原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

サマリー

本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。

要約

細胞外マトリックス（ECM）の機械的性質は、幹細胞の分化、腫瘍形成、および創傷治癒を含む多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。細胞とECMの剛性の変化は、多くの場合、細胞生理学や組織における疾患の変化の兆しである。したがって、セル剛性が細胞培養の状態を評価するための指標である。細胞および組織の剛性を測定するために適用された多数の方法のうち、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて微小窪みを確実生きた細胞の剛性を測定する方法を提供する。この方法は、広く金属表面から生体軟組織および細胞に至るまで、様々な材料のためのマイクロスケールの剛性を特徴付けるために適用されている。この方式の基本原理は、選択された幾何学的形状のAFMチップで細胞をインデントAFMカンチレバーの曲げから受ける力を測定することである。ヘルツモードに力インデント曲線をフィッティング対応するチップジオメトリのlは材料剛性の定量的測定を与えることができます。本論文では、AFMを用いた生細胞の剛性を特徴づけるための手順を示しています。 MATLABルーチンを使用してAFM校正、フォースカーブ取得のプロセス、およびデータ分析などの重要な手順が示されている。このメソッドの制限事項についても説明します。

概要

個々のセルとその周囲の細胞外マトリックスの機械的特性、特に剛性、（ECM）は、細胞増殖、運動性、分裂、分化、および組織の恒常性を含む多くの生物学的プロセスのために重要である^。1これは、細胞機械的剛性は、主によって決定されることが実証されているアクチンと中間径フィラメントのインビトロでのネットワーク内で機械的試験から細胞骨格、アクチンと中間径フィラメントとそれらに関連付けられている他のタンパク質の特にネットワーク^。2の結果は、セル力学における細胞骨格構造とプレストレスに大きく依存していることを示唆している細胞骨格は。生細胞の^3-5剛性は、その後細胞骨格構造^6、ミオシン活動^7を評価する指標や他の多くの細胞プロセスとみなされている。さらに重要なことは、細胞機械的特性の変化は、しばしば密接associであることが判明している。生細胞の機械的剛性、したがって細胞生理学を監視するための新規な方法を提供することができる^8-10監視などの腫瘍の形成および転移などの様々な疾患状態にated;疾患^8を検出し、診断、および薬物治療の有効性を評価する^{11。 、12}

粒子トラッキングマイクロレオロジー^、13-16磁気ねじれサイトメトリー^、17マイクロ....

プロトコル

1。カンチレバーのバネ定数キャリブレーション

1. 製造元の指示に従って、AFMにカンチレバーをロードします。これは、任意の実験の前にエタノールでカンチレバーホルダーをきれいにすることが必要である。これはAFM測定中文化への細菌汚染を制限するのに役立ちます。
2. InvOLS（逆光てこ感度）を校正します。このパラメータは、カンチレバーのたわみのナノメートルあたりのフォトダイオードの応答（ボルト）の量を示しています。
3. 試料ステージの上に清浄なガラススライドをロードし、製造元の指示に従ってAFMヘッドを取り付け、レーザビームと配置を調整。スライドガラス上のAFMチップを従事。
4. 撤回ピエゾで、-2のフォトダイオードの読み取りにミラーを再調整V. +2のトリガーポイント（最大ダイオード応答）と力分光測定を行いV.
5. ピエゾは撤回で、-2のフォトダイオードの読み取りにミラーを再調整V. FOを実行+2 V. 注のトリガーポイント（最大ダイオード応答）とRCE分光測定：ここに電圧値はアサイラムAFMに固有のものです。この値は、製造業者によって提供された仕様に従って設定されるべきである。
   データ収集後、フォースカーブをしっかり接触領域に、ズーム完了です。 V / NMになり斜面を見つけるために、この地域への線形フィットを実行します。この値の逆数がカンチレバーフォトダイオードアンサンブルの光感度を示しています。

結果

図2aは、それぞれプラスチック表面、ヤング率3,000 Paないし17,000 Paでのポリアクリルアミドゲル上で培養した3T3線維芽細胞から採取した3つの代表的な力曲線を示す。注意深く曲線における接点を識別した後、細胞変形の関数としてのインデント力が図2bにプロットされている。 0.3 nNの、3 kPaのポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞にピラミッド形状の先端インデント3マイクロメートルより小さい大きさの力の下で。これとは対照的に、力以上1.6 nNのは、同じチップを使って、プレーン培養皿上に成長したセルに500ナノメートルをインデントするために必要です。それは柔らかいポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞は、硬い培養皿で培養した細胞よりも軟質であることがこのグラフから明らかである。ヘルツモデルに力-δ曲線の最初のセグメント（δ<30 nm）を当てはめると、それぞれ、10 kPaで、1.2 kPaの、そして1.10 kPaのように、これらの3つの細胞のヤング率を与えます。 cultur上の細胞電子料理はポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞の100倍剛性.......

ディスカッション

AFMインデンテーション法は、生きた細胞の機械的特性を特徴付けるための利点を有する。ピコニュートンレベル³²で力を測定することが可能な磁気ねじれサイトメトリーおよび光ピンセット、より敏感とはいえ、AFMは、その力の範囲に匹敵する、ピコニュートンの数十から数ナノニュートンの数百に及ぶサンプルから抵抗力を検出することができますマイクロピペット^を用いて細胞¹⁹に適用することができる。この力の範囲は、セル¹⁹のすべてのタイプの測定可能な変形を作成するためのニーズに合った。高い空間分解能により、サブミクロンレベルで³³組織中の単一の細胞内で不均質を特徴付けることができる。それはまた、リアルタイムの生細胞の測定を可能にする。生物学的サンプル用に設計されたいくつかのAFMモデルは、流体環境で動作することができ、精密な温度制御を提供する加熱された試料ステージが装備されている、ことができる生理学的環境を維持すること測定中の細胞を生きたために境。 AFMのインデントが正常細胞型^、25,34-36範囲の機械的性質を測定するため.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
原子間力顕微鏡	Asylum Research	MFP3D-BIO