STA-PUTの速度沈降を使用して造精細胞型の分離

Summary

STA-PUTメソッドは、大きさや密度に基づいて精子形成細胞の異なる集団の分離を可能にする。

Abstract

哺乳類の精子形成は、精巣の精細管にいくつかの段階で発生する複雑な分化過程である。現在のところ、 インビトロでの精子形成の分化を可能にする信頼性のある細胞培養系がなく、精子形成細胞のほとんどの生物学的研究は、マウスおよびラットのような動物モデルからの組織採取を必要とする。非精子形成（ライディッヒ、セルトリ、骨髄、および上皮細胞）および精子形成の両方（精原細胞、精母細胞、円形精子細胞、精子細胞および精子を凝縮） - - 精巣は多数の細胞型が含まれているため、精子形成に関与する生物学的メカニズムの研究を隔離を必要とするこれらの異なる細胞型の富化。この場合、精巣から - - BSA線形勾配を介してSTA-PUT方法は、不均一な細胞集団の分離を可能にする。個々の細胞型は、CEのに応じて異なる沈降速度で沈降llのサイズ、および異なる細胞型について富化画分を回収し、さらなる分析に利用することができる。 STA-PUT方法は、特定の細胞選別法を用いて得ることができるように、 例えば、細胞型の高純度画分をもたらさないが、各画分中の全細胞のより高い収量を提供しない
（7-8×10 ⁸細胞の出発集団から〜1×10 ⁸個/精子形成細胞型）。この高い収率メソッドは特殊なガラス容器を必要とし、蛍光活性化セルソーター（FACS）又は水簸機等の特殊な装置へのアクセスが限られているラボのための理想的な方法で製造する、任意の低温室又は大冷蔵庫で行うことができる。

Introduction

哺乳類の精子形成は精巣¹の精細管にいくつかの段階で発生する複雑な分化過程である。簡単に言うと、精細管の格差の上皮の近くに存在する精原細胞のような幹、その後減数分裂を起こす精母細胞に分化。減数分裂が完了した後、得られた半数体細胞、または円形精子細胞は、精子、細胞質及び核の圧縮の脱落を伴う分化プロセスを受ける。精子細胞は徐々に、それぞれ、鞭毛を開発し、核の伸びや、結露を起こし、伸長してから凝縮する精子細胞を生成する。最終製品は、精細管の内腔に放出され、最終的に、彼らは、さらに成熟精巣上体にしている精子、です。

精子形成のプロセスは、特殊なホルモンや分子の状態に依存しているため精巣は、精子形成の全過程のための信頼できるインビトロ培養系は、まだ^2,3開発されていない。培養方法は、幹細胞から「始原生殖細胞様細胞」および半数体、「円形精子細胞様細胞」を作成するために開発されてきたが、これらの方法はまだ、これらの細胞を大量に生成し、それ以降の精子形成細胞を生成するために失敗することができない種類^4,5。幸いなことに、精子細胞型は液体勾配で分離されるべき全体の精巣から得られた単一細胞懸濁液を可能にする、サイズが大きく異なる。 STA-PUTメソッドは、ここに証明し、大きさや質量^6-9に基づいて精子形成細胞を分離するための直線のBSA勾配とシンプルな沈降を使用しています。

FACSおよび水簸^{10-13：STA-PUT}方法は精子形成細胞タイプを分離する他の二つの最も広く使用されている方法に勝るいくつかの利点を有する。 STA-PUT装置は、ONLが必要です寒い部屋や大きな冷蔵庫に組み立て専門のガラス器のY数枚。このように、セルソーター又は水簸機を使用するよりも安価である。 STA-PUT方法は、各細胞集団の純度はFACS ¹¹で得られたものほど高くはないが、匹敵する時間枠内FACSによってソートすることができるよりも、細胞型および精巣あたりの細胞のより高い量をもたらす。磁気ビーズを用いて細胞選別（ソーティング磁気活性化細胞、MACS）は最近成功した混合精巣細胞集団から精原細胞の濃縮のために用いられてきたが、現在による適切な表面マーカー¹⁴についての知識の欠如のために精母細胞または精子細胞を分離するには不向きである。 MACSまたはFACSオーバーSTA-PUT方法のさらなる利点は、ほとんどのFACSプロトコルとは対照的に、それは任意のDNA染色又は他のタイプを必要としないので、その後の培養に適した生存可能な細胞を単離する能力である。 Lを必要とする研究のため精子形成細胞の種類のアーゲ収率は約90％の純度で、STA-PUTは、理想的な方法である。

