持っている。そこで本研究では、S. PBP 2aの蛋白質に対する黄色ブドウ球菌バクテリオファージおよび抗体が使用されている。納入仕様にバイオセンサーを開発することができるようにする的に二段階のアクションが利用されていると、デバイスを検出し、MRSAを識別します。最初のステップは、Sを使用センサプローブとして球菌バクテリオファージ単層、2番目のステップはPBP 2A特異的な抗体を用いている。したがって、人はS.を認識し、手順黄色ブドウ球菌の細菌は、他の一人としての抗生物質結合タンパク質に敏感になります。二つのステップから受信された信号が正である場合には、MRSAの特異的検出を示す。

Protocol

1。ステージの設定

1. 型株S.を得る球菌 ATCC 12600、S.球菌 ATCC 27690及び枯草菌 ATCC 6051。 S.のメチシリン耐性株黄色ブドウ球菌 - MRSA1、MRSA 2、MRSA 5、MRSA 13、MRSA 26、MRSA 34、MRSA 45、B.炭疽スターン、 ネズミチフス菌 LT2、 赤痢菌、エルシニアenterocolotica、プロテウス·ミラビリス、肺炎桿菌 13882;溶菌ファージ12600。
2. PBP 2aは抗体共役ラテックスビーズを入手します。
3. ^21に記載され^ているようNZY培地を準備します。
4. 食塩水（PBS）をリン酸緩衝を得る。
5. ラングミュア·ブロジェット（LB）単分子層堆積のためのサブフェーズとして脱イオン水を準備します。

2。バクテリオファージの伝播と滴定

1. Sの一晩培養を5mlをインキュベート球菌 ATCC 12600ファージを500μl（3×10 ^{9 <}と（3.6×10 ⁸コロニー形成単位（CFU）/ ml）を/ 37℃で一晩振盪インキュベーターで2 Lフラック500ミリリットルNZY培地で）> PFU / mlの（商標）。
2. 4℃で10分のために4,424 xgで文化を遠心
3. 4℃で10分間、11,325×gで再遠心上清℃で
4. 0.22μmのミリポアフィルターを通してフィルター上澄み。
5. 1.5時間75395 xgでろ液を遠心分離します。
6. 蒸留水100μlのペレットを溶解する。
7. NZY培地でファージ懸濁液の10倍希釈液を調製する。
8. Sの（ON）一晩培養のプレート1ミリリットルすべての表面が覆われていることを確認するためNZY寒天と2プレートの各々の上に黄色ブドウ球菌 ATCC 12600を。文化の過剰を削除し、30分間、表面が乾燥してみましょう。
9. プレートの表面に適当なファージ希釈のサンプル（10μL）を発見し、18から24時間^{、37°C ​​の}でインキュベート。
10. プラークの形成を調べ、ファージ力価を計算します。バクテリオファージ力価（T）は、ウェブ数に基づいて推定されるファージサスペンションと希釈係数（F）10μlの体積（V）ごとに形成laques（N）。 。Tは= N /（VXF）たとえば、希釈10 ^-7でのプラーク数75と体積10μlの（10×10 ^-3 ml）のために、力価が75 /等しいです：力価は、次の式により算出した（10×10 ^{-3×10 -7）= 7.5×10} 10プラーク形成単位（PFU）あたりのmlの懸濁液。

3。ゴールド固定化ファージ

1. 10分間アルゴンのプラズマエッチングによってクリーンゴールドコーティングされた水晶片（60ミリメートル^2）した後、滅菌キャビネットにUV光の下で6時間殺菌する。
2. 滅菌シャーレ内の各部分の金表面に1×10 ⁹ PFU / mlのファージ懸濁液の50マイクロリットルを追加し、室温で湿潤チャンバー内で一晩インキュベートする。
3. 残りファージ懸濁液を取り出して、滴定。
4. アンバウンドを除去するためにPBSで結合したファージと片5回洗浄ファージ。

4。乾燥した表面上に固定化されたファージ感染のテスト

1. NZY寒天プレート上にS。球菌 ATCC 12600のO / N文化を広げ、乾燥させることができます。
2. 板面上に固定化したファージとゴールドピースを下に置きます。
3. 感染性を示している℃で37℃で12時間インキュベートした後溶解のゾーンを守ってください。
4. 対照実験のないファージを金覆わ片を使用してください。

