ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ

Summary

私たちは、多重化されたマイクロスフェアベースの抗体アレイを用いて唾液タンパク質をプロファイリングするための手順を説明します。モノクローナル抗体は、共有結合、カルボジイミド化学反応を用いて、蛍光色素でエンコードされた4.5ミクロンのポリマー微小球にリンクされていた。修飾された微小球は、蛍光サンドイッチイムノアッセイを使用して、唾液中のタンパク質レベルを測定するために、光ファイバのマイクロウェル内に堆積した。

Abstract

ここで、我々は、同時に光ファイバー微小球ベースの抗体アレイを用いて唾液中に6つのタンパク質を測定するためのプロトコルを記載している。採用免疫アレイ技術は、蛍光顕微鏡を用いたマイクロスフェアベースのサスペンションアレイ製造の利点を兼ね備えています。ビデオプロトコルに記載のように、市販さ4.5μmのポリマーミクロスフェアは、物理的に微小球の内部に閉じ込められた二つの蛍光色素の濃度によって区別7種類、に符号化された。表面にカルボキシル基を含有する符号化されたマイクロスフェアは、EDC / NHSカップリング化学を介してモノクローナル捕捉抗体で修飾した。タンパク質マイクロアレイを組み立てるために、符号化及び官能化ミクロスフェアの異なる種類を混合し、無作為に化学的に光ファイバ束の近位端にエッチングされた4.5μmのマイクロウェル内に堆積される。光ファイバ束は、キャリアの両方としておよびmを画像化​​するために使用したicrospheres。一旦組み立てられると、マイクロアレイは診療所から収集された唾液上清中のタンパク質を捕捉するために使用した。検出は、ストレプトアビジン結合蛍光プローブ、R-フィコエリスリンと異なる分析物について、ビオチン化検出抗体の混合物を用いたサンドイッチ免疫測定法に基づいた。マイクロアレイは、微小球の登録およびアッセイシグナルのための1のための3つの異なるチャネル、2に蛍光顕微鏡で画像化した。蛍光顕微鏡写真は、次いで、デコードされMATLABに自家製のアルゴリズムを用いて分析した。

Introduction

1990年代半ばにマークSchenaとその共同研究者によって報告される最初のマイクロアレイので、この強力なツールは、生物学的研究¹の多くの分野で利用されている。同時に、血液などの体液の診断、内の複数のタンパク質を検出する抗体マイクロアレイは、臨床診断やバイオマーカーのスクリーニング^2月10日の重要な用途がある。唾液は、血液と同じ分析物の多くを含む、唾液の収集は、安全で非侵襲的であるため、血液の好ましい代替手段として考えられており、最小限の訓練を受けた医療従事者^11-13によって行うことができる。現在、唾液サンプルを用いて多重化されたタンパク質の分析は、標的分析物¹⁴の濃度が低いと、異なるバイオマーカー¹⁵の広い濃度範囲を含むいくつかの重要な要因によって制限される。

。

ここで、我々は、6つのタンパク質の解析を実証する：ヒト血管内皮増殖因子（VEGF）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質10（IP-10）、インターロイキン-8（IL-8）、上皮成長因子（EGF）、マトリックスメタロペプチダーゼ9（MMP-9）、インターロイキン-1β（IL-1β） 。方法の性能は、最初に標準溶液組換え被分析タンパク質を構成し、ブロッキング緩衝液を使用して確認した。別の慢性呼吸器疾患の患者さんだけでなく、健常対照から収集された実際の唾液サンプルにも十分な性能を試験した。プロトコルは、他のタンパク質分析物と他のマイクロスフェアベースのアッセイに適用可能であるべきである。それは、ANと比較して、高速、正確、かつ広いダイナミックレンジを有するいくつかのタンパク質の低濃度の再現性の同時分析、最小限の非特異的相互作用、還元試料消費、および低コストを可能にするように、このプラットフォームは、分析化学の分野にかなりの利点を提供する類似酵素免疫測定法（ELISA法）。

