原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

サマリー

本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。

要約

細胞外マトリックス（ECM）の機械的性質は、幹細胞の分化、腫瘍形成、および創傷治癒を含む多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。細胞とECMの剛性の変化は、多くの場合、細胞生理学や組織における疾患の変化の兆しである。したがって、セル剛性が細胞培養の状態を評価するための指標である。細胞および組織の剛性を測定するために適用された多数の方法のうち、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて微小窪みを確実生きた細胞の剛性を測定する方法を提供する。この方法は、広く金属表面から生体軟組織および細胞に至るまで、様々な材料のためのマイクロスケールの剛性を特徴付けるために適用されている。この方式の基本原理は、選択された幾何学的形状のAFMチップで細胞をインデントAFMカンチレバーの曲げから受ける力を測定することである。ヘルツモードに力インデント曲線をフィッティング対応するチップジオメトリのlは材料剛性の定量的測定を与えることができます。本論文では、AFMを用いた生細胞の剛性を特徴づけるための手順を示しています。 MATLABルーチンを使用してAFM校正、フォースカーブ取得のプロセス、およびデータ分析などの重要な手順が示されている。このメソッドの制限事項についても説明します。

概要

個々のセルとその周囲の細胞外マトリックスの機械的特性、特に剛性、（ECM）は、細胞増殖、運動性、分裂、分化、および組織の恒常性を含む多くの生物学的プロセスのために重要である^。1これは、細胞機械的剛性は、主によって決定されることが実証されているアクチンと中間径フィラメントのインビトロでのネットワーク内で機械的試験から細胞骨格、アクチンと中間径フィラメントとそれらに関連付けられている他のタンパク質の特にネットワーク^。2の結果は、セル力学における細胞骨格構造とプレストレスに大きく依存していることを示唆している細胞骨格は。生細胞の^3-5剛性は、その後細胞骨格構造^6、ミオシン活動^7を評価する指標や他の多くの細胞プロセスとみなされている。さらに重要なことは、細胞機械的特性の変化は、しばしば密接associであることが判明している。生細胞の機械的剛性、したがって細胞生理学を監視するための新規な方法を提供することができる^8-10監視などの腫瘍の形成および転移などの様々な疾患状態にated;疾患^8を検出し、診断、および薬物治療の有効性を評価する^{11。 、12}

粒子トラッキングマイクロレオロジー^、13-16磁気ねじれサイトメトリー^、17マイクロピペット吸引^18,19とmicroindentation ^20-22を含む複数の方法は、細胞の弾性を測定するために開発されてきた。粒子追跡のマイクロレオロジー、細胞骨格の内部細胞や基準マーカーに注入されたサブミクロン蛍光粒子のどちらかの熱振動をトレースします。細胞の²³弾性と粘性特性が変動-散逸定理を用いて測定された粒子の変位から計算されます^。14,23この方法により、地元の同時測定細胞内のさまざまな場所での高空間分解能での機械的特性。しかしながら、細胞に蛍光体粒子を注入して、細胞機能の変化、細胞骨格構造、ひいてはセル力学につながる可能性がある。マイクロピペット吸引法は、ピペット内に細胞膜の小片を吸引する1〜5μmの範囲の直径のマイクロピペットに負圧を印加する。セル剛性が印加された負圧と細胞膜の変形から計算される^。18は 、この方法は、しかしながら、セル全体の剛性の不均一な分布を検出することができない。磁気ねじれサイトメトリー（MTC）は、細胞膜に付着超常磁性ビーズ上にトルクを発生させる磁界を印加する^。17セルの剛性が加えられたトルクと細胞膜のねじり変形との関係から、この方法で導出される。これは、MTC法における磁気ビーズの位置を制御することは困難であり、またchallengiある高解像度のねじれ変形を特徴付けるためにNG。 Microindentationは、細胞内にパンチするために、明確に定義されたジオメトリーと圧子を適用します。インデント力と細胞内の結果インデントはしばしばヘルツモデルの予測に従ってください。細胞のヤング率は、ヘルツモデルにそれらを適合させることによって力 - 押込み曲線から算出することができる。この方法は、広くそのような接触点決定における不確実性、ヘルツモデルの適用可能性、および物理的に細胞を損傷する可能性として、その限界にもかかわらず、細胞組織の機械的特性をテストするために適用されている。 microindentaion ²⁰のための多くのデバイス間で、原子間力顕微鏡（AFM）で市販されており、広く生体細胞および組織^21,24-27の機械的性質を特徴付けるために適用されている。

