STA-PUTメソッドは、大きさや密度に基づいて精子形成細胞の異なる集団の分離を可能にする。
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この記事について
サマリー
要約
哺乳類の精子形成は、精巣の精細管にいくつかの段階で発生する複雑な分化過程である。現在のところ、 インビトロでの精子形成の分化を可能にする信頼性のある細胞培養系がなく、精子形成細胞のほとんどの生物学的研究は、マウスおよびラットのような動物モデルからの組織採取を必要とする。非精子形成（ライディッヒ、セルトリ、骨髄、および上皮細胞）および精子形成の両方（精原細胞、精母細胞、円形精子細胞、精子細胞および精子を凝縮） - - 精巣は多数の細胞型が含まれているため、精子形成に関与する生物学的メカニズムの研究を隔離を必要とするこれらの異なる細胞型の富化。この場合、精巣から - - BSA線形勾配を介してSTA-PUT方法は、不均一な細胞集団の分離を可能にする。個々の細胞型は、CEのに応じて異なる沈降速度で沈降llのサイズ、および異なる細胞型について富化画分を回収し、さらなる分析に利用することができる。 STA-PUT方法は、特定の細胞選別法を用いて得ることができるように、 例えば、細胞型の高純度画分をもたらさないが、各画分中の全細胞のより高い収量を提供しない
（7-8×10 8細胞の出発集団から〜1×10 8個/精子形成細胞型）。この高い収率メソッドは特殊なガラス容器を必要とし、蛍光活性化セルソーター（FACS）又は水簸機等の特殊な装置へのアクセスが限られているラボのための理想的な方法で製造する、任意の低温室又は大冷蔵庫で行うことができる。
概要
哺乳類の精子形成は精巣1の精細管にいくつかの段階で発生する複雑な分化過程である。簡単に言うと、精細管の格差の上皮の近くに存在する精原細胞のような幹、その後減数分裂を起こす精母細胞に分化。減数分裂が完了した後、得られた半数体細胞、または円形精子細胞は、精子、細胞質及び核の圧縮の脱落を伴う分化プロセスを受ける。精子細胞は徐々に、それぞれ、鞭毛を開発し、核の伸びや、結露を起こし、伸長してから凝縮する精子細胞を生成する。最終製品は、精細管の内腔に放出され、最終的に、彼らは、さらに成熟精巣上体にしている精子、です。
精子形成のプロセスは、特殊なホルモンや分子の状態に依存しているため精巣は、精子形成の全過程のための信頼できるインビトロ培養系は、まだ2,3開発されていない。培養方法は、幹細胞から「始原生殖細胞様細胞」および半数体、「円形精子細胞様細胞」を作成するために開発されてきたが、これらの方法はまだ、これらの細胞を大量に生成し、それ以降の精子形成細胞を生成するために失敗することができない種類4,5。幸いなことに、精子細胞型は液体勾配で分離されるべき全体の精巣から得られた単一細胞懸濁液を可能にする、サイズが大きく異なる。 STA-PUTメソッドは、ここに証明し、大きさや質量6-9に基づいて精子形成細胞を分離するための直線のBSA勾配とシンプルな沈降を使用しています。
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プロトコル
STA-PUTプロトコルは、3つの段階を含む：1）全体の精巣から細胞懸濁液の装置および試薬、2）準備、3）セルの負荷、沈降、およびフラクションコレクションのセットアップします。 2人の研究者のチームによって行われた場合に、プロトコルは、平均して8時間かかります。
1。 STA-PUT装置を設定します（図1）
*** STA-PUT装置は、4℃、大規模な冷蔵庫やコレクションの方法を優先する場合にも、フラクションコレクターを収容することができ、低温室に配置する必要があります。
- 前（あるいは、少なくとも数時間前）には、メソッドを実行する夜は、すべての機器（特に、ガラス製品、チューブ）を洗って、70％エタノールで滅菌する。完全に、図1に示すような装置を組み立てる前に、機器を乾燥させる。
- （二L 2シリンダ（ 図 1BおよびC）および細胞装填室を確保図1A）トップのプラットフォームへとチューブクランプでチューブの2小片ですべてを接続してください。クランプすべての管が閉鎖した。右端の2Lのシリンダーに注ぎ口をシール。
- 細胞装填室の小さな撹拌棒（ 図1A）、2％BSAを含むことになる左端の2 Lのシリンダ内のより大きな撹拌....
