3次元細胞培養のための自己申告足場

サマリー

生体適合性のpH応答性ゾル - ゲルナノセンサーは、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場に組み込むことができる。産自己申告足場は、足場上に細胞を培養しながら微小環境条件の現場モニタリングのために使用することができる。 3D構築物が細胞の実験を妨害することなく、リアルタイムでモニターすることができるので、これは有益である。

要約

適切な足場上に3Dで細胞を培養すると、より良好なin vivoでの微小環境を模倣し、細胞-細胞相互作用を増大させると考えられている。結果の3D携帯構築物は、多くの場合、2次元で研究の同様の実験よりも分子事象および細胞間相互作用を研究するより関連することができます。足場を通して高細胞生存性との効果的な3D培養物を作成するために、酸素、注意深く分析物濃度の勾配のように制御することが必要なpHなどの培養条件は、3D構築物の全体にわたって存在することができる。ここでは、ポリ哺乳動物細胞の培養のためのそれらのその後の製剤と共に（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場内に生体適合性のpH応答性ゾルゲルナノセンサおよびそれらの取り込みを調製する方法を記載している。 pH応答性スキャフォールドは、3D携帯構文内微小環境pHを測定するためのツールと​​して使用することができます。さらに、詳細なpH応答性nanoseの配信成長エレクトロPLGA足場によってサポートされていた哺乳動物細胞の細胞内環境にnsors。 pH応答性ナノセンサーの細胞質の位置は、進行中の実験の間、細胞内pH（PHI）を監視するために利用することができる。

概要

組織工学における主要な戦略は、それが交換する形態としている組織に似ており、また、細胞増殖および機能^1,2をサポートすることができる足場を製造するための生体適合性材料を使用することである。足場は、細胞の接着や増殖はまだ3D携帯コンストラクトの隙間を通じて細胞移動を可能にすることによって、機械的なサポートを提供します。足場はまた、細胞の栄養素の大量輸送を可能にし、代謝廃棄物³の除去を阻害してはならない。

エレクトロスピニングは、細胞増殖^4-6を支持することができるポリマー足場の製造のための有望な方法として出現した。彼らはしばしば多孔性であり、細胞の3D構築物⁷の隙間を通して細胞間相互作用、ならびに細胞移動を可能にするようにして製造不織布電界紡糸繊維は、細胞増殖に適している。これは、tの間に細胞生存率を監視することが重要である彼培養期間、その細胞の生存率を確保するためには、3D構築物の全体にわたって維持される。検体濃度の勾配は、3D構築物内に存在することができるように、例えば、酸素やpHなどの培養条件は、慎重な制御を必要とする。バイオリアクターまたは灌流系は、間質流のインビボ条件で模倣し、その結果、栄養素伝達および代謝廃棄物の除去^8を増加させるために用いることができる。このようなシステムは一定の微小環境条件を確保しているかどうかの問題は、リアルタイムでの細胞の微小環境を評価することによって対処することができる。

リアルタイムで監視することができる主要な微小環境メトリクスとしては、温度、細胞培地の化学組成、溶存酸素及び二酸化炭素の濃度、pH、湿度。これらのメトリックのうち、温度が最も容易にその場プローブに用いてモニターすることができる。一般的に残っているリストされているメトリックを監視するための方法volveサンプリングのためのアリコートの除去、したがって、細胞培養を妨害し、汚染のリスクを増加させる。連続的なリアルタイムの方法が求められている。現在の監視方法は、通常は物理的なpHモニターや酸素プローブなどの細胞構造を探査楽器に依存している。しかし、これらの侵入方法は、細胞の構造を損傷し、継続的な実験を邪魔することができます。 3D構築物内の検体濃度の非侵襲的モニタリングは、例えば、栄養枯渇⁹のような種々の環境側面のリアルタイムモニタリングを可能にすることができる。これは構造内の深部への栄養供給の評価を可能にし、代謝廃棄物を効果的に^10,11削除されたかどうかを決定するであろう。侵襲性の問題に対処しようとするシステムは、一般に、pHをモニターするために培養容器の両方を通って外部センサへの培養培地を渡す灌流チャンバーの使用を含む酸素および^{グルコース12。}ザ·直接再サンプリングのためのアリコートの除去を必要としない、そのようなものとして、その場の監視に提供するであろう培養容器に組み込むことができるセンサを開発することに関心が高まっている。