本論文では、細胞の仕組みを特徴づけるためにアサイラムMFP3DバイオAFMを用いた手順を示しています。 AFMではないでLYは、細胞の高解像度のトポグラフィを提供するだけでなく、広く組織細胞の機械的特性を特徴付けるために適用されている。 AFMのインデントの原理は図1に示されている。 AFMカンチレバーは、上記数マイクロメートルからセルに近づく、カンチレバーの偏向は、予め選択された設定点に到達するように、インデントセルと、前記セルから引き離さ細胞と接触する。 図1に示すように、このプロセスの間、カンチレバーのたわみは、その位置の関数として記録される。セルとの接触を行う前に、カンチレバーは明らかなたわみを含まない培地に移動。細胞、カンチレバーの曲がりや偏向信号が増加するときにインデント。カンチレバーの偏向は、そのセルに適用される力に比例するように、弾性梁としてモデル化される。最大カンチレバーのたわみを設定することにより、試料に加えられた力の最大の大きさをdを避けるために制限される細胞へamage。細胞内への先端インデント図1のCは、ポイントツーポイントBからの力曲線の一部が細胞剛性を抽出するヘルツモデルにフィットされています。

図1。 AFMのmicroindentationと力曲線の解釈のイラスト。トップパネルには、ピエゾスキャナーによって駆動AFMカンチレバーの動きを示しています。カンチレバーzおよびカンチレバーたわみ信号dの垂直位置は、プロセス中に記録されています。カンチレバーは、セルの上に数マイクロメートルの点から始まる。セルに近づくつつ、先端が細胞に接触したb点に達するまで、試料押込みδはゼロのままである。プロット中のb点の座標が臨界値であるデータ解析のために、（zは_0、dは_0>）で表される。 BからCへ、カンチレバーインデント細胞へのカンチレバーの偏向は、標的最大インデント力と片持ちバネ定数との比に設定される設定点に達するまで。偏向信号が予め設定された最大値に達すると、カンチレバーは、次いで、細胞からことが多いチップと試料の付着による下方に引っ張られるd点に引き出さセルを返しから電子におけるその最初の位置に切り離される。右側のパネルには、インデントや録画ZとD信号との関係を示しています。左下のパネル上で最大の力はインデントに印加されるように17ナノメートルに設定されているバネ定数が0.07N / mであることが測定されたそのうちの代表的なフォースカーブ、カンチレバーの最大押込み、プロットしたものであるサンプルは1.2 nNのです。インデント時にキー位置がマークされています。

プロトコル

1。カンチレバーのバネ定数キャリブレーション

1. 製造元の指示に従って、AFMにカンチレバーをロードします。これは、任意の実験の前にエタノールでカンチレバーホルダーをきれいにすることが必要である。これはAFM測定中文化への細菌汚染を制限するのに役立ちます。
2. InvOLS（逆光てこ感度）を校正します。このパラメータは、カンチレバーのたわみのナノメートルあたりのフォトダイオードの応答（ボルト）の量を示しています。
3. 試料ステージの上に清浄なガラススライドをロードし、製造元の指示に従ってAFMヘッドを取り付け、レーザビームと配置を調整。スライドガラス上のAFMチップを従事。
4. 撤回ピエゾで、-2のフォトダイオードの読み取りにミラーを再調整V. +2のトリガーポイント（最大ダイオード応答）と力分光測定を行いV.
5. ピエゾは撤回で、-2のフォトダイオードの読み取りにミラーを再調整V. FOを実行+2 V. 注のトリガーポイント（最大ダイオード応答）とRCE分光測定：ここに電圧値はアサイラムAFMに固有のものです。この値は、製造業者によって提供された仕様に従って設定されるべきである。
   データ収集後、フォースカーブをしっかり接触領域に、ズーム完了です。 V / NMになり斜面を見つけるために、この地域への線形フィットを実行します。この値の逆数がカンチレバーフォトダイオードアンサンブルの光感度を示しています。
6. 0の自由たわみにミラー位置合わせをリセットV.
7. カンチレバーのバネ定数を校正します。熱調整方法は、カンチレバー²⁸のバネ定数を決定するために使用される。
8. InvOLSを校正した後、チップと試料の間には相互作用がないことを、サンプル段階からスキャナを離れて上げる。
9. 温度データのキャプチャを開始。このプロセス中に、片持ち梁の熱振動がrecordeであるD。 AFMソフトウェアは、熱振動をプロットしてデータ·ウィンドウ内のパワースペクトルを解析する。
10. データ収集の数秒後に、ばね定数を決定するために、最も低い周波数（基本共鳴）のピークを中心とするデータ·セグメントへのフィットを行う。