Protocol

STA-PUTプロトコルは、3つの段階を含む：1）全体の精巣から細胞懸濁液の装置および試薬、2）準備、3）セルの負荷、沈降、およびフラクションコレクションのセットアップします。 2人の研究者のチームによって行われた場合に、プロトコルは、平均して8時間かかります。

1。 STA-PUT装置を設定します（図1）

*** STA-PUT装置は、4℃、大規模な冷蔵庫やコレクションの方法を優先する場合にも、フラクションコレクターを収容することができ、低温室に配置する必要があります。

1. 前（あるいは、少なくとも数時間前）には、メソッドを実行する夜は、すべての機器（特に、ガラス製品、チューブ）を洗って、70％エタノールで滅菌する。完全に、図1に示すような装置を組み立てる前に、機器を乾燥させる。
2. （二L 2シリンダ（ 図 1BおよびC）および細胞装填室を確保図1A）トップのプラットフォームへとチューブクランプでチューブの2小片ですべてを接続してください。クランプすべての管が閉鎖した。右端の2Lのシリンダーに注ぎ口をシール。
3. 細胞装填室の小さな撹拌棒（ 図1A）、2％BSAを含むことになる左端の2 Lのシリンダ内のより大きな撹拌棒（ 図1B）を配置します。
4. プラットフォーム（ 図1D）に2リットルの沈殿槽を配置します。沈殿槽（ 図1D）の下部の開口部の上に直接金属バッフル（ 図1F）を配置します。バッフルはフラクションコレクションの間の細胞勾配の液体と混乱のボルテックスを防ぐため、これは非常に重要です。沈殿槽の上にふたをする。
5. 三方活栓（ 図1G）のすりガラスジョイントに真空グリースを微量塗布した後、それ自体の底部にストップコックをクランプストップコックおよび沈降室のすりガラス継手を接続するdimentationチャンバ。
6. チューブと活栓の右アウトレットに細胞装填室（ 図1A）を接続します。ストップコックを閉じます。
7. 活栓の左アウトレットに細胞分画チューブを取り付けます。分画チューブは開放端に接続されたガラスパスツールピペットを用いてチューブの一部を含む。小さなボアチューブ片をガラスピペットの狭い方の端に取り付けられている。狭いピペットは、フラクション回収時の細胞懸濁液の流れを制限する。一番下に、この小さなチューブをクランプする。
8. 2 Lクレブスを準備（1X）の実験（ 表1）の日をバッファリング。その後、1Xクレブス、1Xクレブス中550ミリリットルの4％BSA、および1Xクレブス中の50ミリリットル、0.5％BSA中550ミリリットルの2％BSAを準備します。濾過し、4℃にこれらのソリューションを冷却
9. 右L 2シリンダ（ 図1C）及び2％のBSA中の4％BSA溶液を注ぐ左2Lのシリンダ（ 図1B）内の溶液。必ずこれらのシリンダをつなぐチューブに大きな気泡がないことを確認。
10. セル負荷室にKrebs緩衝を注ぎ、沈殿槽で、このチャンバーを接続する配管を埋め、これらは勾配を乱す可能性があるので、確認して大きな気泡が存在しないこと。優しくチューブを絞るか、フリックすると、気泡を除去するのに役立ちます。クレブス緩衝液のすべてがチューブ内ではなく、セル室にあることを確認します。
11. クレブス緩衝液に少量の沈殿槽に流入した後、チューブを充填し、任​​意の大きな気泡を除去するために細胞分画チューブにほぼすべてのバッファを流出させる。
12. 直接沈殿槽の下にフラクションコレクターを配置します。すべての端数管が適切に配置され、汚染を防止するために、プラスチック製のラップで覆いいることを確認してください。