その場 、我々は自己申告足場^13を生成するエレクトロ足場に、検体応答性のナノセンサーが組み込まれている微小環境条件を非侵襲的にモニタリングするためのこのような欠点に対処すること。感知装置は、エレクトロスピニングによって、または従来足場形成^14,15にポリマー中に組み込まれる検体応答性染料を使用することによって作成された実際の高分子足場のいずれかであった場合に蛍光活性をモニタリングすることによってセンシングデバイスとして作用する足場は、予め調製されている。しかしながら、これらの感知装置は、他の検体からの干渉による誤光出力を与える可能性を有する。レシオメトリック感知装置SUの使用記載されたプロトコールで調製したものとchがこれらの可能な副作用を排除し、問題の分析物に特異的な応答を提供する可能性を保持している。

ここに提示エレクトロスパン足場は、合成共重合体による食品医薬品局（FDA）の承認を有する選択されたポリ（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）、その生分解性および生体適合性の特性のために、トラックから調製された種々の細胞型^16-18の増殖および機能をサポートするレコード。準備されたレシオメトリック分析物応答性のナノセンサーは、pHに応答する。ナノセンサーはつの色素の生体適合性ゾル - ゲルマトリックス中に二つの蛍光色素を組み込んで、FAMは、pHに応答し、それがpHに応答しないように、他の、TAMRAは内部標準として作用する。それらは有意に重複しないようにさらにFAMとTAMRAの蛍光の両方を別々に分析することができる。蛍光EMIの比を決定する特定の波長での両方の色素のssionは、他の環境条件とは独立したpH応答を与える。自己申告足場が開発3Dモデルを中断することなく、 その場でリアルタイムでのpHの反復評価を可能にすることができる。我々は、これらの足場は、細胞付着および増殖を支持することが可能であり、問​​題の分析物に応答性を維持することを実証した。操作された構築物中の副生成物の酸性の動態は代役のままであり、そのようなpH応答性足場を使用して大幅にそのような研究^19を容易にすること^ができる。さらに、組織工学用途のための自己報告の足場の使用は、非侵襲的かつリアルタイムで、in vitroでの 3Dモデルの組織構築物の増殖を完全に理解するための機会を提供し、監視し、最適化する。

pH応答性ナノセンサーはまた、エレクトロのPLGA scaffol上に培養した線維芽細胞の細胞内環境に配信されたDS。色素からの蛍光発光の比は、pHiはをモニターするために使用し、pHナノセンサーを組み込んだ自己申告足場と比較した。 3D環境で培養した細胞へのナノセンサーの配信が深い非破壊で構文内の分析物濃度の監視を可能にすることができます。したがってナノセンサ非破壊3Dを通して細胞の挙動を評価するための実行可能なイメージングツールは、長期的な分析を可能にする構成であってもよい。 3D構造内の個々の細胞の検体濃度をスクリーニング、彼らは十分な栄養と酸素濃度が供給されていることを確認できた。監視プロセスパラメータは、酸素と栄養分の有効質量の輸送のために標準化された技術の開発を支援することができる。細胞内環境およびポリマー足場中へのナノセンサーの取り込みに対するナノセンサーの送達は、3D定数内で細胞生存率の評価、ならびに足場性能を可能にするために組み合わせることができる組織の成​​長プロセスの間にructs。これはこれらの構築物の増加の知識につながり、生物学的に関連組織代替物の製造を進行することがある。

プロトコル

概要

セクション1は、SEMを用いた蛍光分析法とそのサイズを使用してpHにナノセンサー応答のpH応答性ナノセンサーおよび特性の製造を記載し​​ている。

第2節では、エレクトロポリマー足場とSEMを用いて、それらの形態や大きさの特性の製造を記載し​​ている。第2節では、また、pH応答性ナノセンサーを含めてエレクトロ足場である自己申告足場の製造が記載されている。得られた自己申告の足場は、電界紡糸繊維の任意の形態学的変化が生じたかどうかを評価するために、SEMによって特徴付けられる。組み込まれたナノセンサーから得られる自己申告足場からの蛍光を共焦点顕微鏡によって評価される。

