マウス抵抗動脈から毛細血管内皮の管の隔離

サマリー

我々は、ネイティブ、そのまま微小血管内皮にカルシウムシグナル伝達を可視化して操作するための準備を提示する。内皮チューブは新鮮に、骨格筋、隣接セル内との間で、生体内の形態および動的なシグナリングに保持供給マウス抵抗動脈から単離した。内皮チューブは、他の組織および器官の微小血管から調製することができる。

要約

骨格筋の運動によって例示されるように、抵抗血管系によって血流の制御は、酸素および代謝副産物の除去に付随栄養素の供給を調節する。内皮細胞（EC）は、すべての抵抗血管の内膜を裏打ちし、それによって、組織血流量の大きさおよび分布を径（ 例えば、内皮依存性血管拡張）を制御し、重要な役割を果たし。電気部品による血管抵抗の調節、平滑筋細胞の弛緩を誘発する細胞内Ca ^{2 +}拡散性オータコイドの産生をもたらすシグナル伝達（ 例えば 、一酸化窒素およびアラキドン酸代謝産物^）1-3及び過分極^4,5によって行われる。このように内皮のCa ^{2 +}シグナル伝達のダイナミクスを理解することは、血流の制御を司るメカニズムを理解するための重要なステップです。内皮チューブを分離すると、BLに関連する交絡変数を排除さもなければECの構造と機能に影響を与える血管内腔および周囲の平滑筋細胞および血管周囲の神経を有するOOD。ここでは、この容器のために最適化されたプロトコルを使用して、優れた上腹部動脈（SEA）からの内皮の管の分離を提示する。

麻酔をかけたマウスからの内皮チューブを分離するために、海は（解剖時に、それを可視化すること容易にする）、血管内腔の中に血液を維持するために、 その場で連結されており、腹筋のシート全体を切除されている。 SEAは、骨格筋線維と結合組織を周囲の切開され、血液がルーメンからフラッシュされ、穏やかな酵素消化を、穏やかにトリチュレーションを使用して外膜、神経および平滑筋細胞の除去を可能にするために行われる。無傷の内皮のこの新鮮に単離さ製剤には、化学的および電気的にSiを転送することができ、個々の電気部品が機能的に相互に結合したままで、それらのネイティブ形態を保持ギャップ結合^6,7を通じてintercellularly gnals。カルシウムシグナル伝達および膜生物物理学への新たな洞察を提供することに加えて、これらの調製物は、天然の微小血管内皮細胞内の遺伝子発現およびタンパク質局在化の分子的研究を可能にする。

概要

このプロトコルでは、マウスのSEAからの内皮細胞管の単離を記載している。 SEAは、前腹部筋肉に血液を酸素化内胸動脈および消耗品に起因する。我々のモデルとしてSEAでの作業は、平滑筋細胞の弛緩を支配すると配位における内皮の役割の根底にある細胞間のシグナル伝達事象を研究するために非常に適している、比較的長い非分岐微小血管セグメントを設けることに起因する。骨格筋以外の組織に興味がある方のために、我々はこの技術は容易に脳、腸およびリンパ系の微小血管から内皮チューブを得るために適応されることが見出されている。

この方法の主な特徴は、微小血管内皮の完全な長さ（1-3 mm）が^{7-9 +}シグナル伝達、孤立彼らは、PSSで灌流されたフローチャンバー内のガラスカバースリップしないように固定、およびCa ²用画像化されるか、ということです電気信号の^6,8のために突き刺さ。フローチャンバー内に、チューブの上半分は、灌流溶液に曝露され、実験的介入に応答する、（カバーガラスと接触している）、下半分が保護されている間、静止状態のままである。両方の細胞内および細胞間のCa ^{2 +}シグナル伝達事象を研究することに加えて、内皮チューブは、遺伝子発現^6,10を評価するために定量的リアルタイムPCRのために使用することができる、生物物理学的特性を定義するために、タンパク質発現^6,10、および電気生理学的研究を調査する免疫組織化学電気伝導^6,11の。

