蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

サマリー

生体顕微鏡は、生きた動物の様々な生物学的プロセスを画像化可能にする強力なツールです。この記事では、生きたマウスの唾液腺では、このような分泌顆粒として細胞内構造のダイナミクスを画像化するための具体的な方法を提示する。

要約

ここでは、共焦点生体顕微鏡を使用することに基づいているライブげっ歯類における画像細胞内構造に手順を説明します。彼らはいくつかの利点を提供するため、モデル機関として、我々は、生きたマウスの唾液腺を使用しています。第一に、それらは容易に光学素子へのアクセスを可能にするために露出し、心拍及び呼吸によるモーションアーチファクトの低減を促進するために安定させることができる。これは大幅に画像化し、小さな細胞内構造を追跡を容易にします。第二に、唾液腺の細胞集団の大部分は、器官の表面からアクセス可能である。これは、二光子顕微鏡などのインビボイメージングのために使用されている他の技術よりも高い空間分解能を有する共焦点顕微鏡の使用を可能にする。最後に、唾液腺、容易にこのようにして分子レベルでの生物学的プロセスを調査する堅牢なシステムを提供し、薬理学的および遺伝的に操作することができる。

本研究では、腺房細胞内の分泌顆粒のエキソサイトーシスおよび分泌顆粒は、β-アドレナリン受容体の刺激により融合頂端細胞膜のダイナミクスの動態に従うように設計されたプロトコルに焦点を当てています。具体的には、細胞質ゾル、GFP蛍光タンパク質タンデムトマトと融合した膜を標的とするペプチドを共発現するトランスジェニックマウスを使用していました。しかし、我々は唾液腺を安定させ、画像に使用する手順は、他のマウスモデルに拡張し、そのようなエンドソーム、リソソーム、ミトコンドリアなどの様々な細胞内構造の可視化を可能にする、in vivoでの細胞成分を標識する他のアプローチに結合することができ、アクチン細胞骨格。

概要

過去20年間で、ライブ顕微鏡の出現と蛍光タンパク質の使用は、細胞生物¹の我々の理解を進め、ありとあらゆる細胞プロセスに大きなブレークスルーにつながっている。このフィールドには、それは実験操作に来る場合は特に、非常に強力なモデル系である哺乳動物細胞培養の使用から途方も恩恵を受けている。しかし、彼らはしばしば、複雑な多細胞生物²の生物学の真の表現を提供していません。この問題は、このような神経生物学、免疫学、腫瘍生物学の³などの分野で重要な生物学的な質問を調査への扉を開いた生体顕微鏡（IVM）の開発によって対処され始めている。今のところ、IVMに基づいて、研究のほとんどは、細胞内区画の動力学に関する情報を提供せずに、組織および個々の細胞のレベルで行われている。最近では、我々の研究室や他のsは^、生きたげっ歯類^4-7に^13〜15細胞内構造を画像化およびインビボでの薬理学的および遺伝的操作を可能にすることができるIVM技術を開発した。このアプローチは、 インビボで膜輸送を研究し、より具体的には、エンドサイトーシスおよび調節性エキソサイトーシス^6,7するために我々が使用されている。

我々の実験モデルシステムは、麻酔をかけたげっ歯類の顎下唾液腺（SGSに）安定化とイメージング、露光に基づいています。 IVMのモデル器官としてのSGの選択は、腺小手術を行うことで、容易にアクセス可能であるという事実に起因して、その生理機能を損なうことなく外部化、ハートビートと呼吸によるモーションアーチファクトを低減するために安定させることができる。また、SGsアソシエイトを選択的に唾液管^8,9を介して、ウイルスまたは非ウイルスベースのベクターのいずれかを注入することにより、遺伝的に操作することができる。最後に、SGSは偏epithで構成される外分泌腺である腺房や導管、筋上皮細胞、間質細胞の複雑な集団を形成elial細胞。このため、彼らは我々の最近の研究¹⁰で強調されているように、エキソサイトーシス、エンドサイトーシス、遺伝子送達、およびアクチン細胞骨格を研究し、そのような細胞極性、細胞分裂、細胞などの細胞生物学の側面を研究する機会を提供するための優れたモデルである細胞間結合、およびイオンチャネル。