第3節では、エレクトロ足場と自己申告足場上に細胞の培養について説明します。足場は最初preparatで滅菌された足場を滅菌し、細胞の培養は、自己報告足場の蛍光能力に影響を与えるかどうかを決定するために評価され、細胞培養のための次のイオン。プロトコルは、エレクトロ足場上に培養される細胞へのナノセンサーの送達を記載する。リソトラッカー色素は、ナノセンサーは、細胞の酸性区画内に取り込まれていないことを確認するために使用される。

1。 pH応答性ゾル - ゲルナノセンサーの調製および分析

pH応答性ゾル - ゲルナノセンサーの1.1準備

注：この製剤は、ドラフト内で実施されるべきである。

1. フラスコおよび6 - カルボキシテトラメチルローダミンを丸底（および-6） - カルボキシフルオレセイン、ジメチルホルムアミド中のスクシンイミジルエステル（FAM-SE）（1.5 mg）を（DMF）（1ml）中5 - を溶解することによりpHをナノセンサー内で使用するためのフルオロフォアを調製、別のラウンドでのスクシンイミジルエステルのDMF（TAMRA-SE）（1.5 mg）の（1ミリリットル）をフラスコの底。各フラスコに3 -アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）（1.5）を添加し、暗所で24時間、乾燥窒素雰囲気下（21℃）の下でかき混ぜるすなわちホイルでサンプルを包む。
2. 丸底フラスコ中のエタノールの混合物（6ml）および水酸化アンモニウム（30重量％、4 ml）中に上記色素（250μlの）の両方を添加し、1時間（21℃）攪拌する。
3. ゆっくりと、さらに2時間撹拌し続け、混合物にテトラエチルオルトシリケート（TEOS）（0.5ミリリットル）を追加します。混合物が濁って変わります。ナノセンサーは、回転蒸発により回収することができる。ナノセンサーは、将来の使用のために4 ^度Cでガラスバイアル中に保存することができる。
   
   注意：その乾燥形態でのナノセンサーの更なる処理はドラフト内で、またはバランスがWeighsafeの例では、囲まれている必要があり、それらを計量した場合に実行する必要があります。

pHは1.2ナノセンサーの対応

1. ミクシィでpHを5.5から8.0に至るまでソレンセンのリン酸緩衝溶液を調製リン酸二水素ナトリウム（0.2M）とリン酸水素二ナトリウム（0.2M）の原液のNG特定の比率。 pHメーターを用いて最終pHを確認してください。水酸化ナトリウム（NaOH）（4 M）または塩酸（HCl）（2M）を用いてpHへの微調整を行います。
2. まず液が白濁するまで（約5分）超音波装置で容器を水没して3分間ボルテックスにナノセンサー·ソリューションを含む容器を保持することによってpH緩衝液（5 mg / ml）をのpHナノセンサーを一時停止します。完全に溶液中でのナノセンサーを一時停止するには、次の手順を繰り返します。
3. 光学キュベットに最初に溶液を置き、5について488nmの励起波長を使用して - （および-6） - カルボキシフルオレセイン（FAM）および6 - カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）が568ナノメートル。 FAMとTAMRA蛍光分光計を使用するための558から580 nmのための500〜530nmでの発光波長を収集する。
4. pHは、異なるpHで観察できるように、光学キュベット中の溶液を変更およびcを続行発光スペクトルをollecting。
5. 較正曲線を生成するために、各pH値で生成さ発光最大値の比を計算する。

ナノセンサーの1.3 SEM

1. カーボンコーティングされた電子顕微鏡スタブ上にナノセンサーのサンプルを配置し、アルゴン雰囲気下で5分間、金でコートをスパッタ。
2. 走査型電子顕微鏡（SEM）により観察する。 （ 図1）帯電電子を最小限にするために、作動距離、電圧、倍率を調整する撮像中に。