5。液体中の遊離と結合したファージの溶解活性のテスト

1. S.のON文化を追加4 300ミリリットルサイドアームフラスコ（各フラスコに6×10 ⁶ CFU / ml）を毎におけるNZYのブドウ球菌 ATCC 12600〜10ミリリットル。
2. 2フラスコ2×10 ⁶ PFU /遊離ファージmlのアドイン。
3. コントロールとして他の二つのフラスコを使用してください。
4. S.の経時変化を監視するすべてのフラスコを30分間隔で光学密度測定（OD _600）により、570分間球菌細胞溶解。
5. 24時間での最終的な測定を行います。
6. 手順5.1から5.5を繰り返しますが、コントロールフラスコのないファージを金結合したファージの代わりに自由にファージと片、金の部分を使用しています。

6。インキュベーション中に結合したファージの損失

1. 室温で一晩湿気のチャンバー内に配置されたペトリ皿中の滅菌金片の表面に1×10 ⁹ PFU / mlのファージ50μlのを追加します。
2. 金表面と力価から非結合ファージとサスペンションを取り外します。
3. 8時間37℃で5 PBSで倍と場所シェーカー·インキュベーター、15 mlチューブに、1mlのNZY溶液中の結合したファージとの金の部分を洗う。
4. 2で説明したように切 ​​り離されたファージの力価を決定します。

7。ファージスフェロイドの準備

1. 1ミリリットルバイアルで分光等級のクロロホルム等量と在庫ファージ12600懸濁液400μlの（10 ¹¹ PFU / ml）を組み合わせる室温で加えた。
2. 優しくボルテックス1分持続オーバーファージ - クロロホルムサスペンション5-6回（5秒間隔）。
3. 懸濁液を30秒間安定化させ、次いでスフェロイドを含む上相をピペットで単層の準備のためにオフにピペッティングした。
4. 伝送および走査型電子顕微鏡用スフェロイドサスペンション数マイクロリットルを取る。
5. バイオセンサー製造の残りの回転楕円体サスペンションを使用してください。

8。バイオセンサーの準備

1. 10分PDC-32G Harrickプラズマクリーナー、アルゴンのプラズマエッチングによってクリーンQCM-Dセンサー。
2. 任意の有機不純物を除去するためにヘキサンでセンサーを洗浄します。
3. ²²で説明したように、フィルムバランスのトラフを準備し、清掃してください。
4. 副相溶液とLBトラフを記入し、20℃±0.1℃をトラフ障壁とそれをきれいにし、トラフを安定
5. 水性suspensiにおけるファージ12600300μlのアリコートを広げLBサブフェーズへ（10 ¹¹ PFU / ml）を上に。
6. 部分的に副相^22,23に浸漬する傾斜水和ガラス棒を下に実行するためにファージ12600水性懸濁液（10 ¹¹ PFU / ml）を300μlのアリコートを可能にすることにより、LBサブフェーズ·ソリューションにファージ単層を準備します。
7. 10分間準備された単層を安定化した後、定圧19 N / mのが達成されるまで30 50mm /分（44 cm ²で/分）の速度でそれを圧縮する。
8. 連続して単層のうちに7回センサーを浸漬することにより4.5ミリメートル/分の速度で垂直に配置QCM-Dセンサに垂直成膜を実行します。細菌試料への曝露の前に堆積ファージ単層の電子顕微鏡は、層が均質で連続であることを示し、均一（データは示さず）。
9. 繰り返し3で調製されたファージ回転楕円体懸濁液を用いて4.5から4.8を繰り返します。
10. MRSA検出、電子のために製造されたファージのバイオセンサーを使用して、顕微鏡、およびエリプソメトリ。