内皮機能を研究するための内皮チューブ製造にはいくつかの利点がある。典型的には「C」字形とき、（個々に解離した（管形成に残る）は、内皮細胞および平滑筋細胞：第1の分離工程は2つの細胞集団間の単純な区別を提供することであるリラックスした）。これは選択的なサンプリングと血管機能への各セルの寄与の基礎となるユニークな性質の研究が可能になります。第二に、このモデルは、平滑筋、神経、および実質を取り囲む血流の影響から独立した内皮への組み込みイベントを、シグナリングの分解能を可能にする。新たに単離されながら第三に、内皮は、それによって、細胞培養に関連する遺伝子またはタンパク質発現の変化を避け、検討されている。

プロトコル

1。機材の準備：フローチャンバー、ピペット、およびソリューション

1. チャンバーフロー：孤立した内皮チューブ（ 図1A参照 ）を表面かん流するために底部にある24ミリメートル×50ミリメートルガラスカバースリップでフローチャンバーを使用してください。チャンバを組み立てる前に、超純水でリンスし、3％HClおよび70％エタノールの両方でカバーガラスを洗浄し、窒素ガスで乾燥した。
2. ピペット：ピペット、3つの異なるタイプは、プロトコル中に使用されています。カニュレーション、粉砕、およびピン止め。カニューレ挿入およびピン止めピペットの両方が実験の日の前に行うことができますが、チュレーションピペットは、それが適切に内腔の大きさに血管の直径の知識を必要とするように当日なされるべきである。
   1. カニューレ挿入ピペット：長いテーパー端部を有するようにマイクロピペットプラーを用いてホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを引っ張る、内腔から赤血球をフラッシュするために。外径が約30％ルにピンセットで端を破る動脈（〜50〜80ミクロン）よりもカテゴリー、火災滑らかに先端を研磨（ 図1Bを参照）。約45°までの角度ピペットの先端をもと便利です。
   2. 摩ピペット機械的にホウケイ酸ガラスキャピラリー管からピペットをトリチュレートすること、内皮チューブから平滑筋細胞および外膜を解離する。上記のようにキャピラリーチューブを用意し、ピンセットで端を破る。ヒント：それは簡単にきれいにチュレーションピペットガラスの厚い壁を破るためにガラス罫書き装置を使用してください。実験の日に決定された内部直径にピペットを壊し、約10〜20ミクロン内皮管が分離されるから、血管の外径よりも大きい。ファイアーポリッシュ壊れ終了滑らかになるまで（ 図1Cを参照）。
   3. ピペットをピン止め：フローチャンバー内内皮チューブを安定化させるために、内皮tを確保するためにピペットを固定しますチャンバーのカバースリップの底にUBE。カニューレ挿入ピペットと同様にガラスキャピラリーチューブを引き出します。先端が密閉されるまで、〜100μmの直径と、火災のポリッシュにピンセットで端を壊し、丸め、滑らかな（ 図1D参照 ）。注：ピン止めピペットの先端が完全に密封されていない場合には、流体が内腔に入り、実験結果を混乱させることができる。
3. ソリューション：超純内のすべてのソリューション（18.2MΩ）、H ₂ Oを用意し、0.2μmのフィルターを介してそれらを殺菌する。解決策の浸透圧は285から300ミリオスモルの間にあることを確認します。 4℃で保存した場合のソリューションは、約2週間のために良いのまま
   1. 解剖溶液：優れた腹部動脈の切開中に使用される塩溶液（ミリモル/ L単位）から構成されている：137のNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl _2、10mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸（ HEPES）、10グルコース、0.01ニトロプルシドナトリウム（SNP）、dは、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）7.4のpHを有する。 NOドナーSNP動脈にカニューレを挿入し、トリチュレーションの際に、平滑筋細胞の除去を容易にするために容易にそれらを作る従って、平滑筋細胞をリラックスするために含まれる。
   2. 解離溶液：内皮管の解離の際に使用される塩溶液（ミリモル/ L）で構成されている：137のNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl _2、10 HEPES、10グルコース、2のCaCl _2、および0.1％BSA、 7.4のpH。この緩衝液1mlアリコートに、追加します。0.62 mg / mlのパパイン、1.5 mg / mlのコラゲナーゼおよび1.0 mg / mlのジチオエリスリトールを。異なるサプライヤーからの酵素は、酵素活性の様々なレベルを持つことができるので、この作業のために使用されているものの製品番号は、材料のテーブルの参照のために含まれています。注：プロトコル中に酵素による解離緩衝液、解離緩衝液の両方が異なるステップで使用される。
   3. 灌流液：生理食塩水（PSS）はsuperfusinに使用gで単離された内皮管が（ミリモル/ L単位）から構成されている：137のNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl _2、10 HEPES、10グルコースおよび2のCaCl _2、7.4のpHを有する。
   4. 手術手順を開始する前に、緩衝液および溶液を準備します。 200ミリリットルの三角フラスコに4℃、分量解剖バッファーの50ミリリットルからソリューションを削除し、氷の上に置きます。また、解離の分量50ミリリットルは、酵素なしでバッファリングし、室温に平衡化する作業台の上に置きます。 4℃から灌流液を取り外して、作業台の上に室温に平衡化させる。