2。 PLGA足場の調製および分析

2.1エレクトロスピニングPLGA足場

1. ドラフト内でポリピリメートとジクロロメタン（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）（DCM）（20％（w / w）である）（PF）（1％（重量/重量））を溶解する。 18 G鈍フィル針とシリンジポンプにしっかりとフィットして10ミリリットルの注射器に溶液を入れます。
2. 20センチメートル徒歩20から針の先端を距離センチ×15cmのアルミニウム集電板。
3. シリンジの先端とアルミニウム集電板にアースに高電圧電源の電極を取り付ける。
   
   注意：お手入れは、高電圧が使用されているように、すなわち常にエレクトロスピニングの器具を扱う前に電気の供給をオフにする注意が必要です。
4. 2時間12 kVの時に3.5メートル/時の一定流量を使用してソリューションを提供します。これらの条件を用いて、電界紡糸は約60μmの足場の深さが得られます。
5. 溶剤残留物を蒸発させるために24時間ドラフト内で足場を残す。

2.2エレクトロスピニングpH応答性のPLGA足場

1. セクション2.1で、ポリマー溶液（5 mg / ml）でナノセンサーに改変を加えるして説明したように、足場はpH応答性ナノセンサーを組み込んで調製する​​。超音波の助けを借りてPLGA溶液中のナノセンサーを一時停止する（約5分）前に 10mLのシリンジ内に配置する。

2.3 PLGA足場のSEMおよびpH応答性スキャフォールド

1. カーボンコーティングされた電子顕微鏡スタブにPLGA足場やpH応答性足場のサンプルを配置し、ナノセンサーのSEM（ 図1）に記載のように進みます。

pH応答性足場の2.4校正

1. 35ミリメートル培養プレートにpH応答性スキャフォールドのサンプルを置き、適切な緩衝溶液に浸す。
2. 共焦点顕微鏡でナノセンサーの中にTAMRAを励起し、FAMおよび568 nmのクリプトンレーザーを励起する488 nmのアルゴンレーザーを使用しています。 FAMおよびTAMRAのための558から580ナノメートルのための500から530 nmのpH応答性足場用の蛍光発光を観察します。 （ 図2）。励起波長のコレクションを回避するために、順次走査を使用しています。

3。 PLGA足場およびpH応答性のPLGA足場上に細胞培養

ntent ">注意：以下は、細胞培養のキャビネットで行ってください。

細胞培養のためのPLGA足場の3.1準備

1. 2cm ²の断片に、PLGAまたはpH応答性のPLGA足場を切った。
2. 15分間8cmの距離で紫外線（UV）光で各側を照射して足場を滅菌する。
3. 12穴培養プレートに足場を移し、その上にスチールリングを配置。 （5％v / v）の内側にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、スチールリングの外で、一晩インキュベートペニシリン/ストレプトマイシンの溶液を入れる（37℃、5％CO _2）。 2センチメートル外径1cmの内径1cmの深さ：スチールリングは、ノッティンガム大学で生産し、以下の寸法を有したことに注意してください。
4. 殺菌溶液を除去し、PBSで洗浄する。
5. （500μL）と外側（500μL）スチールリングの、インキュベーター内の場所（37℃、5％CO ₂の内部に細胞培養培地を追加）細胞懸濁液を準備しながら。
6. 細胞懸濁液を調製し、トリパンブルー排除アッセイを用いて細胞数を実行します。
7. 1×10 ⁶細胞/ mlの細胞数を達成するために、細胞懸濁液を作成する。
8. スチールリングの内側と外側からメディアを取り出します。
9. スチールリング（1メートル）の外側に予め温め細胞培養培地に交換してください。
10. 細胞を配布するために静かに前後に岩板 - スチールリングの内側に細胞懸濁液を300μlを加える。
11. インキュベーター内に細胞培養プレートを置きます（37℃、5％CO _2） - 2〜3日ごとにメディアをリフレッシュ-細胞の接着は、しかし限り、実験が必要と培養を継続し、24時間以内に起きている必要があります。