本論文では詳細に生きたマウスののSGの上皮で細胞内分解能を達成するための撮影プロトコルを記述します。具体的には、どのように画像を調整されたエキソサイトーシスの間のSGの腺房細胞内の分泌顆粒をするには、show。以前に示されているように、β-アドレナリン受容体のアゴニストで刺激すると、分泌顆粒は、頂端形質膜と融合し、徐々に崩壊し、腺房細管⁶にその内容を解放する。私たちの目標は、Mと研究者に基本的なツールを提供することです外科的処置の動物取り扱いのinimal経験、それらが正常に細胞内解像度でIVMを実行できるようにします。 IVMの中で最も困難な部分が動物の製造であるので、ここでは、その機能を損なうことなく、SGSに公開し、固定化するために利用されている基本的な手術手順の説明に重点を置いています。全身性蛍光プローブの送達は、トランスジェニック動物の使用、または両方の組み合わせとして細胞内構造、いくつかの戦略を標識するための手順としては、他の箇所に記載されている^7,11。

プロトコル

パート1：顕微鏡とイメージングのセットアップの準備

1. 任意の倒立型共焦点顕微鏡は、IVMのために適していなければならない。この研究においてFLUOVIEW-1000レーザー走査共焦点ユニットを備えたOlympus IX81倒立顕微鏡を用いた。可能な限り最高の分解能を達成するために、このような水浸UPLSAPO 60x/1.20 Na及び油浸プラン-アポ60x/1.42 NAの高NA対物レンズの使用は、推奨されます。油浸対物レンズは、高い捕集効率を有し、それらが組織と対物との間のカバースリップの使用を必要としているが、それらは、表面から15〜150μmに画像領域に使用されるより良好な画像品質を提供する。さらに、油の使用は、長いイメージングセッション中に水の蒸発の懸念を排除します。温度および湿度を維持するために、顕微鏡は完全に封入されるべきであり、暖かい、加湿空気が供給される。あるいは、動物、顕微鏡ステージ、及び目的は、他の手段によって温められている必要があります。例えば、化学熱パッドは動物およびステージのために使用することができ、特別に設計された対物レンズは、対物ヒータ（ 図1A）のために使用することができる。客観的なヒーターは、手順を開始する前に、30分に切り替える必要があります。メモ：熱パッドはガーゼパッドと皮膚の間に配置してい温める動物を保つために使用されたとき。皮膚が火傷のために監視する必要があります。
2. 市販の共焦点顕微鏡の最も標準的な段階ではスライド、ペトリ皿、および異なるサイズのプレートに適合するように使用される種々のホルダを挿入するために使用される開口部を有する。 IVMを行うために35mmのペトリ皿のための標準的なステージインサートは、その後、高真空シリコーングリース又はマスキングテープ（ 図1A）によって固定さの40mmスライドガラスで覆われ、逆さまに反転される。カスタムインサートはまた、厚さ3mmのアルミニウム板から製造することができる。ガラス表面は、その後のclである70％エタノールでeanedとキムワイプでスワイプ。
3. のSGの固定化（安定剤）のためにカスタマイズされたホルダーを製造しています。ホルダーの目的の場所のSGとステージとカバーガラスにそれら厳格にカップルを安定化させることである。ホルダーを60mmプラスチックペトリ皿から作製することができる。まず、皿の底部は、壁から離れて破断し、約15×10mmの長方形に切断される。その後、エッジは目の細かいサンドペーパーを使って丸められ、研磨される。四つのスペーサー（1.5〜2ミリメートル）は1ミリリットルのシリンジプランジャーのゴムのヒントを削除することにより構築されています。細かいサンドペーパーを用いて、スペーサ及びプラスチック片の四隅の表面が研磨される。スペーサーは、その後、ゼラチン状瞬間接着剤を使用して接着され、後に平らな面に細かいサンドペーパーを使用して平滑化される。高齢の動物のために、ホルダとスペーサのサイズが若干大きく腺を収容するために増加されなければならないことに留意されたい。
4. 光結合ゲルの調製。 0.3％カルボマー-940（表2）ゲルを超純水100mlをウォーミングアップし、D-ソルビトール5.47gの溶解することによって調製される。その後、カルボマー-940の0.3グラムを加える。ビーカーを数時間、またはすべてのカルボマー塊が完全に溶解するまでカバーし、攪拌ホットプレート（最低ヒートセット）に配置する必要があります。穏やかに攪拌しながら約7.4のpHに達するまで最後に、Trietanolamineは、滴下する。ゲルは、C ^13、4℃で保存する。