2。動物の準備

動物に関わるすべての手順およびプロトコルは、 実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所と一致していることを確認してください。ここで説明する手順は、大学の動物実験委員会によって承認されたミズーリ。

1. 男性または少なくとも9週齢の雌マウスを使用して、個別に研究を行っている。腹腔内（ip）注射により、ペントバルビタールナトリウム（60 mg / kg）をして、マウスを麻酔。ヒント：注射は過剰摂取の可能性を低減する前に、滅菌生理食塩水に10 mg / mlのにペントバルビタールを希釈する。
2. 麻酔妥協温度調節は、そのマウスがペントバルビタールの最初の注射の直後に保温。 （〜37℃に校正）加熱プレートの上に金属製フレーム（換気されたアルミニウム製バスケット）を使用すると、安定したマウスの温度を維持するために適しています。別の方法として、マウスから適切な距離を置いて、それを配置するように注意しながら、加熱ランプを使用しています。麻酔の適切なレベルを（TOEまたは尾のピンチに撤退の欠如）が達成されるまで、マウスごとに5〜10分を監視します。補足投与量は、15〜20分後に必要になることがあります。それは、特に、肥満の高齢者、または動物と、過剰摂取を避けるために、ゆっくりと慎重に進めるのがベストですそうでないと強調しね。
3. 慎重に、小さなペットの毛をバリカンで、それを削って腹側から髪を削除します。特に注意は、動物への外傷を避けるように注意する必要があります。それは、陰部に脇の下にまたがる領域からすべての毛を削除すると便利です。新鮮なアルコール綿で任意の緩くしがみつい髪を削除します。
4. 可能な限り腹壁をできるだけ多く公開するように広げ、両方の前後と後肢で横たわって、その背中の上でマウスを置きます。必要に応じて、スプレッドイーグル的に足を確保するために実験室のテープを使用しています。

3。優れた心窩部動脈の分離

1. ただ陰部の領域の上に、皮膚を通して小さな切開を行います。基本的な腹部の筋肉へのダメージを回避しながら、皮膚のみが切断されていることを確認し、それぞれの後肢に出各方向に横切開を延長する。胸郭の上部に腹側正中に沿って頭側に切開を継続し、Nそれぞれの前肢に各方向に横切開を延長する。
2. 優しく皮膚を持ち上げ、（ 図3Aを参照）、それにより腹部の筋肉組織の全面を露出させる、下の筋肉に皮膚を保持している結合組織を切断する鋏を使用。室温に0.9％食塩溶液で露出筋肉を洗浄。
3. SEAの小さなサイズのため、更なる手続きのための実体顕微鏡の下に動物を配置します。ピンセットで胸骨の一番下にある脂肪体を持ち上げ、それを介して切開する。下にある組織にあまりにも深く切らないように確認しながら、底のリブに沿って切開を続ける。 SEAは、表示する必要がある、それを損傷しないように注意してください。切開が完了したら、室温で0.9％食塩水で露出した組織を灌漑。
4. 骨格筋の上部層が引き込まれた後、SEAおよび下の筋肉が容易に識別される。ヒント：の長さに注意してください元の長さに近づけるために（分離の際、軸に沿って短縮）内皮チューブを拡張するために分離する前に、 生体内の海。鉗子およびハサミを使用して、慎重にSEAの下に薄い筋肉層を切り出す。
5. 傾斜した鉗子を使用して、SEAの下に6-0絹縫合糸の長さを通過し、その後の単離および洗浄中に可視化を容易にするために、血管内腔の中に保持し、加圧された血液に保つために動脈とその隣接する静脈を結紮。
6. 反対側の海のライゲーション手順を繰り返します。
7. 両方のSEAがライゲートされると、それぞれの側面を分離するために腹筋の正中線に沿って切開する。
8. 肌のために行ったように、完全に身体から腹筋を分離するために垂直方向に外縁に沿って切開を継続して、それぞれの方向に横切開を拡張します。加圧された内腔を維持するために海に供給血管系への損傷を防ぐ。
9. C言語シールを維持し、4℃の解剖緩衝液10mlを含む50ミリリットルのビーカーに孤立筋肉や動脈を配置し、連結の上に海がUT。
10. 腹部の反対側のための手順を繰り返し、10分間解剖バッファ内の組織をインキュベートする。
11. （ 図3Bを参照）解剖バッファーを含む冷却（4℃）解剖室の海を含む腹筋を配置します。解剖室は下部のシルガード（ポリジメチルシロキサン[PDMS]）の層でペトリ皿で​​構成されています。
12. 虫ピン（0.15ミリメートル）を使用して、in vivoでの長さ（上記）を近似し、シルガードに固定し孤立海と腹部の筋肉を伸ばす。ヒント：腹膜に直面して薄い層が上になるように筋肉を方向付けるには、透視を使用して海が容易に見えることができます。
13. 細かいマイクロダイセクションの楽器を利用しての方にライゲーションの上流サイトから作業下流端、最初の主要なブランチサイト（1-2 CM）まで、その対に静脈周囲の組織から海をオフにします。それからちょうどブランチサイトの上下だけで結紮下にカットしてSEAを切り出す。
14. 血管内腔の中に保持している血液を除去し、海にカニューレを挿入し、氷冷解剖バッファーでそれをフラッシュします。シラスティックチューブの一部を使用して、氷の冷たい解剖バッファーを含む5ミリリットルのシリンジにカニューレ挿入ピペットのバックエンドを取り付け、海にカニューレを挿入するために解剖室の中にその先端を配置するマイクロマニピュレータにマイクロピペットを固定します。
15. 赤血球のすべてが洗い流されると、カニューレ挿入ピペットから海に削除し、解剖皿の外にピペットを持ち上げます。
16. 小さなセグメントにそれぞれ長さ1〜3ミリメートルを海に切る。これらの短いセグメントは、内皮管の単離を容易にする。

4。内皮チューブの分離

1. 12ミリメートル×75ミリメートルガラスカルトを埋める氷冷たい解剖バッファーでUREチューブを半押しします。角度のついた鉗子を使用して、氷の上で培養管、所定の位置に動脈部分を転送します。このとき、別々の12ミリメートル×75 mm培養チューブ内の1mLの最終容量に解離緩衝液を用いた消化酵素を組み合わせる（1.3.2ソリューションを参照）および加熱ブロックで37℃に溶液を予熱する。
2. 解離緩衝液および酵素を暖機している間、慎重に血管セグメントを含む小さな容積を残して培養管から解離緩衝液を吸引する。
3. 静かに残りの解剖バッファを洗い流すために酵素を含まない室温解離緩衝液を追加します。ヒント：動脈片は彼らが定住するのを待つ時間を節約するために培養管の底に残っていることを徐々にこのような解離緩衝液を追加します。衝撃を最小化するために37℃、室温（〜24℃）に、氷（4℃）からの複数の段階にわたってバッファ温度を上げる。
4. 慎重にdissocを吸引培養管からiationバッファ、再び血管セグメントを含む小さなボリュームを残してくださいという。
5. 加熱ブロックからの酵素で予熱解離緩衝液を除去血管セグメントを含む培養チューブに酵素溶液1mlを転送し、加熱ブロックに戻し培養管を配置。 30分間37℃でインキュベートする。
6. 酵素とのインキュベーション中、チュレーションピペットを準備し、ミネラルオイルでそれを埋め戻すとマイクロマニピュレータに装着されているマイクロシリンジの上に固定します。その後、解離緩衝液の2 NLでピペットを記入し、フローチャンバーの上にピペットチップを配置するマイクロシリンジのプランジャーを引き込む。
7. 30分間のインキュベーションの終わりに、加熱ブロックから培養管を取り外して慎重に上記緩衝液を吸引する。
8. 室温解離緩衝液4mlで動脈セグメントを洗浄します。注意：これは、血管のSEGMを維持する必要がなくなりまし培養管の下部にあるエント、動脈片を乱す、実際には、残留酵素が効果的に除去されていることを確認するのに役立ちます。
9. 穏やかを1mlマイクロピペットでそれを吸引し、解離緩衝液1mlでフローチャンバー内に置くことにより、フローチャンバへの移送つの容器セグメント。
10. マイクロシリンジを含むマイクロマニピュレータを利用して、血管セグメントの一方の端の近くでチュレーションピペットの先端に配置します。
11. のECへの機械的な歪みを引き起こし、その後、バックチャンバーにそれを排出しないように、粉砕するピペットにゆっくりと（225 NL /秒）に血管部分（撤回500 nl）を吸引除去する。消化が成功した場合は、平滑筋細胞および外膜、内皮管から解離する。
12. すべての平滑筋細胞が解離するまでチュレーションを繰り返します。過度チュレーション（4X以上）のECを損傷し、アゴニストにそれらが応答しなくなる可能性があることに注意してください。ヒント：チュレーションピペットを用いて、チューブを交絡からそれを維持するために、できるだけ早く離れて内皮管から外膜を移動します。注：摩ピペットを用いて、単離された内皮チューブを吸引し、別々のチャンバーに移すことができる。
13. 、フローチャンバーの中心に内皮チューブを配置し、流れの方向に沿って整列し、粉砕するピペットを削除します。
14. マイクロマニピュレータにおけるセキュアなピニングピペットは、フローチャンバーの両端に取り付けられており、内皮管の両端にそれらの先端を配置します。
15. チャンバーの底に対してそれを押すようにチューブの一端を介してピニングピペットを下げます。チューブの反対側の端に同じ方法で、第二のピニングピペットを置きます。注意：ピン止めピペットの配置は、トレードオフ（チューブ端から遠くに置くこと）および複数の撮像/実験エリアを可能に（近い管の端にそれらを置くこと）チューブを固定しての間にある。 Tの場所チューブの各端から裾〜50程度が適しています。ピニングピペット、チューブに接触したのと同じように、ゆっくりと、それによってin vivoでの長さに近づけるために、それを拡張し、チューブの軸に沿って、それを撤回してから、チューブを固定するために、チャンバ底部にピペットを押してください。
16. 灌流液の流れを開始し、（ 図3C参照 ）内皮チューブを平衡化して付着させ、少なくとも20分間休ませることができます。内皮チューブで一定の流体流（灌流）を維持するために、蠕動ポンプを使用しています。注：内皮管はフローチャンバーの底部（〜25分）に付着または内皮チューブが取り外されたとならない保証するために適所に残された後ピニングピペットで除去することができる。

5。色素負荷およびカルシウムイメージング

1. 細胞内カルシウム応答を可視室温でのfluo-4 AM色素で内皮チューブをロードする（〜24℃）。槽内の流体の流れを停止し、フルオ4を追加10μMの最終濃度でチャンバに思います。その後、細胞外の染料を除去し、細胞内の色素が完全に脱エステル化されていることで確認するために20分間、新鮮な、PSSと内皮チューブを表面かん流する、色素が細胞に入ることができるように10分待ちます。
2. カルシウムイメージングを行う。この作業のために、正立顕微鏡はスピニングディスク共焦点イメージングシステムを備えた周囲の室温で使用した（ 図2参照 ）。 491 nmのレーザーを蛍光カルシウム色素を励起し、激化デジタルカメラを使用して（500〜550 nmの発光で）画像を取得する。

結果

カルシウム応答は、アセチルコリン（AChの）を使用して、新たに単離した内皮チューブ内で開始することができる。この映画では、10μMのフルオ4 AMを搭載内皮チューブは1μMのアセチルコリン（ 動画1）の灌流で刺激されています。 ムービーを見るにはここをクリックしてください 。染料は491 nmで励起され、発光は、増感型電荷結合素子カメラを用いて500〜550 nmの記録されている。画像スタックは、25秒の期間に120フレーム/秒で取得され、次いで（ 例えば、40フレーム/秒）平均化することができる。経時的な代表的な蛍光画像を図4に示す。

図1。内皮チューブの分離の際に使用されるチャンバーとピペットを流れる。 A）引っ張られ、破損した洗練さと角度（ 右 ）カニューレ挿入ピペットプル（ 左 ）とのベース。Bのような24ミリメートル×50ミリメートルカバーガラスで組み立てフローチャンバー）を例。このピペットは、解剖以下の動脈の内腔から赤血球をフラッシュするために使用されます。プルのスケールバー=200μmである。C）の例（ 左 ）と引っ張られ、壊れた、研磨（ 右 ）チュレーションピペット。このピペットの内径は、動脈の外径によって決定される。スケールバーはプルの= 200ミクロン、D）の例（ 左 ）と引っ張られ、壊れた、研磨（ 右 ）ピペットを固定。このピペットの先端が丸く、完全フローチャンバー内の内皮管を固定するために封止されている。スケールバー=200μmである。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図2。のCa ^{2 +}シグナルの画像化のためのディスク共焦点顕微鏡。A紡糸 ）カルシウムイメージングに使用されるアップライト顕微鏡B）（a）の共焦点スピニングディスク部（b）は、電荷結合素子カメラを強化している。C）液浸対物レンズの（a）63X（ NAは1を）= AND（B）20X（NA = 0.5）は、イメージングのために使用。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3。腹筋と優れた上腹部動脈の単離。A ）腹筋露出させ、室温、0.9％食塩水で灌漑して、マウスを麻酔した。赤い矢印は、それぞれのSEAは、各腹直筋（ すなわち血管を結紮する必要があります）を入力した時に脂肪パッドの下のサイトをマーク。マイクロダイセクションのための解剖室で、固定スケールバー= 1センチB）絶縁腹筋（一方的な）と海。赤い矢印は、（容器の洗浄が停止された時点、すなわち ）SEAの最初の主要な分岐部位を示す。海からのスケールバー= 1 cmである。C）絶縁内皮細胞管。室温で1時間のインキュベーション後の内皮管の微分干渉コントラスト像。内皮チューブを3ml /分で灌流液で灌流した。スケールバー=50μmである。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4。内皮細胞管中のカルシウム蛍光 。 1μMのアセチルコリンアセチルコリン投与時に刺激。Bの前に、A）蛍光）内皮チューブ蛍光による刺激に応答した内皮管の代表蛍光像、T = 5秒でT = 0秒℃）内皮チューブ蛍光。 D）T = 10秒で内皮の管蛍光、E）、T = 15秒で内皮の管蛍光。F）内皮チューブ蛍光T = 20秒で。スケールバー=40μmである。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