PLGA足場上に培養細胞に3.2ナノセンサー配信

1. セクション3.1で説明したように、PLGA足場の上に種細胞。この研究では、ブランクのPLGA足場（しないcontai寧ナノセンサー）撮影する場合により蛍光発光の重なりに使用された。
2. 細胞は前にナノセンサーの配信に足場を通して成長し、移行することができるように72時間インキュベーター（37℃、5％CO _2）への細胞播種足場を置きます。
3. 送達をナノセンサーの前に、1時間（37℃、5％CO _2）インキュベートし、PBSで細胞を洗浄し、標準培養培地から抗生物質および無血清培地に培地を変更する。注：3T3細胞のための標準的な培養培地は、ウシ胎仔血清（10％（v / v）で）、L-グルタミン溶液（2mM）を、ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地、（1％（v / v）で） 。
4. 潜伏期間中に溶液Aを作成するために簡単にのOptimem（50μL）でナノセンサー（5 mg）を超音波処理することによってナノセンサー - リポソーム複合体を準備
5. オプティメム（45μl）のにリポフェクタミン2000（5μl）を添加することによって溶液Bを作成し、5分間室温でインキュベートする。
6. ソリューションを追加溶液Bに、ナノセンサー - リポソーム複合体である溶液Cを形成するために20分間室温でインキュベートする。
7. 細胞に溶液C（100μl）を添加し、3時間（37℃、5％CO _2）インキュベートする。
8. インキュベーター、吸引メディアから細胞播種足場を外し、共焦点顕微鏡による生細胞の可視化を可能にするために、PBS（1ミリリットル）を加える前にPBSで2回洗浄します。注：異なるpHでのキャリブレーションが実行されたため、細胞培養培地中に存在するフェノールレッド指示薬はまた、自家蛍光の原因としないようにPBSは、このプロトコルで使用した。しかしながら、フェノールレッドを含まない培地は、細胞培養物の長期的分析のために使用することができる。
9. 異なるpHのバッファーに細胞播種された足場を浸し、細胞に関連ナノセンサーの応答を監視します。
10. 共焦点顕微鏡を用いて蛍光を観察することによって、FAMとTAMRAの蛍光強度の比を決定することによってのpHiを監視（ ふぃぎゅ再3）。

哺乳動物細胞内で3.3ナノセンサーの場所

1. （TAMRAの蛍光発光は、リソトラッカーレッドと同じスペクトル領域であるためである）のセクション3.2で説明したように唯一のFAM色素を含んだナノセンサーで細胞を培養する。セクション1.1ではなく、準備とTAMRAの追加を省略して説明したように、これらのナノセンサーを準備します。
2. ナノセンサー納期次の50nmのリソトラッカーレッド原液を希釈。
3. PLGA足場上に培養した細胞に希釈した溶液（2μL）の一定量を追加します。
4. 1時間リソトラッカーレッドで細胞をインキュベートする（37℃、5％CO _2）。
5. インキュベーション期間の後メディアを取り出し、共焦点顕微鏡を用いて観察するための準備でPBS（pH7.4）中（2ml）中にメディアを変更する前に、PBS（pH7.4）で細胞を2回洗浄する。注：フェノールレッドを含まない培地の代わりにPBSを使用することができる。
6. 核染色をDraを追加PBSへのQ5は最終的な濃度は、5程度であると3分（37℃、5％CO _2）のための細胞を用いて培養する。それはDRAQ5とのインキュベーション期間の後、メディアを変更する必要がない。
7. 650、、唯一のナノセンサーDRAQ5発色団を励起し、500から530ナノメートル、580から600 nmの蛍光を観察するためにリソトラッカーレッドと633 nmのヘリウム/ネオンレーザーを励起する568 nmのクリプトンレーザーをFAMを励起する488 nmのアルゴンレーザーを使用して、それぞれ-750ナノメートル（ 図3）。励起波長のコレクションを回避するために、順次走査を使用しています。

結果

調製されたpH応答性ナノセンサーのサイズ分布は、撮像されたナノセンサーの集団を測定し、240から470ナノメートル（ 図1A）の範囲のナノメートル寸法を有することが見出されたSEMを用いて特徴付けた。狭いと合理的に小さな直径の達成は、ナノ粒子を調製するためにストーバー法を用いてと一致する。これは、酸性条件を用いて調製粒子サイズの幅広い分散を生成するのに対し、ナノ粒子はストーバー法を用いたナノ粒子の合成中に塩基性のpH環境を用いて調製すなわち 、大きさの良好な制御を可能にすることが見出された。記載された方法を使用して製造PLGAの電界紡糸繊維の代表的なSEM顕微鏡写真を作製PLGA足場は、繊維はナノメートル寸法を有する最小のビーディングや破損を表示する不織布の繊維で構成されていることを実証する図1Bに示されている。 図1C 5ミリグラムの濃度のPLGA溶液にナノセンサーの添加は/ mLの図1Bの対照試料に匹敵する繊維は、SEM顕微鏡写真は、繊維の表面にナノセンサーの関...