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結果
STA-PUTプロシージャから理想的な結果は、細胞の大きさおよび密度に基づいて、精巣からの細胞のかなり目立つ分離である。精巣から単離された細胞は、BSA勾配を介して沈降しているが、細胞のいくつかの別個のバンドが観察することができる。セルのいずれか塊は勾配の底に沈むようにし、他の画分を汚染しない傾向があります。もう少し勾配までは、大規模な体細胞および減数分裂細胞である。遠く勾配までは、まだ小さい円形精子細胞になります。勾配の上部に精子細胞、精子、赤血球を汚染する（これらは、核なしで小円形細胞であると思われる）、凝縮されます。
画分は、光及び蛍光顕微鏡法（図2）15の組み合わせを用いて迅速に分析することができる。減数分裂、精子、および体二倍体細胞は精巣で見つかった最大の細胞であり、relatiを染色に大きな核が含まれていますvely均一にDAPIで。丸い精子細胞は、一般的に明るく染色染色中心で、小さく丸い核を有する小さい細胞である。凝縮さ/伸長精子細胞は、小さな尾が形成されているかのように、多くの場合、楕円形に見える小さな細胞で.......
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ディスカッション
信頼性の高い細胞培養系は、まだすべての精子形成細胞タイプ3を生成するために存在していないとして、精子形成を研究者たちは、精子形成細胞サンプルのための動物モデルに依存しています。精子形成細胞が容易に全体の精巣から収集しているが、唯一の混合集団をもたらす。これは、減数分裂細胞、円形精子、と凝縮精子細胞など、これらの細胞の特定のサブタイプを、勉強したい人のための問題となる。 FACSは、STA-入れ、水簸6月13日 ：3つの異なる方法は、現在、精子形成細胞のこれらのサブタイプを分離するために使用される。それぞれ、セルソーターや水簸機：後者の二つの方法は、機器の高価な部分へのアクセスを必要とする。 FACS法は、精子形成の異なる細胞型の高度に純粋な集団が得られるものの、処理は6時間かかり2〜3睾丸当たり11細胞タイプごとに0.5〜2.0×10 6個の細胞が得られる。 STA-PUTメタ様水簸、OD、大きさや密度に基づいて細胞を分離したが、STA-PUT装置よりも高価である水簸機へのアクセスを必要とします。
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。例示されてこのプロトコルは、実験用マウスの使用を含む、すべての関連するガイドライン、規制、規制当局に準拠して実行されました。このプロトコルで使用される動物は、ペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUCプロトコル番号804284）の指導と承認の下で維持されている。
謝辞
この研究は、RGMにSLBとU54HD068157にNIHの助成金GM055360によってサポートされていました。 JMBはペンシルバニア大学（GM008216）でT32遺伝学研修助成金によって支えられている。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternateが使用できます。 |
| 0.5%、2%、および4%BSA溶液 | を0.25 g、11 g、および22 g(それぞれ)を総容量50 mL、550 ml、および550 mlの1x KREBS(それぞれ)に溶解します。 | STA-PUT手続きの日にします。フィルター滅菌します。 | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g デキストロース + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl、 ddH20 | オートクレーブ/フィルターで2Lに持ってきて、4°Cで保管します。数ヶ月間C。 | |
| KREBS (1x) | 4.24 g NaHCO3 を 100 ml ddH20 に溶解します。200ml 10x KREBSを加えます。ddH20で2Lにします。 | STA-PUT手続きの日にします。フィルター滅菌します。 | |
| コラゲナーゼ | Σ | C9891-1G | |
| DNAse | Σ | DNEP-5MG | |
| トリプシン | Σ | T9201-1G | |
| DAPI | 研究者 | ||
| Triton-X100 | 研究者 | ||
| ホルムアルデヒド (~37%) | 研究者 | ||
| 表 2: 機器 | |||
| 会社 | カタログ # | コメント | |
| 完全な STA-PUT 装置 | プロサイエンス ガラスショップ | STA-PUT(この手順では、標準の沈殿チャンバーを使用します。No. 56700-500) | 装置用の全てのガラス製品および機器を含みます。より小さなセル番号でSTA-PUTを実行するための代替ガラス器具が利用可能です。 |
| 10 μmメッシュフィルター | フィッシャーブランド | 22363549 | |
| マウス解剖ツール | 研究者 | ||
| キャップ付き丸底14mlフラクションコレクションチューブ | 研究者 | ||
| 約100本のチューブ | |||
| フラクションコレクター | GEヘルスケアライフサイエンス | モデル:Frac-920、製品コード:18-1177-40 | 代替を使用できます。 |
| 顕微鏡スライド、カバーガラス | 研究者 | ||
| 光/蛍光顕微鏡 | 研究者 |
参考文献
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006)....
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再版と許可