2。全精巣から造精細胞を単離する

1. あらゆる汚染物質を洗い流すために、室温でクレブス緩衝液中のCA 12成体マウス（好ましくは、少なくとも8週齢）および場所から精巣を解剖。例示されてこのプロトコルは、実験用マウスの使用を必要とするし、ペンシルベニア大学の制度的動物実験委員会のガイドラインに従って実行されました。
2. あなたは精細管を追加する予定直前コニカルチューブ内の50ミリリットルKrebs緩衝液に45 mgのコラゲナーゼを追加します。このソリューションは、数分間33℃まで加熱することができます。 2 50ミリリットルコニカルチューブに均等に分割します。
3. 白膜を破棄し、精細管を解放し、8ミリリットルクレブス緩衝液を含有する別のプレートに精巣をカプセル解除。白膜は、精細管を包囲する薄い膜である。細管は容易に白膜からデタッチする必要があります。これを行うには、白膜の切開を行い、PAIでこの膜を開催鉗子のR、および鉗子の別のペアでから離れて膜から細管を押してください。
4. コラゲナーゼ溶液25mlを含む各コニカルチューブに細管を含む4ミリリットルクレブス緩衝液を加え、10分間33℃で振とう、インキュベートする。最後には、細管は「スパゲッ​​ティ状」の外観を持っている必要があります。
5. 細管は、チューブの底に約5分間沈降することができます。上澄みを注ぐと細管をチューブの底に毎回沈降させ、（室温）25ミリリットルKrebs緩衝液で2倍を洗う。各チューブの中で〜5ミリリットルクレブス緩衝液を残す。
6. 洗いながら、あなたは精細管を追加する予定直前ファルコンチューブに50ミリリットルKrebs緩衝液に30mgのトリプシンを追加します。このソリューションは、数分間33℃まで加熱することができます。 2 50ミリリットルコニカルチューブに均等に分割します。
7. 25ミリリットル細管を含む2チューブの各々にトリプシン溶液を加える。セルを防ぐために、各チューブに3μgのDNA分解酵素（1μg/10ml）を追加凝集からのS。 10分間33℃で、揺れ、インキュベートする。
8. 約10倍とアウトそれらをペッティング、細管を含む溶液を撹拌するワイドボアピペットを使用してください。ソリューションは、複数の単一細胞懸濁液のように見えるを開始する必要があります。
9. さらに10分間33℃で、揺れ、インキュベートする。約25倍に出入りしてピペッティング、単一細胞懸濁液中に細管を分散させるために広い口径のピペットを使用してください。それでも細管あるいは細胞塊がたくさん表示された場合は、ピペットを用いてより多くの分散および/または、各チューブへの別の3100μgのDNA分解酵素（二重初期濃度）を追加します。
10. 100μmのメッシュセルストレーナー（30ml mlの細胞懸濁液を各チューブに1つ）を介して単一細胞懸濁液をろ過する。細胞懸濁液を結合し、細胞の総数を（7-8×10 ^8個の細胞の間にあるべきである）カウントされます。 ***勾配上に以上800,000,000細胞をロードしないでください。
11. ステップ2.10で得られた細胞数に基づいて、approprをペレットiate 5分間450 RCFでフィルタ処理する細胞の体積と30ミリリットルクレブス緩衝液で洗浄する。繰り返します。 ***通常22精巣は、複数の800,000,000の細胞が得られますが、この細胞の数を超えてセットしないでください。
12. 丁寧に泡立てない（細胞凝集の程度に応じて）DNA分解酵素μgの2.5〜5を含む25ミリリットルの0.5％BSAで細胞を懸濁します。細胞が凝集しないことを確認してください。 100μmのメッシュセルストレーナーを通して単一細胞懸濁液をろ過する。セルは現在、ロードする準備ができました。チューブを数回転倒ロードする前に、よく混ぜる。