Protocol

図1。唾液プロファイリングに光ファイバー微小球抗体アレイを適用するためのワークフロー （1）マイクロスフェアが内部二つの蛍光色素を用いて符号化され、（2）符号化されたマイクロスフェアは、外部タンパク質特異的モノクローナル抗体で修飾され、（3）多重化されたマイクロスフェアが混合され、 （5）唾液タンパク質は、サンドイッチイムノアッセイを介してマイクロスフェアに捕捉される、および（6）蛍光顕微鏡を用いて定量し、（4）ランダムに光ファイバ束の近位端にエッチングしたマイクロウェル内に堆積。

1。マイクロスフェアエンコーディング

1. 琥珀色のガラスバイアル中でナトリウムユウロピウム（III）thenoyltrifluoroacetonate三水和物（EU-TTA、MW = 869.54グラム/モル）を計量し、テトラヒドロフラン（THF）に200 mMストック溶液を調製。ピペッティングにより穏やかに混合し、視覚的に確認してください染料が完全に溶解する。
2. 琥珀色のガラスバイアル中のクマリン30（C30、MW = 347.41グラム/モル）を計量し、THF中の12 mMストック溶液を調製。ピペッティングにより穏やかに混合し、視覚的に色素が完全に溶解していることを確認します。
3. 表1に記載されている最終濃度に達するためにストック溶液及びTHFを使用して、各微小球タイプのワーキング溶液700μLを準備します。
4. マイクロスフェア（10％W / V）がよくボルテックスで懸濁した後、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに60μlの懸濁物を転送していることを確認してください。
5. 微小球懸濁液を600μlのPBSを加え、20Xピペッティングして混ぜる。 3分間10,000 rpmでチューブを遠心分離し、上清を注意深く除去します。微小球を洗浄するためにこのプロセスを別の2倍を繰り返します。
6. ステップ1.5と同様の手順を使用して、THFでミクロスフェアペレット3回洗浄します。
7. 3分間、10,000 rpmで、微小球/ THF懸濁液遠心し、上清を除去し、600μlのペレットを再懸濁作業溶液は、 表1に記載されている。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに混合物を転送します。
8. パラフィルムでマイクロチューブを密封し、振とう機の上に置きます。 3,000 rpmで振ると24時間インキュベート、アルミ箔で覆われた箱を使用してセットアップを覆うことにより、光から保護します。
9. ペレットを形成するために3分間、10,000 rpmでマイクロスフェア懸濁液を遠心分離する。
10. 、上澄み色素溶液を除去600μlのメタノールでマイクロスフェア6Xを洗った後、0.01％のTween-20、別の6X、ステップ1.5で説明したようにを含む600μlのPBSで。
11. 使用するまで4℃で0.01％のTween-20を含む600μlのPBS中で符号化された微小球を保存する、光から保護します。