9。バイオセンサーテスト、メチシリン耐性および感受性黄色細菌の識別

1. このプロトコルでは、未変性および変性ファージとファージスフェロイドを有するバイオセンサが用意されている。 4つのセンサ流室を有する水晶振動子マイクロバランスがQCMセンサー表面に固定化ファージを細菌の結合を監視するために使用される。 PBP 2aは抗体共役ラテックスビーズは、メチシリン耐性（MRSA）および感受性黄色ブドウ菌を区別するために利用される。すべての測定は5 MHzでフローモード（50μL/分）で行われる。
2. 水中でQCMセンサ（〜30分）のベースラインの共振周波数を確立する。
3. テストセルを通る水でのライブメチシリン感受性黄色細菌細胞（10 ⁹ CFU / ml）の懸濁液を描画します。
4. 連続的に第一の倍音、USIのためのセンサの共振周波数とエネルギー散逸の変化を監視ngのQ-ソフトソフトウェア。
5. センサの共振周波数及び損失の変化が飽和レベルに達したときに、周波数及び損失の連続監視中に流れるようにPBP抗体共役ラテックスビーズの懸濁液（6.77×10 ¹⁰粒子/ ml）を加える。
6. 繰り返しメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の細菌細胞（MRSA）が9.2から9.5を繰り返します。
7. Cは質量感度が一定である（5 MHzでC = 17.7 ngのX cm ^-2のX Hzで^-1 Sauerbrey方程式^24,25 量Δf=-ΔmをXN / C、による結合細菌に起因する質量変化を通じて、周波数変化を定義）、mは質量であり、nは倍音の数（n = 1）である。
8. 記録からのエネルギー散逸変化（ΔD）を定義する振動の指数関数的減衰（周波数および振幅は振動の一周期の間に消費されると、蓄積されたエネルギーの定量化を可能にする、減衰、それぞれ、Eは _散逸し、Eが _{格納されている} ：ΔD = E _消散 / 2πEを _格納 。 ΔDは放熱ユニット（DU）は1 DU = 10 ^-6相対単位）で測定される。

Results

ファージは、Sのすべてのテストされた株に対して溶菌活性を示しとしてファージスポット試験によって示さMRSA株、 黄色ブドウ球菌を含む、。プラークサイズは、通常5〜15 mmの範囲であった。活動は、他の試験培養物（ 表1）に対して、見つかりませんでした。

S.の正常な成長球菌 ATCC 12600は37℃シェーカー·インキュベーターでNZY培地で°Cは、 図1A（白丸でラベル曲線）で示されている。細菌の数が×10 ⁸ CFU / mlの。 図1A（黒丸によってラベル曲線が）同時にで追加された2.0×10 ⁶ PFU / mlの無料ファージの共培養の結果を示している4.0から3.2×10 ⁶から増加S.同じ濃度球菌 ATCC 12600。金表面上に固定化されたファージは、懸濁液中のファージの活動（

Discussion

それはよくファージを細菌性病原体²⁸バイオセンサープローブとして使用できることが知られている。急速な差別抗生物質耐性および感受性株：これは、PBP 2aの抗体と一緒にファージは、古い問題を解決するために利用できることは、この研究で実証されている。

しかしながら、それらの正常な未変性ブドウ球菌ファージは、彼らが細菌に結合するにもかかわらず、QCM装置​​との細菌検出には適していないが判明した。ファージ尾部は、音響波がファージ尾の末端に結合したバクテリアを "到達"ことができないほど長い。この状態は、（ 図3Aおよび図3B）EM画像によって示された"欠けているマス"効果²⁹と有意な結合にもかかわらず、共振周波数と放熱変更を登録することができないことをもたらした。この問題は簡単にスフェロイドと無傷ファージ、クロロホルム - 水処理によって変更されたファージを交換することで解決しました。この治療法は、完全に機能するPをもたらし、短く太く、非柔軟尾（ 図2E ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
分光光度クロロホルム	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	株式会社電化製研株式会社, 東京, 日本	MRSA-Screenテスト
S. aureus ATCC 12600、S. aureusATCC 27690およびBacillus subtilis ATCC 6051 アメリカン	タイプカルチャーコレクション(バージニア州マナッサス)から。
MRSA1、MRSA 2、MRSA 5、MRSA 13、MRSA 26、MRSA 34、MRSA 45、B. anthracis Sterne、サルモネラチフス菌LT2、Shigella flexneri、Yersinia enterocolotica、Proteus mirabilis、Klebsiella pneumoniae 13882;溶解性ファージ12600	オーバーン大学、オーバーン、アラバマ
遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマL-90K 超遠心分離機
KSV 2200 LBフィルムバランス	KSVケミカルズ、フィンランド
光学顕微鏡光学系	CitoViva Technology Inc.、オーバーン、AL
QCM-D	Q-Sense AB、VäストラFrölunda, Sweden	E4
走査型電子顕微鏡 (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
送信電子顕微鏡 (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	寸法(mm), 245 x 245 x 25
ピペット	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	フィッシャーブランド、米国	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company、ME	SG403
培養成長フラスコ	Corning Incorporated、NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer フラスコ
光学分光計	Genesys 20.サーモスペクトロニック、米国。	4001
プラズマクリーナー	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools