二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

サマリー

ヒト肝細胞の単離のための修飾された二工程コラゲナーゼ灌流手順が記載されている。この方法はまた、他の哺乳動物の肝臓にも適用することができる。単離された肝細胞は、それらのような肝臓の再生、薬物動態および毒物学などの分野での科学的研究に適したモデル作り、高い収率および生存度で提供されています。

要約

肝臓、例外的な再生能力を有する器官は、解毒、代謝及び恒常性などの機能の広い範囲を実行する。このように、肝細胞は、研究課題の多種多様のための重要なモデルである。特に、ヒト肝細胞の使用は、薬物動態、毒性、肝再生および翻訳研究の分野で特に重要である。したがって、この方法は、Seglen ¹によって記載されるように肝細胞を単離するために2段階コラゲナーゼ灌流手順の修正版を提示する。

以前に、肝細胞は、機械的な方法によって単離されている。しかし、酵素法は、肝細胞が分離した後にその構造的完全性と機能を保持するように優れていることが示されている。ここで紹介するこの方法は、77±10％の生存と肝細胞の大規模な収率でヒトの肝臓片と結果に対するラットの肝臓のために以前に設計された方法を適応させる。メインこの手順の違いは、血管のカニューレ挿入するプロセスである。また、ここで説明する方法はまた、匹敵する肝臓または血管サイズを有する他の種由来の肝臓に適用することができる。

概要

肝細胞懸濁液を機械的または酵素的方法によって肝臓から調製することができる。全体の肝細胞を調製するために使用される機械的な方法は、チーズクロス²を介して肝臓を強制カーンシェーカー³におけるガラスビーズの肝臓片を振盪、長年にわたりなど緩い乳棒^4,5有するガラスホモジナイザーを用いて、機械的な方法は、外に落ちて含むにより、細胞膜の損傷と単離肝細胞^6,7の機能喪失に有利に働く。したがって、酵素的方法の使用は、現在、肝細胞の単離のための主要な方法である。

ベリーと友達^8は 、ラットにおける門脈経由で肝臓をコラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼを灌流したとき、酵素法を用いて肝細胞の単離は大きく改善されました。この灌流過程を導く、酵素は細胞の大部分に密着できるようにするために血管系を利用した肝細胞⁸の収量の6倍の増加。さらに、この方法は、事実上孤立小胞への小胞体の変換なしなしミトコンドリア損傷⁸で、その構造的完全性を保持された細胞が得られた。

この方法は、肝細胞の単離のために二段階灌流手順を開拓Seglen ¹によって改変した。この手順では、ラットの肝臓のCa ^{2 +を}含有する¹コラゲナーゼ緩衝液で灌流、続いてのCa ^{2 +}を含まない緩衝液で灌流される。第二工程におけるCa ^{2 +}の添加は、最適なコラゲナーゼ活性^1,9に必要とされている間第一工程におけるCa ^{2 +}の除去は、デスモソームを破壊するのに役立つ。

上記の発表された研究は、ラットで行われたことを考えると、この記事では、ハムから高い生存して肝細胞の単離に使用することができます変更された手順を実証することを目的と肝臓。ヒト肝細胞の使用は、トランスレーショナル研究のための動物モデルを用いた実験を検証するための重要なままです。本研究で用いたヒト肝臓片を、ヒト組織および細胞研究基金、国営の非営利財団¹⁰を通じてガバナンスの同意を得て取得した。病理学者は、診断のために必要であったものを除去した後、肝臓片を残りの組織から採取した。病理学者によって区画さ組織は、形態学的に肝切除後の切除縁から得た健康な組織だった。

プロトコル

1。灌流および分離された溶液の調製

1. 肝臓片と、表1によると、肝細胞の単離灌流のために必要なソリューションを準備します。溶液は使用時まで4℃で保存することができる。
2. 無菌フィルター0.22μmのフィルターを使用して、すべてのソリューションを提供しています。
3. 肝臓と接触するすべてのソリューションは無菌でなければならない。

2。灌流機器とソリューションの作成

1. 図1に示すように、肝臓片の灌流のための機器は、セットアップする必要があります。
2. 水浴は、それらが肝臓片に到達したときに溶液が37℃の温度であるように、各特定の実験設定で異なる適切な温度に設定されるべきである。この場合には、水浴を溶液1,2および3とジャケット付きガラス凝縮器を温めるために41°Cに設定されている。溶液4に温めべきであるコラゲナーゼ活性の損失を低減するために使用するための別個の水浴中で37℃で。
3. まもなく肝灌流の前に、酸素化装置（ 図1E）をガスに95％のO _{2/5％CO 2を}含むガスのタンクのレギュレータをオンにします。