マイクロスフェア型名：	1	2	3	4	5	6 強い>	7
EU-TTA（MM）	100	100	10	100	10
C30（MM）		1	1	6	6	1	6

表1。のEu-TTAやC30ワーキング溶液の濃度。

2。タンパク質捕捉ミクロスフィアの調製

1. MES緩衝液調製[2 - （N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、0.1MのNaCl 0.9％SDS、0.01％、pHが5.7]、およびPBS / SDS緩衝液（リン酸ナトリウム、0.01MのNaCl 0.154Mの、SDS、0.01％、pHが7.4）を室温で事前に。
2. セーフロック1.5mlのマイクロチューブに（〜2mgのマイクロスフェアを含む）200μlの符号化された微小球懸濁液を追加します。なお、ステップ2.6でのインキュベーションの間にこぼれを回避するために、マイクロチューブのこのタイプを使用することが重要である。
<李>ステップ1.5で説明したように3倍のバッファ600μlのMESで微小球を洗浄します。ミクロスフェアペレットに700μlのMESを加え、ピペッティングによりよく混ぜます。
3. 調製0.105グラム/ mlの1 - エチル-3 - [3 - ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC、MW = 191.7グラム/モル）および0.163グラム/ mlのスルホ-N-ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ-NHS、MW = 217.13グラム/モル）別々のチューブ内のMES緩衝液中の溶液。
4. たて微小球懸濁液にドロップによる EDC溶液降下を用意し150を添加する。 EDCは、従って、それが固定化効率を確保するために新たに調製した溶液を用いることが必須であり、非常に迅速に加水分解する。すぐにEDCを加えた後、マイクロスフェアに150μlのスルホ-NHS溶液を加え、ピペットでよく混和し、懸濁液が均質であることを確認します。
5. チューブに蓋をパラフィルムでそれを封印し、シェーカー上に置きます。 4時間1,500 rpmで振る、アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護します。
6. 微小球suspensを遠心分離ペレットを形成し、上清を除去し、3分間、10,000 rpmでイオン。ステップ1.5で説明したように500μlのPBS / SDS緩衝3Xで微小球を洗浄します。
7. 、ペレットに200μlのPBS / SDS緩衝液を追加するだけでなく、微小球を混ぜて60μgの捕獲抗体を含有する300μlのPBS / SDS緩衝液にソリューションを移す。これは、最初のマイクロスフェアペレットを一時停止した後、抗体溶液に微小球懸濁液を添加することが重要である。
8. アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護し、シェーカー上、4時間1,500 rpmで振とうすることにより、抗体 - マイクロスフェア混合物をインキュベートする。
9. ペレットを形成し、上清を除去し、3分間、10,000 rpmでマイクロスフェア懸濁液を遠心分離する。 500μlのStartingBlock（TBS）ステップ1.5で説明したように、バッファ3回ブロッキング微小球を洗浄します。
10. ブロッキングバッファーのTBS 1mlの微小球を混合し、シェーカー上で1時間、1,500 rpmで微小球をインキュベートし、箱の入り江を利用し、光から保護するアルミホイルで赤い。
11. ペレットを形成し、上清を除去するために3分間7,000 rpmで微小球懸濁液を遠心分離する。ステップ1.5で説明したように、ブロッキングバッファー500μlのTBSでペレット3回洗浄します。
12. ペレットを形成し、上清を除去し、3分間7,000 rpmでマイクロスフェア溶液を遠心分離する。ブロッキングバッファー500μlのTBS系を加え、ピペッティングにより混和する。
13. 光から保護し、使用するまで4℃で修正された微小球懸濁液を格納します。
14. 対応する抗体を使用したマイクロスフェアの他のタイプを作るために、この手順を繰り返します。

3。光ファイバーマイクロアレイアセンブリ

1. 新しいオートクレーブ処理マイクロ遠心チューブにタンパク質捕捉マイクロスフェアの各タイプの50μLを混合します。遠心分離機株式マイクロスフェアは、3分間7,000 rpmでプール、残りの容量は、約100μLになるように上清を除去します。
2. 長さは約5cmにハンドカット光ファイババンドルと順次フィルムラッピング30、15、9、6、3、1、0.5、および0.05ミクロンサイズのダイヤモンドを使用した研磨機で両端を磨く。任意の粒子を除去するために2分間の脱イオン水に磨かバンドルを超音波処理。
3. 0.5mlのマイクロ遠心チューブに小さな磁気撹拌バーを入れ、タンパク質を含まないPBS緩衝液400μlを添加し、気泡を除去するために30分間、磁気撹拌プレート上で撹拌する。
4. 150秒^10,16のための0.025 N HCl溶液中で洗練された繊維束の一端をエッチングする。すぐに1分間の脱イオン水にエッチングされた端を水没し、超音波処理。圧縮空気で繊維束を乾燥させます。
5. ファイバホルダに繊維束をマウントし、1時間気泡のない、タンパク質を含まないPBSバッファにエッチングされたエンドをブロックします。
6. 光ファイバ束のエッチングされた端に格納されたミクロスフェア懸濁液の預金1μlの分量。アルミホイルの箱の光からセットアップを保護し、15分間待ちます。懸濁液の体積ます蒸発によって減少し、エッチングされたマイクロウェルにマイクロスフェアを強制。この装填工程をもう一度繰り返します。
7. マイクロウェルにトラップされていない微小球を除去するために試料溶液を飽和させた綿棒を使用してください。タンパク質マイクロアレイが使用できるようになりました。唾液分析用に4.1をすぐにステップ移動します。

