脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析法による生体組織のイメージング

サマリー

脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析法（DESI-MS）は、生体組織を含むサンプルは、最小限の試料調製で画像化される際、周囲の方法である。イオン化プローブの下のサンプルをラスタでは、このスプレーベース技術は組織切片内の関心の分子的特徴を識別するのに十分な空間分解能を提供します。

要約

質量分析イメージング（MSI）は、ミクロンスケールの十何百で生体組織を調査するための最高の特異性と空間分解能で非ターゲット分子の情報を提供します。周囲条件下で実行したときに、試料前処理は、取得した情報の高品質を維持しながら、その結果、プロトコルを簡略化不要となる。脱離エレクトロスプレーイオン化（DESI）があっても、生体内で 、オープンエアでの表面の直接サンプリングが可能にスプレーベースアンビエントMSI技術です。ソフトウェア制御の試料ステージで使用する場合、サンプルはDESIイオン化プローブの下にラスターされ、タイムドメインを介して、のm / z情報は、化学種の空間分布と相関している。 DESI-MSI出力の忠実度は、試料表面と質量分析計の入口に対するソースの向きおよび位置に依存する。ここで、私たちは、私がDESIため組織切片を準備する方法について検討しmagingと直接画質に影響を与える追加の実験条件。具体的には、DESI-MSIによるラット脳組織切片の画像化のためのプロトコルを説明する。

概要

質量分析法による非標的イメージングは​​発見と仮説生成のアプリケーションのための化学情報の取得を容易にします。一方、関心の既知の化学物質の標的とイメージングは​​、特定のメソッドの開発を通じて増加感度と選択を容易にすることができる。質量分析イメージング（MSI）が最も一般的に^MALDI、1次イオン質量分析^{（SIMS）、2}及び脱離エレクトロスプレーイオン化^{（DESI）、3}レーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化^（LAESI）4を含む周囲のイオン化技術を用いて^、組織上で実行される⁵及び液体マイクロ接合面サンプリングプローブ（LMJ-SSP）。MALDIとSIMS ^6、サンプルは、それらが高真空下で分析されるので、物理的に試料から除去する必要があり、平坦かつ薄くなければならない。 MALDIは、試料調製に追加の煩雑な工程を追加すること、放射線吸収性マトリックスと試料のコーティングを必要とする。 SIMS最高の方位分解能を持っていますが、高エネルギー粒子による砲撃は、広範な分子の断片化を引き起こす。したがって、周囲の方法によるMSIは最小限のサンプル調製とソフト解析が望ましいニッチを埋める。しかし、現在までに、すべてのメソッドはまだ平らな試料表面の要件によって制限されています。

DESIは、分析物を脱着してイオン化する試料表面に向け空気圧補助充電溶剤スプレーを使用しています^。7 DESIによって脱着とその後イオン化のための作業モデルは"ピックアップモデル滴"として知られています^。8-10帯電した主滴がDESIプローブによって生成され、それ湿潤剤および分析物が表面から抽出された物質を含む二次液滴の運動量移動し、離陸中に固液マイクロ抽出機構⁸後続の液滴の衝突の結果により溶解させるに薄膜を形成し、表面に衝突最終的には^。9,10、ガス相イオンは、しかし、DESIで正確なイオン形成プロセスが実験的に証明されるには至っていないイオン蒸発、電荷残基モデルまたは他のモデル^、11以下のESI状の工程を経て製造されると考えられている^。12 DESI感度がの溶解度に強く依存している脱着は、ローカライズされたマイクロ抽出に依存しているようなスプレー溶剤中の分析、図¹³

ソフトウェア制御の試料ステージで使用する場合、サンプルはDESIイオン化プローブの下にステッピングレーンを一方向に走査され、タイムドメインを介して、のm / z情報は、化学種の空間分布（ 図1）と相関している。 2006年にヴァンケルとケルテスによって報告原則DESI-MSI実験^、14技術の最初の証拠は、脂質の分析で報告されたアプリケーションと、かなり^3,16薬物代謝物を^15に成熟しているので^、17,18 diseaSEのバイオマーカー^、19脳組織^、3,18,20肺組織^、18腎臓組織^、18精巣組織^、18副腎^、17薄層クロマトグラフィープレート^、21および藻類面。DESI-MSIによって得られた画像の²²ルーチン解像度が最終的に有効な表面スプレーすることにより抽出された領域が、40μm以下が報告されているという低い解像度によって決定さ100-200ミクロン、。分析^23-25 ​​このような解像度や使いやすさは、迅速かつ簡単な分析のためにDESI-MSIが適切になります0.5〜5センチメートル²の範囲内の表面積を有する生体組織サンプルの、より良好な生物学的プロセス^26を理解する^のに貴重な空間情報の取得を可能にする。ここでは、典型的DESI-MSIアプリケーションの一例として、我々は、ラット脳組織における脂質の撮像を伴う成功した実験を実施する手続きの詳細を確認する。プロトコルの2つの最も重要なステップは次のとおりです後述するように組織調製²⁷及びDESIイオン源の最適化。

プロトコル

1。セクショニング組織

1. 店舗区画する準備ができるまで-80℃の冷凍庫で急速冷凍、全体の組織。
2. （30分）切片の前にクライオミクロトームの温度に到達するために組織サンプルを可能にする。 -30℃〜ブレードと試料温度を設定
3. 一度組織が ​​、ピンセットで標本を扱う、温度に達しどんな脳の一部が（ すなわち脳の前面が最も重要である場合には、脳の後部にマウント十分な表面実装用に関心があるに応じて脳の前面または背面をカットしていますチャック上）。
   1. 中央にチャック、ピンセットを使用して、それが凝固するまで、10月に行われたサンプルを保持するために〜0.5ミリリットル最適切削温度化合物（OCT、ティッシュ-Tek社、さくら）を適用します。一度10月には、サンプルホルダーにマウントチャック完全に凍結されています。
   2. 試料をマウントするために使用される、OCTの最小量であることが好ましい（OCTブロックに試料をマウントとは対照的に、一般的に他のヒストグラムで行われるような試料の汚染を最小限に抑えるために論理的な手順）。 10月による試料の汚染は、イオン抑制によるDESIおよびイメージングプロセスに有害である。
4. 厚さ12-18ミクロンからMS撮像範囲のために必要な典型的な組織切片。推奨範囲内の所望の厚さで節組織。軽くセクションオーバー室温顕微鏡スライドガラスに触れることによって、それぞれの切片組織を融解マウント。サンプルがマウントされると、それは化学物質分布および組成を変更しますので、組織切片に触れないように注意してください。

注：我々は1つの最適化のためのセクション、およびイメージングのために他のを使用して、スライドごとに2つのセクションを取り付けをお勧めします。のセクションでは、スライドボックスで°Cの冷凍庫まで-80で即時イメージング、店舗スライドの分析のための準備ができていない。場合

5. 保存されたセクションを解析する場合は、冷凍庫からスライドを削除し、すぐに真空デシケーターに転送し、許す​​〜15-20解凍しMIN。長くデシケーター中で標本にしておくと、サンプルを乾燥し、DESI効率が低下します。それが融解した後DESIイオン源の最適化は、組織サンプルに行われるが、時間の関係で、試料が解凍される期間は、装置の初期化のための理想的な時間として機能する。
   1. 溶剤DESIとして1％酢酸とアセトニトリルを使用し、5μL/分の流量でシリンジポンプをオンにします。より低い流量はDESIスプレーと有効画素サイズの衝撃スポット側を減少させるが、より高い流量が十分な感度のために必要であり得る。したがって、流量は、（典型的には1〜5μL/分）、各アプリケーションと所望の感度および解像度のために最適化されるべきである。注射器が与えられた流量で完全最適化とイメージングのための十分な溶剤が含まれていることを確認。
   2. 溶剤がソース先端から出滴る表示されたら、圧力と窒素噴霧ガスをオン160 PSIの電子。
   3. 3,600を印加するイオン源に接続された高電圧電源をオンV.
6. モーション·ステージ上にスライドをマウントし、イオン源とMS最適化を開始

2。 DESIの最適化

1. DESIシステムは、ソース·プローブ（ 図2参照）、シリンジポンプ及び又は代替溶媒デリバリーシステム、圧縮窒素、翻訳試料ステージとマウントから成る。質量分析計が適切な質量範囲と関心の分析物のために調整された後DESIソースの最適化を進める。
   1. ソースコンポーネントがまだオンになっていない場合は、方向のセクション1.5.1-3を参照してください。
   2. これらのセクションで説明する変数は、生体組織のイメージングのために推奨されています。しかしながら、これらの変数は、組織または試料の種類ごとに最適化されるべきである。代替溶媒、流量、噴霧ガス圧力と電圧がイマジ報告されている生体組織の^NG。16-18
2. 当初DESIソースはスライドガラスに触れていないし、組織切片のいずれかの部分に向けられていないことを確認します。これは、プローブは、初期化プロセス中に損傷されず、組織試料と接触することによって一連の任意の部分を汚染しないことを保証する。
   1. 良い開始位置は、試料表面に対して55°の角度でプローブで、先端試料表面から3ミリメートルとMSキャピラリー入口から5ミリメートルである。 DESIプローブの内側の毛細血管は、外側の毛細血管を超えて〜1ミリメートルを拡張する必要があります。これらのパラメータのすべてが最適化される。
3. キャピラリMSインタフェースは、イオンの最適な転送のために試料表面に対して〜15°の集光角を有するべきである。試料表面上にMSキャピラリー置いたように、ステージの高さを調整し、キャピラリーはできるだけ近く、表面から<1ミリメートルであるべき触れることなく。
4. 彼らは直接に沿ったものであるように、MSキャピラリー入口に対してX次元でDESIプローブの位置を合わせます。
5. 余分な組織切片を用いた最適な感度DESIソースのy、zの位置を調整します。 DESIプローブは、一つのサンプル領域に向けられるように、それが最終的に脱着イオン化し、その領域内の分析物のすべてを、これが発生すると信号が徐々に減少することに注意してください。できるだけ早く、この手順を実行することが重要です。
   1. したがって、最適化プロセスを通して、試料は、新鮮な試料を分析して、信号の変更は、ソースの最適化ではなく、試料の枯渇によるものとされていることを確認するために、スプレーヘッドの下に移動する必要がある。しかし、組織の異なる領域の様々な化学組成ことを考慮すると、全体の組織切片を横切るイオン強度の直接比較は、完全に正確ではない。脳の視床は、と合理的に大型の領域を提供より一貫した化学組成が、それでも完全に均一ではない。また、離れてサンプルからのスライドガラス上に（[M] ⁺のm / z 443）染料ローダミン6Gが含まれている赤いシャーピー、、のマーキングDESIによる強いMS応答を提供し、また最適化のために使用することができますが、別のサンプルフォームと検体を考えると、これらの条件はまだ生体組織のための理想的なセットアップに相関しない場合があります。
   2. ソースチップとキャピラリー入口との間の推奨Yセパレーション：〜4ミリメートル、チップと試料表面の間に推奨Zセパレーション：〜1.5ミリメートル。けれども、これらのパラメータは、各実験のセットアップのために多少異なる場合があります。
   3. プローブの形状および角度を考慮すると、y及びz次元位置が溶媒及び検体を含む液滴の実効伝送に対して相互に関連していることを考慮する。一つの変数の変化は同じスプレー着弾位置を維持するために、他の後続の変更が必要になり、その伝送角度。
6. 距離の最大感度のソース、及び影響を最小限に抑えスポットサイズの外側の毛細血管から内側の毛細血管押し出しを調整します。注意：この調整をしながら、高電圧がOFFになっていることを確認してください。
7. 最大の信号が観測されるとき、ソース·ジオメトリは、最適とみなされる。
   1. セクション2.5から2.6に最適化された変数は、相関関係があり、したがって、1の調整は、本質的に必要なソース·サンプルインレット形状を維持するために、他の再調整、またはセクション1.5.1-で議論条件の調整が必要になります3。
8. また、質量分析計へのキャピラリ転送を囲む加熱素子は、イオン化過程中に生成検体帯電液滴の脱溶媒和を容易にすることによって感度を向上させることができる。ここでは、ロープのヒーターを使用するキャピラリーを100℃に設定された転送の周り巻か

3。 Tissu電子イメージング

1. イメージングプロセスの間、試料ステージは、毛管DESIプローブとMS入口の下に試料を移動させ、他のすべてのコンポーネントが静止したままである。ステージの動作パラメータは、DESI衝撃プルームのサイズおよび最適な感度に基づいて選択されるべきである。
   1. より大きな衝撃プルームがより試料を脱着されていることを考えると、より高いイオン強度になり、しかしながらイメージングのために、それは、より大きな画素サイズより悪いので、画像解像度をもたらす。
2. この実験で使用並進ステージは家庭構築され、所定の大きさの画像の速度および行間をラスタ走査の制御を可能にするのLabViewプログラムによって制御される。この実験で使用したステージ動作制御VIはomnispect.bme.gatech.eduで入手可能である。あるいは、市販DESI源とステージは、Prosolia社（インディアナ州、USA IN）から自動化された2Dオムニスプレー源として使用することができる。
   1. 脳組織のために典型的な画像サイズは10×15ミリメートルであり、使用ステージ動きパラメータが与えられると、画像は約3時間かかります。
      1. プログラムLabVIEWのVIまたは所望の撮影条件と同等の制御ソフトウェア、ステージスキャン80μmの速度/秒、200μmの行の間の行間隔を使用。オムニスプレー源を使用する場合、動きパラメータが100〜200ミクロン/秒の走査速度及び200μmの行間に設定されるべきである。これらの動きパラメータを各寸法と必要な感度で所望の画素数に応じて変更することができることに留意されたい。
         1. 小さ ​​い行間隔は、スキャン速度は効果が少ないを有する、画質を改善することが示されている^。25しかし、これは必ずしも示し、改善された画像の解像度ないことに注意することは重要であると衝撃スポットに強く依存するサイズ。遅い走査速度が小さい行間隔が大幅分析の時間が長くなり、したがってoptimiでなければならない組織またはサンプルの種類ごとにアルファベットのゼット。
      2. 行間隔がy次元のピクセルサイズを決定するのに対し、1スキャン/秒、1ピクセル/スキャンとして作成された画像に設定MSスペクトルの買収により、ステージ速度は、X次元の画素サイズを定義します。画像の真のピクセルサイズが広がるスプレーによるこれより大きいですが、遅い動きが脱着と検体の検出のためのより多くの時間を可能にします。
   2. LabVIEWのVI内の画像の間に記録されるべき位置と時間のファイルのディレクトリパスとファイル名を付けます。
3. マススペクトルデータ取得のための準備では、撮像に要する合計時間を計算する。我々のグループによって使用されるLabVIEWプログラムは自動的にこの値を提供するが、代替ステージ制御が使用される場合、この計算はMSデータの取得設定する必要がある。
   1. オムニスプレー自動化されたソース及びステージを使用する場合は、画像の各ラインはように取得される分離したが実行されます。時間当たりのラインと所定の撮像寸法のために必要なライン数は、質量分析計ソフトウェアに入力するオムニスプレー制御ソフトウェアを用いて計算される。
4. 質量分析計のスキャン速度が1スペクトル/秒であることを確認し、計算された合計時間に一致するように計器取得時間を設定します。
   1. スペクトルスキャン速度1スペクトル/秒に設定します。
   2. PROFILEモードでデータを取得およびm / zの範囲は、関心のある化学種に適していることを確認する。そのDESIもESIのように、多価の検体を作り出すことを忘れないでください。
   3. LabViewのによって与え合計画像時間を一致させるために、取得時間を設定します。
5. 画像化される領域の左上にスプレーインパクトスポットを配置します。
6. 同時にMSデータとステージモーショ​​ンの取得を開始します。
7. データ収集の終了時に、スタンバイモードに質量分析計を返す。
8. DESI源の高電圧をオフにします。
9. Oを回しFFの窒素ガス。
10. シリンジポンプの電源をオフにします。