3。肝臓の灌流

1. 肝臓ピースできるだけ多くそのままグリソン鞘と、理想的には唯一の1切断面には、灌流のための病理学者から入手する必要があります。
2. 有孔フィルターディスク（ 図1B）が含まれてブフナー漏斗上、この肝臓ピースを置きます。
3. 灌流システムは、ソリューション1で下塗りする必要があります。
4. 低流量で、オリーブ先端を有する湾曲灌注カニューレは、肝臓片の切断面に大きな血管内に挿入されるべきである。血液が肝臓から洗い流すように、組織はよい潅流地域で軽くなる。様々なサイズのために使用さカニューレの数肝臓の図2Aに示されている。選択されたゲージのサイズが所定の位置にカニューレを保持するぴったりフィットをもたらすべきである。小さい血管が肝臓片の外に排出する灌流液のためオープンにしてください。
5. 肝臓（ 図2B）のサイズに応じて、ml /分110-460の間に蠕動ポンプでの流量を増加させる。これは、カニューレあたり44±16 ml /分（ 図2C）の平均流量をもたらす。選択した速度は、肝臓片に依存し、肝臓片のわずかにプランピングアップにつながるはずです。いくつかの場合においては、上述したわずかなプランピングを達成するために、微小血管クランプを備えた開放血管の一部を遮断クランプする必要があるかもしれない。肝臓片は全体を通して明るい色である場合に良好な灌流を観察することができる。
6. 生理食塩水に浸したガーゼで覆うことにより、灌流中の湿った肝作品を保管してください。
7. 任意のRを洗い流すためのソリューション1 1Lで灌流肝臓枚で血をemaining。
8. 解決策2に灌流液を変更し、10分間灌流する。
9. 解決策3に潅流液を切り替えて、0.5 Lで灌流
10. コラゲナーゼ（ 表2）の0.1から0.15パーセントを含む溶液4に灌流液を変更します。
11. 肝臓が十分に消化されるまで、このステップでは、灌流は9月12日分の再循環方法で実施あるいはすべきである肝組織はグリソン鞘の下に離れて少し破っての鈍側でプローブ時に軟化感じるように表示されます小刀。

4。肝細胞を単離する

1. 蠕動ポンプの電源を切り、肝臓片からカニューレを取り外します。
2. ソリューション5 100〜200 mlを含む結晶皿で肝ピースを置きます。
3. 慎重にグリソン鞘を外し、静かにセルを横に振る。よく灌流されていない領域がある場合は、外科用メスを介して切断するために使用することができるこれらの領域は、中に含まれる細胞を放出する。プロセス中に必要に応じてより多くのソリューション5を追加します。
4. 500ミリリットルの最終体積に達するまで、より多くのソリューションの追加5。
5. 二回細胞懸濁液をフィルタリング、最初の70ミクロンのナイロンメッシュに続いて210ミクロンのナイロンメッシュ。次に、30mlを200ml遠心管に細胞懸濁液を注ぐ。
6. 4℃で5分間、72 gで細胞懸濁液を遠心分離上清を吸引し、ゆっくりと溶液5の200ミリリットル中に静かに細胞ペレットを再懸濁します。
7. 洗浄工程数4.6 3回繰り返します。最後の遠心分離ステップで、（材料のリストを参照）低温貯蔵溶液中で細胞を再懸濁。細胞は血球計数器ベースのトリパンブルー排除アッセイを用いて収量と生存性の評価のためのミリリットル当たり約2から5000000肝細胞である必要があります。
8. トリパンブルー排除アッセイを実施するために、パンブルーsolutiの0.5ミリリットルを含む微量遠心管に（≈2から5000000 / ml）を適切に希釈した細胞の0.1ミリリットルを追加オン（リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解し、0.4％トリパンブルー）と0.4mlのPBS。完全に細胞懸濁液を混合した後、懸濁液を血球計数器をロードし、100Xの倍率で顕微鏡下で調べる。生きた細胞は染色されていない表示されている間、顕微鏡下では、死んだ細胞が青く染色されます。血球計数器上にマークさ1ミリメートル²のグリッドのそれぞれに住んでいて、全細胞の数を数える。生存率（％）、生細胞（中低温貯蔵溶液あたり百万肝細胞（CSS）又はg肝臓肝細胞あたり百万）の収率は以下の式を用いて計算することができる。