パート2：動物と麻酔

1. 動物とのいずれかの実験を実施する前に、プロトコルは、お近くの動物のケアと倫理委員会の承認を得なければならない。重要なのは、研究者は、外科手術を行うために適切な訓練を受けなければならず、手続きを進める前に、地元の動物管理委員会や教育機関の獣医師に相談してください。
2. 本研究では、マウスモデル（GFP / mTomato - マウス）は、可溶性GFP（GFP-マウス）を発現するFVBマウスを交配することによって誘導されるのWi蛍光タンパク質タンデムトマト（mTomato -マウス^）6と融合し、膜標的化ペプチドを発現番目のC57B6マウスを用いた。注：それは通常、完全に麻酔し、イメージングのために準備になるために動物のために20〜30分かかり
3. マウスは、動物施設での管理された環境内に収納されており、実験前に1週間馴化させる。このステップでは、強化された分泌活性¹²内の任意の窮迫結果以来のSGを画像化するために必要である。水および食物を自由に与えている。 2-5ヶ月齢の雄を画像化実験（20〜30 g）のために使用される。
4. 麻酔の前に、麻酔薬の適切な用量を決定するために動物の重量を量る。
5. 注射用麻酔薬の投与によって誘導される応力が前記SGsの分泌活性を損なうことがあるので、麻酔薬の注射に続いて、イソフルラン吸入により麻酔を予め誘導する。この目的のために、非常に穏やかに蒸発器チャンバ内にマウスを置き、酸素流量（800〜900 mmHgの）をオンにします。前麻酔導入を開始するために3％イソフルランレベルを設定します。
6. 動物が意識不明になったら、腹腔（25 G針）に100 mg / kgのケタミンおよび20 mg / kgのキシラジンの混合物を注入する。麻酔薬は、新たに生理食塩水中20 mg / mlの100 mg / mlのキシラジンを希釈し、次いでケタミンと混合することにより調製される。この混合物をさらに食塩水で1:1に希釈され、適切な量は、動物の体重に基づいて、注入される。この希釈は、偶発的な過剰摂取を防止するのに役立ちます。混合物を20分後にその有効性を失うことに注意してください。
7. 覚醒の兆候のために動物を観察し、麻酔から出てきている場合（その後、最初の注射後45分以内に初期投与量の約75％、および50％毎時）より麻酔薬の混合物を注入する。足をつまんし、応答を観察することによって、麻酔の深さは15分ごとに確認してください。注意：必ず防ぐために眼軟膏を管理する目の乾き。
8. 麻酔薬は、実験の再現性と動物の健康に影響を与えることができ、低体温を誘発する。したがって、マウスは、加熱ランプ下または実験の全期間加熱パッド上に維持されるべきである。注：加熱ランプは燃焼を防止するために、動物から少なくとも12〜18インチでなければなりません
9. 動物の体温は直腸温度プローブを備えた温度計でモニターされなければならない。