ディスカッション

組織工学は、特定の組織または器官の機能を修復、交換、維持または増強するためにインビトロでの組織モデルのようなin vivoおよび組織置換療法における両方として使用することができる生物学的代替物を作り出すことを目指し。合成代替物は、組織の修復を置き換えるか援助するために長年使用されてきたが、これらは多くの場合、最終的には拒絶またはさらなる修正手術につながる宿主組織および/または感染貧​​統合によるフェイル。移植前に実験室で生体組織を生成する完全な統合を達成するための問題に対処し、修正手術の必要性を減らすことができる。しかし、実現するために、この目標のために、適切なin vitroで増殖し、3D構造内の細胞の操作は、in vitroでの組織の適切な物理的条件付けと連結する必要があります。これは、一つの基本的な生物学の研究を継続することである多数の方法で達成することができる関与だけでなく、合成代替の生産に関連エンジニアリングと製造の問題を研究する。それが説明されたプロトコルが貢献することを目指していることを、この後者の問題です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エタノール	フィ	ッシャー32221
水ジメチルホルムアミド(DMF)	シグマ	270547
水酸化アンモニウム50%(v / v)水溶液	アルファエー	ザー35574	純水で30%(v / v)に希釈
TEOS	Sigma	13190-3
3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)	Sigma	A3648
5-(and-6)-カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル (FAM-SE)	Invitrogen	C1311
6-カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル (TAMRA-SE)	Invitrogen	C1171
リン酸ナトリウム一塩基性 (0.2 M)	Sigma Aldrich	S-9638
リン酸二塩基性ナトリウム (0.2 M)	Sigma	Aldrich S-0876
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
トリプシン/EDTA	シグマ アルドリッチ	T4174
ペニシリン/ストレプトマイシン	シグマ アルドリッチ	P0781
PBS	シグマ アルドリッチ	D8537
DMEM	シグマ アルドリッチ	D6046
FBS	ソース バイオサイエンス	バッチ-213-101992
L-グルタミン	シグマ アルドリッチ	G7513
リポフェクタミン 2000	Invitrogen	11668-019
Optimem	Invitrogen	11058-021
LysoTracker Red	Invitrogen	L-7528
Draq5	Biostatus Ltd	DR50050
窒素ガス	BOC
DCM	Sigma Aldrich	320269
TFA	Sigma Aldrich	T6508
共焦点顕微鏡	Leica TCS-SP		アルゴンレーザーとクリプトンレーザー、63X 0.9NA 水浸レンズ
UV光	UVLS28 UVP、USA
スターラープレート	SB161-3 Jencons-PLS
pH meter	Jenway model 3510
ロータリーエバポレーター	ブチロータリーエバポレーター R200
遠心分離機(ナノセンサー)	Hermle Z300
遠心分離機(細胞培養)	Thermo Scientific ヘレウス バイオフージ プリモ
ボルテックス	Whirlimixer フィッシャーブランド
超音波処理器	FB11021 フィッシャーブランド
アルミニウムシート	ノッティンガム大学
35mm細胞培養プレート	いわき	3000035
10mlシリンジ	ベクトン・ディッケンソン
3T3 線維芽細胞	ヨーロッパ細胞コレクション 細胞培養の
PLGA	レイクショアバイオマテリアルズ	7525 DLG 7E
ギ酸ピリジニウム	Sigma Aldrich	P8535
トリパンブルー	Sigma Aldrich	T8154
ナトリウム一塩基性	シグマアルドリッチ	S9638
ナトリウム二塩基性	シグマアルドリッチ	S5136HCl
	シグマアルドリッチ	320331