私たちは、多重化されたマイクロスフェアベースの抗体アレイを用いて唾液タンパク質をプロファイリングするための手順を説明します。モノクローナル抗体は、共有結合、カルボジイミド化学反応を用いて、蛍光色素でエンコードされた4.5ミクロンのポリマー微小球にリンクされていた。修飾された微小球は、蛍光サンドイッチイムノアッセイを使用して、唾液中のタンパク質レベルを測定するために、光ファイバのマイクロウェル内に堆積した。
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この記事について
サマリー
要約
ここで、我々は、同時に光ファイバー微小球ベースの抗体アレイを用いて唾液中に6つのタンパク質を測定するためのプロトコルを記載している。採用免疫アレイ技術は、蛍光顕微鏡を用いたマイクロスフェアベースのサスペンションアレイ製造の利点を兼ね備えています。ビデオプロトコルに記載のように、市販さ4.5μmのポリマーミクロスフェアは、物理的に微小球の内部に閉じ込められた二つの蛍光色素の濃度によって区別7種類、に符号化された。表面にカルボキシル基を含有する符号化されたマイクロスフェアは、EDC / NHSカップリング化学を介してモノクローナル捕捉抗体で修飾した。タンパク質マイクロアレイを組み立てるために、符号化及び官能化ミクロスフェアの異なる種類を混合し、無作為に化学的に光ファイバ束の近位端にエッチングされた4.5μmのマイクロウェル内に堆積される。光ファイバ束は、キャリアの両方としておよびmを画像化するために使用したicrospheres。一旦組み立てられると、マイクロアレイは診療所から収集された唾液上清中のタンパク質を捕捉するために使用した。検出は、ストレプトアビジン結合蛍光プローブ、R-フィコエリスリンと異なる分析物について、ビオチン化検出抗体の混合物を用いたサンドイッチ免疫測定法に基づいた。マイクロアレイは、微小球の登録およびアッセイシグナルのための1のための3つの異なるチャネル、2に蛍光顕微鏡で画像化した。蛍光顕微鏡写真は、次いで、デコードされMATLABに自家製のアルゴリズムを用いて分析した。
概要
1990年代半ばにマークSchenaとその共同研究者によって報告される最初のマイクロアレイので、この強力なツールは、生物学的研究1の多くの分野で利用されている。同時に、血液などの体液の診断、内の複数のタンパク質を検出する抗体マイクロアレイは、臨床診断やバイオマーカーのスクリーニング2月10日の重要な用途がある。唾液は、血液と同じ分析物の多くを含む、唾液の収集は、安全で非侵襲的であるため、血液の好ましい代替手段として考えられており、最小限の訓練を受けた医療従事者11-13によって行うことができる。現在、唾液サンプルを用いて多重化されたタンパク質の分析は、標的分析物14の濃度が低いと、異なるバイオマーカー15の広い濃度範囲を含むいくつかの重要な要因によって制限される。
。ここで、我々は、6つのタンパク質の解析を実証する：ヒト血管内皮増殖因子（VEGF）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質10（IP-10）、インターロイキン-8（IL-8）、上皮成長因子（EGF）、マトリックスメタロペプチダーゼ9（MMP-9）、インターロイキン-1β（IL-1β） 。方法の性能は、最初に標準溶液組換え被分析タンパク質を構成し、ブロッキング緩衝液を使用して確認した。別の慢性呼吸器疾患の患者さんだけでなく、健常対照から収集された実際の唾液サンプルにも十分な性能を試験した。プロトコルは....
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プロトコル
図1。唾液プロファイリングに光ファイバー微小球抗体アレイを適用するためのワークフロー （1）マイクロスフェアが内部二つの蛍光色素を用いて符号化され、（2）符号化されたマイクロスフェアは、外部タンパク質特異的モノクローナル抗体で修飾され、（3）多重化されたマイクロスフェアが混合され、 （5）唾液タンパク質は、サンドイッチイムノアッセイを介してマイクロスフェアに捕捉される、および（6）蛍光顕微鏡を用いて定量し、（4）ランダムに光ファイバ束の近位端にエッチングしたマイクロウェル内に堆積。
1。マイクロスフェアエンコーディング
- 琥珀色のガラスバイアル中でナトリウムユウロピウム（III）thenoyltrifluoroacetonate三水和物（EU-TTA、MW = 869.54グラム/モル）を計量し、テトラヒドロフラン（THF）に200 mMストック溶液を調製。ピペッティングにより穏やかに混合し、視覚的に確認してください染料が完全に....