2。サンプルのロード

1. すでに装備されていない場合には、AFMの舞台でディッシュヒーター付属品を取り付けます。
2. 37℃に温度を設定し、安定した熱平衡に達するまでのシステムのための20分間待ちます。
3. AFMステージ上に培養皿を置き、皿ヒーターに付属のクランプを使って固定します。インキュベーターから皿の除去までの時間を最小化し、ステージ上に置き、細胞への外傷を回避するためにすることが重要である。 30分より長い測定のために、CO ₂の独立した媒体は、通常の培養培地を置き換えるために使用されるべきである。
4. トンの先端まで37°C培地の小滴を適用彼AFMカンチレバーと先端が単に、液体に浸漬されるまで、AFMヘッドを下げる。
5. トップビューのCCDカメラを使用して、カンチレバー（液体のアライメントが原因で媒質の屈折率の変化により、空気中よりも異なるものになります）にレーザビームを再調整してください。
6. 培養皿のクリーンエリアにAFMチップを掛けて。
7. 上記のような液体環境におけるカンチレバー感度、InvOLSのキャリブレーションを実行します。

注：細胞はヒドロゲル上で培養された場合）、InvOLSのキャリブレーションを細胞培養培地を充填した培養皿の底面に対して事前に行うべきである。細胞サンプルに切り替えるときは、特別な注意は、カンチレバーにレーザービームアライメントを変更しないために支払わなければならない。 b）は、InvOLSは、レーザ配向変化があるたびに再較正されなければならない。 c）のそれはまた、いくつかの検量線、sから値の平均としてInvOLSを取ることをお勧めします各キャリブレーションが異なるInvOLSを生成インス、。 InvOLSのばらつきが平均値と比較して、しかしながら、小さい。例えば、100倍0.06 N液体中/ mのバネ定数をブルカーDNP-10カンチレバーを較正することのみが0.5nm /標準偏差は、66.3ナノメートル/ Vの平均InvOLS値を生成V.

3。セルインデントのフォースカーブの収集

1. インデントのためのセルを選択します。光学顕微鏡を用いて、先端が周囲核領域内に位置するようにセルの上にカンチレバーを配置するために、ステージを移動します。カンチレバー位置の正確な調整がXとYスキャナにオフセットを適用することによって達成することができる。
   注：AFMカンチレバーは、ターゲットセルを選択するために試料ステージを移動させながら試料表面から引き出さなければならない。試料表面が平坦でないかもしれないので、これは、試料中にノッキングからカンチレバーを保護する。
2. 分光モードを強制的に切り替えます。インデントを設定する流体力学的効果を回避するのに十分低い1-10ミクロン/秒の範囲内で評価する。
3. 細胞への損傷を避けるために最大の力を制限するインデント偏向トリガ·ポイントを設定する。偏向信号の任意のドリフトを修正します相対トリガオプションを選択します。 2 nNの最大の力は、ほとんどのサンプルのための良い出発点です。この値は、しかしながら、試料の剛性に応じて調整されるべきである。ソフトサンプルについて低い値は、試料に過度のインデントを回避するために使用されるべきである。硬いサンプルについて高い値が測定可能なインデントを生成するために使用されるべきである。
4. 先端が完全に力の測定値との間のセルから離脱されることを保証するのに十分な大きさの力の距離を設定する。通常、力距離は5μmとに設定されている。
5. 単一の力曲線を取るAFMを指揮。
6. 各セルの周囲の核地域の別の場所で少なくとも三つの力曲線を収集します。それは複数取ることは有益であるが、信頼性のある統計データについては、各セル上の曲線は、あまりにも多くの力曲線を取ることはAFMプローブからのストレスによる細胞剛性の変化につながることができます。
7. データ収集が完了したら、先端を撤回し、一定のサンプル条件で細胞剛性に優れた統計データの必要に応じて、できるだけ多くの細胞のためのステップ3.1から3.6を繰り返します。通常は、30細胞は各条件で測定されます。