3。セル負荷および沈降

1. 必ずストップコックが閉じているが、液体沈降室（ 図1D）中に細胞チャンバ（ 図1A）から流れることを可能にする位置で行った。
2. ゆっくりと攪拌棒が連続的に移動できるように設定を低（約70回転）の両方撹拌棒板を回しますが、。
3. 細胞チャンバ（ 図1A）内に細胞懸濁液を注ぎ、細胞を、10ml /分（ 図1D）のレートで堆積チャンバ内に徐々に流入するようにストップコックを開く。ストップコックを閉じます。流量は、堆積チャンバのボリュームの間隔をマークすることによって決定することができる。
4. 細胞チャンバ内に0.5％BSA溶液5mlを注ぎ、10ml /分の速度で沈殿槽に排出。ストップコックを閉じます。この工程は、細胞チャンバから細胞を洗浄します。 4Xを繰り返します。
5. 勾配を準備します。セル室（ 図1A）と2 2Lのボンベ（ 図1BとC）の間にクランプを開き、40ミリリットル/分の速度（ 図1D）で沈殿槽に液体を排出するために始めるすぐに。それが沈降室に、BSA勾配をロードするのに約20〜30分かかりますので、流量を調整します。の上に横たわっている細胞の薄い、乱されていない層BSAの勾配が表示されるはずです。 BSAのほとんどがロードされると、ストップコックを閉じ、液体は分別管内に沈殿槽から排出することを可能にする位置に回します。
6. 撹拌プレートをオフにします。
7. 細胞は1時間45分間沈降することができます。この時間の間に装置を乱すことがありません。任意の機械的攪拌は、グラデーションを乱す可能性があります。

4。画分の分別と分析

あなたは、次の手順を実行し、***、勾配を乱さないように注意してください。 BSA勾配が乱れている場合は、手順が動作しません！

1. 細胞が沈殿した後、徐々に50ミリリットルコニカルチューブに沈殿槽から50ミリリットルを排出し、脇に置きます。この画分は、通常の細胞と破片の不要な塊が含まれています。
2. フラクションコレクターに端数チューブを取り付けます。 ***フラクションコレならば手作業でフラクションを収集することも可能であるctorのは使用できません。
3. 画分を収集します。（1コレクションチューブに充填する）10ミリリットル毎45秒を収集されるように、ストップコックで流量を調整します。
4. フラクションコレクションチューブに蓋をし、4℃で450 RCFで5分間スピン、そっと上澄みを捨て、残りの液体中に細胞を再懸濁し、氷上で細胞を維持する。
5. すべての画分が収集されると、微視的に異なる細胞集団のための画分を分析する。異なる細胞型は、細胞サイズおよび核の形態^8,15に基づいて区別することができる。 図2（a）は体細胞および減数分裂細胞および精原細胞について富化された3つのプールされた画分を、（b）は、円形精子細胞のための「代表的な結果」を示し、 （C）精子細胞を伸長と凝縮。
   • 精原細胞を入力して12-14μmのCAのです。直径とクロマチン組成が均質で丸い核を持っている。
   • B型精原8-9μmのCAのです。直径とrounている核周辺部に沿ってより密度の高いヘテロクロマチンを示してD核。
   • 前細糸期の精母細胞は7.5-8.2μmのCAです。直径、タイプB精原細胞より小さい細胞質を持っており、B型精原細胞と同様に見える核を持っている。
   • 細糸期精母細胞は、8月10日100μMのCAです。直径と事前細糸期の精母細胞と同様に見えますが、核膜でより密なクロマチンを得るように見える核を持っている。
   • 接合期精母細胞は、10月12日100μMのCAです。直径と細糸期精母細胞と同様に見える核を持っている。
   • パキテン期の精母細胞は、任意の場所に12〜18ミクロンのCAからである。直径と大きな核を取り巻く細胞質の細いリムで構成されています。密なクロマチンのより多くの塊が核内で見ることができます。
   • 丸い精子細胞は、10μmCAです。直径と中央の密集染色染色中心と丸い核を持っている。
   • 残余体は直径〜6.5μmであり、円形で、核を欠いている。
   • 伸長と凝縮精子細胞は、精子細胞を丸める大きさが似ていますが、ユニークな、鎌形核を持っている。
   1. 分15で始まり、85までのすべての5画分を分析。通常、15以下の画分をすぎて混合し、塊状となり、85以上の画分を、使用可能な細胞にいくつか含まれています。
   2. 割合を分析するには、（細胞を遠心分離した後再懸濁されたら）画のコレクションチューブから液体5μlのを取り、クレブス緩衝液は8％ホルムアルデヒド5μlのに追加。固定した細胞は、5分間室温で静置する。
   3. 固定した細胞を0.1％トリトンおよびDAPI（5μ/ mlのクレブス緩衝液）5μlのを追加します。細胞を、5分間室温で静置する。
   4. 、スライド上に得られた溶液を10μlを置きカバーガラスでカバーし、各画分の純度を決定するために、蛍光顕微鏡で分析します。
   5. 減数分裂と体二倍体細胞、円形精子および伸長/凝縮する精子細胞：大きさや核の形態が類似している細胞の次の集団を作成する（「代表的な結果」を参照）の分画を結合します。