パート3：生体顕微鏡用の動物の手術とポジショニング

1. 清潔で滅菌されていなければならないすべての手術器具（ 表1）でワークスペースを準備します。
2. 電気バリカンでマウスの首の領域を剃る。 70％エタノールに浸したガーゼスポンジで麻酔マウスの首部の腹側を下に拭いてください。キムワイプで余分を乾かします。
3. 鈍い湾曲したピンセットは正中線（近似で皮膚の小片を持ち上げてmately咬筋の下端）と、小切開（ 図1B）を作る。
4. 開口部にはさみを入れ、はさみの刃を開くことで、離れて下にある組織から皮膚を分離する。皮膚の下の方にハサミを向けることによって、基礎となる腺組織の損傷を防ぐ。皮膚がより深い組織（ 図1B）から分離されるまで、この手順を数回繰り返します。
5. はさみを使用して、幅約3ミリメートルと10ミリメートル長い緩んだ皮膚のストリップを切り出す。開口部は神経、ダクトや血管が体の他の部分にグランドを接続するのSGのベース付近で開始するように皮膚をカットする必要があります。創傷領域を洗浄した後、得られた開口部の形状は楕円形でありかつ約8×12 mmで測定する。両方SGSは開口部（ 図1B）の後に表示されます。
6. 注射器で切断の途中に光結合ゲルを適用し、手前に拭く滅菌ガーゼで外に。ガーゼのクリーン片それぞれに使用すべきで露出した組織への血液又は毛髪の導入を防止するためにワイプ。すべての血液や抜け毛が除去されるまで、この手順を繰り返します。
7. ＃7ピンセットを使って、離れて右顎下腺からの結合組織（あるいはこのプロトコルは、左のSGで使用することができます）腺のベースにすべての方法を分離する。まず、SGの先端を見つけ、数ミリ腺の先端の上に結合組織をつかむ。実質を傷つけることなく腺周囲の結合組織を引き裂く。 （ 図1B）。腺が露出されると、そっと腺から結合組織を分離する。出血が発生した場合は、生理食塩水で血を洗い流す。すべての結合組織を分離し、腺が完全に露出していることを確認してください。定期的に光結合ゲルを適用することにより、湿った腺を保管してください。
8. 顕微鏡に動物を持って来る前には、ガーゼの厚切りとHEAを配置tは38±2℃の温度を維持するために、顕微鏡ステージ上に詰める化学熱パックの温度が大気中に内袋を露出させるカットの大きさによって調整することができる。ガーゼは、金属ステージからの熱パックの一部の絶縁を提供します。だけでなく、ガーゼの薄片と熱パックの上部をカバーしています。
9. その側面（右腺用右側）にし、ガーゼの上に動物を配置します。カバーガラス（ 図1C）の中央に配置顎下唾液腺で動物を置きます。
10. 動物は腺を固定化する前に、固定されており、この位置で安定させてください。マウスの右フロントの足の腹側にマスキングテープの一部を配置します。絹縫合糸（ 図1C、挿入図）によって、マウスの門歯を引っ掛けます。絹糸と足の間にいくつかの緊張を作成し、マスキングテープでステージに取り付けます。 SGは、途中で自然に静止されるべきであるカバースリップ。頭部と胸部は、さらに、ステージに結合することができるプラスチック楔によって安定化されるべきである。
11. 腺（ 図1C）を介して組織をレンズクリーニングの小片を置きます。少し腺を拡張し、グランド上でカスタマイズされたホルダーを配置します。マスキングテープでステージに密に結合安定剤。カップリングは、ステージ（ 図1C）に接続された金属クランプを向上させることができる。それらは血流を損なう可能性がある張力と鋭角は避けるべきである。安定化は、（それがピンク色の着色を保持すべきで）視覚的に腺を調べることによって、または落射蛍光のいずれかによって血流を検査した直後。血管や血液細胞のいくつかの両方をm-トマトで標識されているのでGFP / mのトマトマウスにおいて、血流の総変化は、容易に評価することができる。
12. ガーゼ、加熱パッドで動物をカバーしています。 wを備えた温度計を使用して、露出した腺の温度を測定i番目の露出した腺の一方の側と接触して配置小さなフレキシブル熱電対プローブ。

パート4：撮影パラメータ

1. GFPまたはRFPフィルターセットを用いてのいずれかによって腺の表面に落射蛍光照明焦点の使用。 SGの表面を発見し、毛細血管の血流や組織の全体的な形態を評価します。組織損傷の兆候は、膜ブレブ形成や大きな空胞の出現が含まれています。
2. どちらエピ蛍光を介して、または選択した領域を事前にスキャンすることで組織の安定性を評価する。モーションアーチファクトのほとんどが処理後データ分析で除去又は補正することができないので、安定した調製物は、必須である。製剤が安定していない場合は、調整が必要である。
3. 適切な焦点面画像をプリスキャンモード（1×ズーム）内腺を見つけ、徐々に腺房構造、分泌顆粒とpまでカバーガラスに向けて目標を移動するにはlasma膜（ 図2）はっきりと見えるようになる。
4. タイムラプス用撮像パラメータは、個々の実験に依存しています。イメージに分泌顆粒のダイナミクスは0.5〜2秒/フレームの走査速度を使用し、0.2ミクロン/ピクセル空間スケール（約50μm×50ミクロンの視野）で256×256ピクセル。最適には、顆粒及び原形質膜を可視化するために、光学的厚さは0.9〜1.2ミクロンの間に設定されるべきである。 GFPおよびタンデムトマトを励起するためには、それぞれ、488 nmおよび561 nmの波長を使用することができる。ピーク電力は488 nmおよび561 nmのための1ミリワットの周り0.5ミリワットに設定されている。これは、最小限の光退色を保証します。
5. 検出器の設定はダイナミックレンジ内に信号を維持し、検体の輝度に依存して調整されなければならない。
6. すべてのパラメータが設定されると、撮影を開始することができる。まず、基準点として使用される視野のスナップショットを取る。同時に時間経過でのイメージング、X-YおよびZの中の組織のドリフトが発生することがあります。これは、手動でスキャン領域及びZ位置を調整することによって補償することができる。調整は徐々に少しずつ成果物を避けるためになされるべきである。また、参照画像は、光退色が発生するかどうかを決定するために使用することができる。有意な光退色が（蛍光以上の15〜20％減少）が検出された場合、0.1ミリワットによってレーザパワーを減少させる。
7. 生理食塩水中のイソプロテレノールの新たに調製した溶液の皮下注入0.1 mg / kgで、エキソサイトーシスを刺激する。エキソサイトーシスは、注射後約1分でトリガされます。原形質膜と融合する分泌顆粒は、顆粒の周りにGFP蛍光の増加およびそれらの制限膜にタンデムトマトペプチドの拡散（ 図3）によって検出される。私たちは、同じエリア内3-4タイムラプスシーケンス、10分ごとの取得をお勧めします。
8. 撮像セッションの後、ANEを安楽死させる安楽死室内のCO ₂吸入（10分10月12日mmHgの）ことにより、動物をsthetized。