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結果
光ファイバ束の小断面を示すつのチャネルからの蛍光画像は、 図2A-Cに示されている。 （ディスカッションセクションにおいてより詳細に記載されるように）これらの画像は、MATLABで記述されたアルゴリズムを用いて分析した。分析は、マイクロスフェアを復号するためのEu-TTA符号化画像（ 図2A）からの情報及びC30符号化画像（ 図2B）の両方を採用し、信号画像（ 図2C）の異なる微小球の蛍光強度を算出した。相関タンパク質標準から得られた検量線で、唾液試料中のタンパク質の濃度を計算した。
図2。 （A）のEu-TTA符号化画像（B）C30符号化画像、（C）SAPE信号画像、（D）.......
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ディスカッション
研究者は、次の手順に特別な注意を払う必要があります：より良いデコード精度のためには、マイクロスフェアが均一にすべてのインキュベーションに懸濁し、検証し、マイクロスフェアの符号化手順の間にステップを洗浄する必要がある。また、符号化されたマイクロスフェアは、実験全体を通して、光から保護される必要がある。適切な符号化及び記憶手順に従って、我々は、全体の復号精度は99％以上であったことを見出した。エンコードされたマイクロスフェアは、4℃で保存する必要があり、凍結を避け、光から保護しています。適切な保管条件の下では、符号化された微小球は半年以上安定である。細心の注意は、微小球の損失を低減するために、符号化および変更の手順の際に必要となります。上澄み液を除去する際に、たとえば、マイクロスフェアペレットを乱すことがありません。また、緩衝液中のTween-20およびSDSを含めて良好なマイクロスフェア、ペレット化のために必須である。
いくつかのO一般的なトラブルシューティング手順fは、（1）のみを新たに調製したEDC溶液およびEDC溶液を使用して滴下して加えるべき.......
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
謝辞
この作品は、国立衛生研究所（助成08UDE017788-05）によってサポートされていました。 EBPはまた、科学技術のためのスペイン財団（FECYT）からの支援を認めるものです。著者は、原稿の重要な読書のためにShonda T.ゲイロードとPratyusha Mogalisettiに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Eu-TTA染料 | フィッシャーサイエンティフィ | AC42319-0010 | |
| THF | シグマ-アルドリッチ | 34865-100ML | |
| 琥珀色のガラスバイアル | フィッシャーサイエンティフィック | 03-339-23B | |
| クマリン30染料 | シグマアルドリッチ | 546127-100MG | |
| マイクロスフィア | バンスラブ | PC05N / 6698 | |
| 1.5ml微量遠心チューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 05-408-129 | |
| PBS 10倍濃縮物 | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| 水 | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| メタノール | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | ||
| BupH MES 緩衝生理食塩水 | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH溶液 | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| セーフロック微量遠心チューブ | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| ヒトVEGF捕捉抗体 | R&D Systems | MAB293 | |
| ヒト IP-10 捕捉抗体 | R&D Systems | MAB266 | |
| ヒト IL-8 捕捉抗体 | R&D Systems | MAB208 | |
| ヒト EGF 捕捉抗体 | R&D Systems | MAB636 | |
| ヒト MMP-9 捕捉抗体 | R&Dシステム | ズMAB936 | |
| ヒトIL-1&β;捕捉抗体 | R&D Systems | MAB601 | |
| マウス IgG1 アイソタイプコントロール抗体 | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock(TBS)バッファー | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl標準液 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml 微量遠心チューブ | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| プロテインフリー(PBS)バッファー | Thermo Scientific | 37572 | |
| 組換えヒト VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| 組換えヒト IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| 組換えヒト IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| 組換えヒト EGF | R&Dシステム | ズ236-EG | |
| 組換えヒトMMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| 組換えヒト IL-1&β; | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) バッファー | Thermo Scientific | 37539 | |
| PBS 中のブロッカー BSA | Thermo Scientific | 37525 | |
| ビオチン化 VEGF 検出抗体 | R&D Systems | BAF293 | |
| ビオチン化 IP-10 検出抗体 | R&D Systems | BAF266 | |
| ビオチン化 IL-8 検出抗体 | R&D Systems | BAF208 | |
| ビオチン化 EGF 検出抗体 | R&D Systems | BAF236 | |
| ビオチン化 MMP-9 検出抗体 | R&Dシステム | ズBAF911 | |
| ビオチン化IL-1&β;検出抗体 | R&Dシステム | BAF201 | |
| ストレプトアビジン、R-フィコエリトリン | Invitrogen | S-21388エ | |
| タノール(200プルーフ) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
参考文献
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D.
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再版と許可