ディスカッション

ここでは、海からの内皮チューブの分離とその構成のEC内シグナル伝達事象を^{+ CA 2を}可視化するこの準備の使用を記載している。この手順は、元々ハムスター精巣挙筋の⁸の細動脈から内皮チューブを分離するために開発された1から採用した。ハムスターリトラクタの筋肉と頬袋細動脈^10、マウス、優れた心窩部動脈^6,7,9、マウスの腸間膜と脳の供給動脈：ここで紹介するテクニックの小さな変動を利用して、我々を含む、血管床の様々な内皮の管を単離した動脈とリンパ微小血管（未発表の観察、参照は腸間膜血管¹²と脳血管^13を分離するために含まれています）。新しい血管床から内皮チューブを分離すると、オリジナルのプロトコルへの変更が必要な場合があります。分離に失敗した場合には、消化時間を変更することによって開始するのが最適です。内皮チューブは、内皮管が無傷で残っていない場合には平滑筋細胞および外膜から単離し、消化時間を短縮することが困難な場合に消化時間を増加させる。消化時間を変化させることに失敗した場合、消化酵素の濃度または消化温度を調節する試みられるべきである。別のオプションは、平滑筋細胞を除去する際にせん断力を増加させる摩ピペットの内径を減少させることである。流体排出の速度を増加させることは、同じ効果のために試みたが、製剤に損傷を与える可能性が高くなることができる。それは、内皮細胞がウェル接合部タンパク質によって相互に接続されていない血管からの無傷の内皮管を単離することが可能ではないかもしれないことを認識すべきである。

酵素消化後の平滑筋細胞の解離は、最初に手スタイル⁸ピペッター^を用いて行った。私たちは、microsyrを使用してトリチュレーション手順を洗練している^6（3ミリメートルまで）長い内皮チューブの一貫した分離を可能にしたインゲシステム。このシステムを使用する場合、摩ピペットは、流体移動と血管セグメントを含むPSSを制御ピストンとの間の連続的な流体カラムを提供するために、ミネラルオイルを充填している。容器として一定の剪断におけるマイクロシリンジピストン結果の一定の駆動力に加えて流体の非圧縮性は、ピペットチップを強制的に通過される。対照的に、手の技術は、多くの場合（ 例えば、パスツールピペットの端部にゴム球を絞る）細胞を解離させるために用い、それによって、駆動圧の変動を導入し、空気の圧縮を伴う、剪断は、ピペット先端に加えられる。

微小血管の内皮機能を研究するためのチューブの準備に多くの利点があります。最初は分離プロセスがECの明確な均質なネイティブの細胞集団で滑らかなMUを提供することであるSCLE細胞。電気部品が物理的にチューブとして接続されたままなので、彼らはチュレーション中にリラックスしたままであれば「C」の構成を保持し、個々の平滑筋細胞、区別される。このようにそれぞれの細胞型が容易に区別される、例えば 、リアルタイムPCRおよび免疫組織¹⁰などの分子技術のためのサンプルを取得する。 （SEAのために行ったように、または二国間の血管からの）複数の管を単一の容器から隔離されているため、分子データと機能のデータが与えられた動物の同じ血管から得ることができる。従って、分子式は微小血管内皮の機能的挙動と相関させることができる。また、微小血管内皮細胞に固有の細胞内および細胞間の両方のシグナル伝達事象は、血行力学的な力（圧力、流量）の影響から独立して解決することができ、血管作用薬は、血流（ 例えば、ホルモン）で運ばれ、または平滑筋細胞の周囲から（ 例えば、60; myoendothelialカップ^14〜16を経由して）、神経^17、または組織実質^18。

内皮が新鮮に指定された微小血管から隔離されているので重要なのは、そうでない場合、培養のEC ^19から21に関連している表現型の全く変更はありません。例えば、培養されたECは、ムスカリン受容体の発現を失い、それによってそれらのカルシウムシグナル伝達プロファイルを変化させる。さらに、ECの電気生理学的特性を、培養²²に変更することができます。個々のECが機能ギャップ結合チャネルを介して結合さとどまっているため、内皮管が細胞^6,7間の電気的およびCa ^{2 +}シグナルの伝導を研究するための理想的なモデルを提示します。また、解離した平滑筋細胞は、容易に微小血管機能^23の下にある相補的なデータのためのパッチクランプ技術を用いて研究されていることを認識すべきである。