結果

GFP / mTomatoマウスでは、腺房細胞質ゾル、GFPと膜を標的とタンデムトマトペプチド（ 図2、破線）を発現するよう明確に異なる構造を、表示されます。個々の腺房では、腺房細胞は、タンデムトマトペプチドによって描写されています。 GFPはまた、腺房細胞（ 図2、矢印）の内部にはっきりと見える核において検出される。細胞質ゾルGFPは、直径約1〜1.5程度の暗い円形の小胞（ 図2、挿入図、矢印）が表示され分泌顆粒から除外されます。エキソサイトーシスイベントを視覚化するために、我々は、分泌顆粒（ 図3、アスタリスク）に富む血漿膜の一つの領域に焦点を当てる。 0.1 mg / kgのイソプロテレノールの皮下注射の後、我々は原形質膜（ 図3、緑の矢印）に近接している分泌顆粒の一部の周りにGFP蛍光のレベルの増加を観察する。 Pなどreviously示し、これらの顆粒は、細胞膜と融合し、細胞質GFP ^6を保持し^て厚いアクチン網目構...

ディスカッション

これまでのところ、細胞内構造は、 インビトロ （ すなわち 、細胞培養）またはex vivoで （ すなわち 、臓器培養、組織切片、腺房の準備）は、多くの場合、完全な生体組織⁶の特性を再現しないモデル系で主に画像化されています。それは生きているマウスでは、特定の膜輸送の段階（ すなわち規制エキソサイトーシス）の動態を画像化することができますので、この点では、ここで紹介するアプローチは、大きな進展を表しています。

このプロトコルは、体腔^10,11,13-15内のSGや他の臓器のin vivoイメージングのために設計された他の手続への点で重要な進歩を表しています。マウスと比較した場合、我々の以前の研究のいくつかは、外科的処置に対してより弾力性のあるラットに行っ大きな器官を有しており、心拍数を低減した。 、マウスでの手順は設定が困難ですが、いくつかのADVAを提供疾患モデル、トランスジェニックおよびノックアウト動物のより広いスペクトルを使...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
イソフルオラン(フォラン)	バクスター101936-40		フードの下のハンドル
ケタミン(ケタベド)	フォートドッジアニマルヘルス	57457-034-10	溶液100mg / ml
キシラジン(アナセド)	アコーン、ディケーター61311-481-10		溶液100mg / ml
ネオマイシン/ポリミキシンB	バウシュとLomb	24208-785-55	の目を滑らかにするために使用
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-ソルビトール	Sigma-Aldrich	S1876
トリエタノールアミン	Sigma-Aldrich	90279	溶液が固まるのを防ぐために、液滴を賢く追加
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	必要に応じて生理食塩水で新鮮な溶液を準備します。ストックは-20°Cで保管できます。C
Instrument
Isoflurane V 1.9 (気化器)	Braintree Scientific	190AF
HEPAフィルターを装備したポータブルダウンドラフトテーブル	ハザードテクノロジー	PDDT
ヒートランプ、モデルHL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T温度計	Braintree Scientific	TW2
操作ハサミ(11.5 cmストレート	ワールド精密機器	5003708-12
#7湾曲先端ピンセットワールド	精密機器	14187
ハサミ	ワールド精密機器	503365
ブラック編組シルク縫合糸#4.0	ジョージティーマン社	160-1219-4
ガーゼスポンジ2 "x 2"	タイコヘルスケア	9022
レンズクリーニングティッシュオ	リンパス	CL-ティッシュ(M97)AX6476