単一セル内の剛性の分布を特徴付けるために、力マップモードが適用される。フォースマップモードでは、関心領域を含むように、スキャンサイズを設定し、適切な解像度を設定し、単一のフォースカーブのために選択された、インデントパラメータを設定し、AFMは、定義された試料領域にわたってラスターされ、シングルフォースカーブを取る試料領域内の各画素における。

4。データ解析

記録されたフォースカーブは、細胞剛性を計算するために、カスタムMATLABプロシージャを使用して分析される。以下は、MATLABの手順について簡単に説明します。

1. 。MATLABプログラムは、接触点がLin らにより公開された方法から採用されたアルゴリズム^29を用いて（ 図1参照）z0をd0に座標を識別する。
2. 力曲線の各データポイントのために、興味のある点、右（接触の最初のポイントとして選択したポイントを使用）ヘルツモデルフィットの左へのデータの線形近似を行い、設定するには最大インデント（200-300 nmのを推奨）。
3. 各ポイントには、両方の発作の相対RMS誤差を計算し、これらの値を合計します。
4. 最小合計フィッティング誤差を達成する点は、接触開始点として選択される。
   注：計算時間ではなく直線的に全体の力曲線を走査するより黄金分割探索を実施することによって低減することができる。
5. サンプル変形δとインデント力Fは次のように計算されています：
   
6. 最小二乗フィッティングをFに適合するように適用される対ポスト接触領域におけるδデータ、zのヘルツモデルへ≥zは _0、ヤング率、セルのEを抽出するには：
   
   ここで、vはポアソン比である。
   注：δは試料の厚さ（セルの高さ）の10％以上であると、測定されたセルの剛性は、基板剛性に影響される。核周囲領域の厚さは通常、数マイクロメートルのオーダーである。したがって、F-δ曲線の最初の200-300 nmのはヘルツモデルにフィットされています。

結果

図2aは、それぞれプラスチック表面、ヤング率3,000 Paないし17,000 Paでのポリアクリルアミドゲル上で培養した3T3線維芽細胞から採取した3つの代表的な力曲線を示す。注意深く曲線における接点を識別した後、細胞変形の関数としてのインデント力が図2bにプロットされている。 0.3 nNの、3 kPaのポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞にピラミッド形状の先端インデント3マイクロメートルより小さい大きさの力の下で。これとは対照的に、力以上1.6 nNのは、同じチップを使って、プレーン培養皿上に成長したセルに500ナノメートルをインデントするために必要です。それは柔らかいポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞は、硬い培養皿で培養した細胞よりも軟質であることがこのグラフから明らかである。ヘルツモデルに力-δ曲線の最初のセグメント（δ<30 nm）を当てはめると、それぞれ、10 kPaで、1.2 kPaの、そして1.10 kPaのように、これらの3つの細胞のヤング率を与えます。 cultur上の細胞電子料理はポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞の100倍剛性...

ディスカッション

AFMインデンテーション法は、生きた細胞の機械的特性を特徴付けるための利点を有する。ピコニュートンレベル³²で力を測定することが可能な磁気ねじれサイトメトリーおよび光ピンセット、より敏感とはいえ、AFMは、その力の範囲に匹敵する、ピコニュートンの数十から数ナノニュートンの数百に及ぶサンプルから抵抗力を検出することができますマイクロピペット^を用いて細胞¹⁹に適用することができる。この力の範囲は、セル¹⁹のすべてのタイプの測定可能な変形を作成するためのニーズに合った。高い空間分解能により、サブミクロンレベルで³³組織中の単一の細胞内で不均質を特徴付けることができる。それはまた、リアルタイムの生細胞の測定を可能にする。生物学的サンプル用に設計されたいくつかのAFMモデルは、流体環境で動作することができ、精密な温度制御を提供する加熱された試料ステージが装備されている、ことができる生理学的環境を維持すること測定中の細胞を生きたために境。 AFMのインデントが正常細胞型^、25,34-36範囲の機械的性質を測定するため...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
原子間力顕微鏡	Asylum Research	MFP3D-BIO