注：この場合には、トリパンブルー希釈係数は10であり、血球計係数は、10,000である。

結果

灌流セットアップ

肝灌流に必要な機器は、 図1に応じて設定する必要があります。

単離されたヒト肝細胞の生存率および収量

単離されたヒト肝細胞の平均生存率は77±10％であった肝細胞の平均収量は、平均値±標準偏差として表される値を使用して、13±1100万肝細胞/ g肝臓であった。肝細胞の単離の数は、648アイソレーションは、1999年1月から2012年12月から実施されたこれらの平均を得るために実施。

適切な灌流パラメータ

成功したフラッシングおよび肝臓の灌流を行うために、使用されるカニューレの数は、肝臓（ 図2A）の重量に応じて変化すべきである。一般的に、4〜8カニューレは20グラム、下から80グラム以上に及ぶ肝臓のために使用されるべきである。潅流の適切な速度また、肝臓重量に依存する、肝臓（ 図2B<...

ディスカッション

このプロトコルは、高い生存率および純度のヒト肝細胞を単離することになる。これらの結果を達成するためには、肝臓の適切な個数で開始することが重要である。肝臓の一部は、1切断面を除くすべての表面上でそのままグリソン鞘を持つ必要があります。別の重要な要因は、異なるバッチの消化後¹¹肝細胞の生存率の著しい違いをもたらすことができるように、使用されるコラゲナーゼの特定のバッチである。したがって、コラゲナーゼの異なるバッチを試験されるべきであり、最高の生存率肝細胞を生成するバッチを大量に得られるべきである。最後に、適当な消化時間は、得られた細胞の収率および生存能力に基づいて選択されな​​ければならない。例えば、低利回りの高い生存率が不十分な消化時間を示している可能性があり、低生存能力の高収量は消化時間が長すぎることを示している可能性があります。

この方法では、tは適合させることができるO同じ肝臓片から非実質細胞と肝細胞を分離します。これを行う一つの方法は、非実質細胞の単離¹²に直接最初の遠心分離ステップ（ステップ4.6）からの上清を使用することである。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バブルトラップ	Gaßグラステニク
ガラスジャケットコンデンサーGa	ßグラステニク
41度;C ウォーターバス	ジュラボ	35723-H24/EG&	nbsp;
37度;C ウォーターバス	GFL	1083
圧縮ガスボンベ(95 % O2/5 % CO2)	Linde
ガス透過性チューブ	Neolab	2-4440
蠕動ポンプ	Ismatec	IP65
メス	フェ	ザー320010
鉗子	オムニラボ	5171014
円錐形フラスコ 1 L	Schott Duran	2121654
円錐形フラスコ 5 L	Schott Duran	2121673
ビーカー	ショット・デュラン	2110654
200 ml遠心分離管ベ	クトンディキンソン	352075
結晶化皿	オムニラボ	5144063
ボールチップ付き湾曲灌漑カニューレ	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL&	nbsp;
マイクロ血管クランプ	Ernst Kratz GmbH
Büchner漏斗	カールロス	HT38.1
ナイロンメッシュ210 μm	ネオラボ	4-1413
ナイロンメッシュ70 μm	ネオラボ	4-1419
0.22 以上 μ;m 滅菌フィルター	Peske	99505
500mlボトルショット	デュラン	2180144
1 Lボトルショット	デュラン	2180154
血球計算盤	Peske	06-0001
1.5 mlチューブ	Eppendorf	0030 120,086
50 mlコニカルチューブBD	Biosciences	352070
アイスバケツ	ネオラボ	1508454
滅菌パスツールピペット	ブランド	747715
電動ピペットフィラー(ピペットボーイacu)	インテグラ155017
冷蔵遠心分離機	Eppendorf	5810R
層流	ケンドロ	ヘラ安全-KS9
アスピレーター(低流量医療用吸引ポンプ)	Atmos	C361
実験室用ガスバーナー	インテグラ	Fire Boy eco
使い捨て白衣	Paperlynen GmbH	MD0202414
バイザー付きサージカルマスク	Kimberly-Clark	48247
手術用フード	Barrier	42072
ラテックス手袋	Semper Care	CE0321
コラゲナーゼ(バッチ番号 NB 4G)	Serva	17465
塩化カルシウム二水和物	ク	2382
EGTA	Sigma	E4378
塩化ナトリウム	Roth	9265.2
ヘペス	ロス	9105.3
塩化カリウム	Serva	26868
アルブミン	バイオモール	01400-2
グルコース	セルバ	22700
炭酸水素ナトリウム	Serva	30180
0.4%トリパンブルー溶液	ロンザ	17-942E
冷蔵ソリューション	Hepacult GmbH