4。画像処理

1. マススペクトルデータは、ステージ時間とLabVIEWを使用して、テキストフ​​ァイルとして保存された位置データとの組み合わせで対応するスペクトルを有する画素の座標を相関2Dイメージに "折り畳ま"しなければなりません。 omn​​ispect.bme.gatech.edu：ここで紹介する画像はで自由に利用可能であるMatlabのベースのソフトウェアを使用して処理した。データはオムニスプレー源を用いて取得している場合は、ホタルデータ変換ソフトウェアは、バイオマップ（www.maldi-msi.org）の画像可視化のためのデータ·キューブを作成するために使用される。
2. Jeol AccuTOFの質量分析計で得られたデータは、記録されたクロマトグラムは、さらなる分析のために。CDF形式でエクスポートする必要があります。
   1. MassCenter内データマネージャーを使用して、最初のcentroidedデータ（[ツール]→[変換集録データの重心に）取得したデータを変換します。その後、キーボードの組み合わせはCtrl + Shift + E FOLを使用することによって。CDF形式でデータをエクスポート[ツール]→[エクスポート順となっている。
3. OmniSpectウェブサイトに生。CDFの質量スペクトルデータと2つのテキストフ​​ァイル、位置と時刻を、アップロードします。ホタル処理された撮像データは、バイオマップで可視化することができる。
   1. 関心の単一イオンの非負行列因子またはプロットすることにより統計分析などのデータをさらに処理は、ウェブサイト上で直接実行することができます。
   2. また、生のデータキューブは、MATLABでの解析のためにエクスポートすることができます。

結果

図3は、未処理ラットの脳切片から得られた代表的なスペクトルを示す。ポジティブモードでは、質量スペクトルは、その高いイオン化効率（正に荷電した第四級アンモニウム基に起因する）に起因ホスファチジルコリンによって支配される。組織切片の総イオン画像も全体の脳切片を横切る豊富な信号を示し、 図3に示されている。検出したキー脂質は文学の比較を通して、表1で識別されます。

例脂質の空間分布（ 図4）は、異なるホスファチジルコリン種の相対量はグレーと、脳の白質との間でどのように変化するかを示しています。 [PC 36:1 + K] ⁺のm / z 826.5558、増加した強度を示し、一方たとえば、[PC 34:1 + K] ⁺のm / z 798.5364では、小脳皮質（灰白質）に増加した強度を示す小脳脚（WHITE事項）。 2イオン（ 図4C）で得られた合成画像は、組織切片にわたる...

ディスカッション

DESIソースジオメトリの最適化が成功したMSIの実験のために重要である。システムの整合に寄与する複数の変数を直接感度と画像解像度に影響を与える。最適化の際に、実験者が信号を得る難しさを持っている場合、我々はベンチマークとしてスライド上に描かれた赤いシャーピースポットを使用することをお勧めし、染料、ローダミン6G、のm / z 443は、正イオンモードで強力な信号を生成し、使用することができ初期化。検体送信及びイオン化形成された薄膜中に表面からの分析物の抽出に依存するのでまた、DESIための溶媒の選択は、感度のために重要である^。13多くのエレクトロスプレーイオンと互換性のある溶媒との混合物を脱溶媒を補助するために使用することができイオン化プロセスが分析中に、目的の化合物のクラスに応じて。

前述のように、DESI-MS画像DEPEの解像度主としてソースジオメトリ上NDS。これはレーザーベースおよび/ ​​または〜10-150ミクロンの範囲とすることができる真空イメージング法よりも高いですが、200ミクロン程度の画像解像度は、定期的に、DESI-MSIによって得...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
Tissue-Tek O.C.T.コンパウンド	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
>アセトニトリル	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS グレード
酢酸	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	利用可能な任意のミクロトームを組織切片化に使用できます http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
オムニスプレー®DESI スプレーヘッド	(株)		2-Dオムニスプレー®も使用できます。イメージング実験のコンポーネントを組み立てる代わりにソースキット http://www.prosolia.com/sources.php
高圧電源	スタンフォード・リサーチ・システムズ社	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
ロープヒーター、RTD、コントローラー	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF質量分析計		JEOL JMS-T100LC	拡張キャピラリー大気圧インターフェースを備えた任意の質量分析計を使用できます