4。微小球マイクロアレイを用いた唾液サンプルの分析

1. 200μlの試料溶液（ブロッキング緩衝液。唾液上清の収集プロトコルは以前に¹⁰公開されているStartingBlock T20（PBS）等容量の希釈した100μlの唾液上清）を追加する。 0.5ミリリットルオートクレーブ処理マイクロ遠心チューブに。溶液中に繊維上にロードされたタンパク質マイクロアレイを浸し、2時間600rpmで振とう機上でインキュベート、アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護します。
2. PBS、マイル19.6ミリリットル中に200μlの10％BSA溶液及び200μlの10％のTween-20を添加して20ミリリットルの洗浄緩衝液を調製静かに振とうすることにより十分にX。
3. 200μlの洗浄緩衝液を含む新しいオートクレーブ処理マイクロ遠心チューブにタンパク質マイクロアレイを浸し、2分間600rpmで振とうする。この洗浄3回繰り返します。
4. 抗VEGF、IP-10、IL-8、EGF、MMP-9を5μg/ mlを含む検出抗体カクテル100μlの溶液中にマイクロアレイをインキュベートし、StartingBlock T20におけるIL-1βのビオチン化検出抗体（PBS）をブロッキング緩衝液600rpmでシェーカー上で室温で30分間、アルミホイルで覆われたボックスを使用して、光から保護する。
5. ステップ4.3で説明したように洗浄バッファーでマイクロアレイ3回洗浄します。
6. アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護し、10分間シェーカー上600rpmで、PBS中20μg/ mlのストレプトアビジンR-フィコエリスリン複合体（SAPE）溶液200μlに、マイクロアレイをインキュベートする。
7. ステップ4.3で説明したように洗浄バッファーでマイクロアレイ5Xを洗浄します。
8. ファイバー離れて（ すなわち 、最後の先端部を清掃してくださいマイクロスフェアからの）無水エタノールで飽和綿棒でバンドル。
9. 圧縮空気が繊維の両端を乾燥させる。光ファイバの遠位端を通って落射蛍光顕微鏡画像上に繊維をマウントします。
10. のEu-TTA、C30、およびSAPE蛍光発光強度に対応したマイクロスフェアの画像を取得。のEu-TTA、C30、およびSAPEの蛍光撮像用の光学フィルタのセットアップおよび曝露時間は、 表2に示されている。

チャンネル	EU-TTA	C30	SAPE
励磁機	365/10x	350/50x	546/10x
ビームスプリッタ	525DCLP	400DCLP	560LP
エミッター	620/60m	460/50m	580/30m
露光時間	1秒	0.3秒	1秒

表2。マイクロアレイの3蛍光画像用のパラメータ。

Results

光ファイバ束の小断面を示すつのチャネルからの蛍光画像は、 図2A-Cに示されている。 （ディスカッションセクションにおいてより詳細に記載されるように）これらの画像は、MATLABで記述されたアルゴリズムを用いて分析した。分析は、マイクロスフェアを復号するためのEu-TTA符号化画像（ 図2A）からの情報及びC30符号化画像（ 図2B）の両方を採用し、信号画像（ 図2C）の異なる微小球の蛍光強度を算出した。相関タンパク質標準から得られた検量線で、唾液試料中のタンパク質の濃度を計算した。

図2。 （A）のEu-TTA符号化画像（B）C30符号化画像、（C）SAPE信号画像、（...