Results

STA-PUTプロシージャから理想的な結果は、細胞の大きさおよび密度に基づいて、精巣からの細胞のかなり目立つ分離である。精巣から単離された細胞は、BSA勾配を介して沈降しているが、細胞のいくつかの別個のバンドが観察することができる。セルのいずれか塊は勾配の底に沈むようにし、他の画分を汚染しない傾向があります。もう少し勾配までは、大規模な体細胞および減数分裂細胞である。遠く勾配までは、まだ小さい円形精子細胞になります。勾配の上部に精子細胞、精子、赤血球を汚染する（これらは、核なしで小円形細胞であると思われる）、凝縮されます。

画分は、光及び蛍光顕微鏡法（図^2）15の組み合わせを用いて迅速に分析することができる。減数分裂、精子、および体二倍体細胞は精巣で見つかった最大の細胞であり、relatiを染色に大きな核が含まれていますvely均一にDAPIで。丸い精子細胞は、一般的に明るく染色染色中心で、小さく丸い核を有する小さい細胞である。凝縮さ/伸長精子細胞は、小さな尾が形成されているかのように、多くの場合、楕円形に見える小さな細胞で...

Discussion

信頼性の高い細胞培養系は、まだすべての精子形成細胞タイプ^3を生成するために存在していないとして、精子形成を研究者たちは、精子形成細胞サンプルのための動物モデルに依存しています。精子形成細胞が容易に全体の精巣から収集しているが、唯一の混合集団をもたらす。これは、減数分裂細胞、円形精子、と凝縮精子細胞など、これらの細胞の特定のサブタイプを、勉強したい人のための問題となる。 FACSは、STA-入れ、水簸^6月13日 ：3つの異なる方法は、現在、精子形成細胞のこれらのサブタイプを分離するために使用される。それぞれ、セルソーターや水簸機：後者の二つの方法は、機器の高価な部分へのアクセスを必要とする。 FACS法は、精子形成の異なる細胞型の高度に純粋な集団が得られるものの、処理は6時間かかり2〜3睾丸当たり¹¹細胞タイプごとに0.5〜2.0×10 ^6個の細胞が得られる。 STA-PUTメタ様水簸、OD、大きさや密度に基づいて細胞を分離したが、STA-PUT装置よりも高価である水簸機へのアクセスを必要とします。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternateが使用できます。
0.5%、2%、および4%BSA溶液	を0.25 g、11 g、および22 g(それぞれ)を総容量50 mL、550 ml、および550 mlの1x KREBS(それぞれ)に溶解します。	STA-PUT手続きの日にします。フィルター滅菌します。
KREBS (10x)	3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g デキストロース + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl、 ddH20	オートクレーブ/フィルターで2Lに持ってきて、4°Cで保管します。数ヶ月間C。
KREBS (1x)	4.24 g NaHCO3 を 100 ml ddH20 に溶解します。200ml 10x KREBSを加えます。ddH20で2Lにします。	STA-PUT手続きの日にします。フィルター滅菌します。
コラゲナーゼ	Σ	C9891-1G
DNAse	Σ	DNEP-5MG
トリプシン	Σ	T9201-1G
DAPI	研究者
Triton-X100	研究者
ホルムアルデヒド (~37%)	研究者
表 2: 機器
会社		カタログ #	コメント
完全な STA-PUT 装置	プロサイエンス ガラスショップ	STA-PUT(この手順では、標準の沈殿チャンバーを使用します。No. 56700-500)	装置用の全てのガラス製品および機器を含みます。より小さなセル番号でSTA-PUTを実行するための代替ガラス器具が利用可能です。
10 μmメッシュフィルター	フィッシャーブランド	22363549
マウス解剖ツール	研究者
キャップ付き丸底14mlフラクションコレクションチューブ	研究者
約100本のチューブ
フラクションコレクター	GEヘルスケアライフサイエンス	モデル:Frac-920、製品コード:18-1177-40	代替を使用できます。
顕微鏡スライド、カバーガラス	研究者
光/蛍光顕微鏡	研究者