内皮チューブmの重要な制限odelは温度上昇に伴って準備が不安定である。海から私たちの準備が周囲の室温（〜24℃）で32℃で数時間安定しており、健康的な実証されていますが、形態学的および機能的な分解は37℃で⁹で1時間も経たないうちに起こる。内皮チューブの第二の重要な制限は、無傷の血管壁^14-16におけるEC機能に不可欠なmyoendothelialジャンクションおよびその固有のシグナル伝達ドメインの喪失である。それはまた、より長いチューブ⁶比較的大きな距離にわたって研究され、細胞間シグナル伝達を可能にしながら、完全に平滑筋細胞および外膜を取り囲む解離することがより困難になるので、彼らが長くなるように、管の製造が複雑であることを認識すべきである。我々は、1〜2 mmを長いチューブも位置決めし、フローチャンバー内に確保することがより困難であることを見出した。対照的に、短いチューブ（ 例えば、<1mm）で、一方のena^8を研究するBLEのCa ^{2 +}との電気信号は、それらは、フローチャンバー内の表面灌流の間、維持することが困難である。免疫標識は、タンパク質発現および局在化の指標を提供するものの、最終的に、さらに左右のチューブの最適な単離とウェスタンブロットを用いてタンパク質発現の定量化のための従来の不十分な材料がある。このような制限にもかかわらず、内皮チューブは、 インビボでの微小血管内皮細胞機能のメカニズムに新たな洞察を提供するための新規な製剤を表す。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム	ッシャーS642-212
カリウム	シグマ	P9541
マグネシウム	シグマ	M2643
カルシウム	シグマ	C1016
ニトロプルシド	シグマ	431451
ウシ血清アルブミン	USB製品	9048-46-8
パパイン	シグマ	P-4762
ラゲナーゼ	シグマ	C-8051
ジチオエリスリトール	シグマ	D-8255ボ
ロシリケートガラス(カニューレ挿入およびピンピペット)	ワーナーインスツルメンツ	G150-4
ボロシリケートガラス(トリチュレーションピペット)	ワールドプレシジョンインスツルメンツ	4897
ナノリットルインジェクターマイクロシリンジ	ワールド精密機器	B203MC4	ナノリットル 2000
Micro4コントローラ	ワールド精密機器	SYS-MICRO4
12 mm x 75 mm 培養チューブ	フィッシャー	14-961-26
3軸マイクロマニピュレーター	シスキユー社	DT3-100	ピン留めピペット
の保持と位置決めフローチャンバー	ワーナーインスツルメンツ	RC-27N
100-1,000 & マイクロ;l ピペット	エッペンドルフ	3120000062	消化容器セグメントをフローチャンバーに移すため
1ml ピペットチップ	フィッシャー	02-707-405	消化容器セグメントをフローチャンバーに移すため
直立顕微鏡	オリンパス	BX51W1	実際の顕微鏡はユーザー次第です
スピニングディスク共焦点システム	横河	電機CSU-X1	共焦点イメージングはオプションです
XR/TURBO EXカメラ	スタンフォードフォトニクス	XR/TURBO EX	私たちのニーズに最適; ユーザーによって異なる場合があります
パイパー制御ソフトウェア	スタンフォードフォトニクス		TURBO EXカメラ用イメージングソフトウェア
ステレオマイクロスクロペ	ライカ	MZ8	、ユーザーによって異なる場合があります
シルガード	・ダウ コーニング	184
マイクロディスセクションはさみ	ファインサイエンスツール	15003-08
デュモン鉗子	ファインサイエンスツール	#5/45
Minutiens 昆虫ピン	Austerlitz	Mサイズ 0.15 mm
GP Millipore Express PLUS メンブレン	ミリポア	SCGPT05RE
ピペット スコアリング デバイス	Austin Flameworks	小型ハンドヘルド スコアリング austinflameworks.com
コンパクト ペット トリマー	ウォールクリッパー株式会社	モデル9966	を維持するために、使用するたびによく掃除してください