Discussion

研究者は、次の手順に特別な注意を払う必要があります：より良いデコード精度のためには、マイクロスフェアが均一にすべてのインキュベーションに懸濁し、検証し、マイクロスフェアの符号化手順の間にステップを洗浄する必要がある。また、符号化されたマイクロスフェアは、実験全体を通して、光から保護される必要がある。適切な符号化及び記憶手順に従って、我々は、全体の復号精度は99％以上であったことを見出した。エンコードされたマイクロスフェアは、4℃で保存する必要があり、凍結を避け、光から保護しています。適切な保管条件の下では、符号化された微小球は半年以上安定である。細心の注意は、微小球の損失を低減するために、符号化および変更の手順の際に必要となります。上澄み液を除去する際に、たとえば、マイクロスフェアペレットを乱すことがありません。また、緩衝液中のTween-20およびSDSを含めて良好なマイクロスフェア、ペレット化のために必須である。

いくつかのO一般的なトラブルシューティング手順fは、（1）のみを新たに調製したEDC溶液およびEDC溶液を使用して滴下して加えるべき...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eu-TTA染料	フィッシャーサイエンティフィ	AC42319-0010
THF	シグマ-アルドリッチ	34865-100ML
琥珀色のガラスバイアル	フィッシャーサイエンティフィック	03-339-23B
クマリン30染料	シグマアルドリッチ	546127-100MG
マイクロスフィア	バンスラブ	PC05N / 6698
1.5ml微量遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	05-408-129
PBS 10倍濃縮物	Sigma-Aldrich	P5493-1L
水	Sigma-Aldrich	W4502-1L
メタノール	Sigma-Aldrich	34860-100ML
Tw-20 Sigma-Aldrich		P7949-100 ml
BupH MES 緩衝生理食塩水	Thermo Scientific	28390
SDS	Sigma-Aldrich	05030-500ML-F
NaOH溶液	Fisher Scientific	SS256-500
セーフロック微量遠心チューブ	VWR labshop	53511-997
EDC	Thermo Scientific	22980
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510
ヒトVEGF捕捉抗体	R&D Systems	MAB293
ヒト IP-10 捕捉抗体	R&D Systems	MAB266
ヒト IL-8 捕捉抗体	R&D Systems	MAB208
ヒト EGF 捕捉抗体	R&D Systems	MAB636
ヒト MMP-9 捕捉抗体	R&Dシステム	ズMAB936
ヒトIL-1&β;捕捉抗体	R&D Systems	MAB601
マウス IgG1 アイソタイプコントロール抗体	R&D Systems	MAB002
StartingBlock(TBS)バッファー	Thermo Scientific	37542
HCl標準液 1.0 N	Sigma-Aldrich	318949-500 ml
0.5 ml 微量遠心チューブ	Fisher Scientific	05-408-120
プロテインフリー(PBS)バッファー	Thermo Scientific	37572
組換えヒト VEGF 165	R&D Systems	293-VE
組換えヒト IP-10	R&D Systems	266-IP
組換えヒト IL-8	R&D Systems	208-IL
組換えヒト EGF	R&Dシステム	ズ236-EG
組換えヒトMMP-9	R&D Systems	911-MP
組換えヒト IL-1&β;	R&D Systems	201-LB
StartingBlock T20 (PBS) バッファー	Thermo Scientific	37539
PBS 中のブロッカー BSA	Thermo Scientific	37525
ビオチン化 VEGF 検出抗体	R&D Systems	BAF293
ビオチン化 IP-10 検出抗体	R&D Systems	BAF266
ビオチン化 IL-8 検出抗体	R&D Systems	BAF208
ビオチン化 EGF 検出抗体	R&D Systems	BAF236
ビオチン化 MMP-9 検出抗体	R&Dシステム	ズBAF911
ビオチン化IL-1&β;検出抗体	R&Dシステム	BAF201
ストレプトアビジン、R-フィコエリトリン	Invitrogen	S-21388エ
タノール(200プルーフ)	Sigma-Aldrich	E7023-500ML