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方法論記事

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

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DOI：

10.3791/50821

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2013年10月15日

 ,  ,  ,  , 
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

我々は、HIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌の調節における免疫調節経路の役割を調査するためのインビトロアッセイを開発した。

要約

T細胞の枯渇は、慢性ウイルス感染時に障害が発生した病原体のクリアランスの主要な要因である。例えば、PD-1およびIL-10などの免疫調節経路は、この進行中の抗原の曝露の際にアップレギュレートおよび増殖の喪失、減少した細胞溶解機能に寄与し、CD4およびCD8 T細胞によるサイトカイン産生が損なわれている。 LCMV感染のマウスモデルにおいて、これらの二つの経路に対する遮断抗体の投与は、T細胞応答を増強した。しかし、ヒト試料からの細胞でのサイトカイン分泌に対するそのような遮断の影響を測定するために何in vitroアッセイは現在ありません。我々のプロトコルおよび実験的アプローチは、正確かつ効率的にHIV感染被験者からのHIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン産生の回復を定量化するために、私たちを可能にする。

ここでは、HIV-特異的CD4 T細胞および他のセルへの影響によるサイトカイン分泌の測定を可能にインビトロ実験デザインを示すLサブセット。 CD8 T細胞は、全血から枯渇し、残りのPBMCをフィコール分離法により単離した。 CD8枯渇PBMCをその後、HIV-1のGagペプチドプールで刺激した後、細胞を37℃、5％CO 2でインキュベートし、PD-L1および/ ​​またはIL-10Rαに対する遮断抗体とインキュベートした。 48時間後、上清をビーズアレイによるサイトカイン分析のために収集し、細胞ペレットを、定量RT-PCRを用いてフローサイトメトリーまたは転写解析を使用して流れる表現型分析のいずれかのために収集した。より詳細な分析のために、異なる細胞集団を、PBMCからの選択サブセットの枯渇によって、または同一のアッセイで評価される前に、フローサイトメトリーを用いて選別することによって得た。これらの方法は、抗原特異的Tヘルパー細胞によるサイトカイン産生の調節を決定し、免疫細胞の異なる集団の間の機能的相互作用を決定するために、高感度かつ特異的なアプローチを提供する。

概要

持続性ウイルス感染の間に、ウイルス特異的T細胞は、T細胞の枯渇として知られるプロセスにおいて機能的欠陥を獲得する。初期の慢性ウイルス感染症のマウスLCMVモデルにおけるインビボ研究消耗ウイルス特異的T細胞は、ウイルス感染細胞に対する細胞溶解機能が低下して増殖する能力を失い、例えばIL-2、TNF-などのサイトカインを産生する能力が低下してきたことを示したαおよびIFN-γ1,2。例えば、PD-1およびIL-10などの免疫調節経路の複雑なネットワークは、慢性感染の間にアップレギュレートし、（3,4に総説）T細胞の機能不全に寄与する。 インビボ LCMVマウスにおいてこれらの経路の阻害に対する阻止抗体の投与モデルは、T細胞の枯渇が（5日）、部分的に可逆的な現象であることを示す、消耗したウイルス特異的T細胞の機能および拡張ウイルスクリアランスを回復した。

目の上の調査結果EのLCMVモデルは迅速なHBV、HCVおよびHIVの5のようなヒトの慢性ウイルス感染症にも拡張されました。慢性HIV-1感染では、PD-1およびIL-10経路は、感染患者でアップレギュレートされ、疾患進行のパラメータと相関、直接ウイルス量と反比例CD4と6-8を数える。 LCMVマウスモデルに類似していることを示してPD-1またはHIV-特異的CD4およびCD8 T細胞のインビトロ復元増殖における IL-10経路の抗体遮断は、ヒトにおけるT細胞の枯渇は、部分的に可逆的な現象である。しかし、ヒトのサンプルだけでなく、in vitroアッセイの感度の限界の実験の繊細な性質のために、これらの介入によって達成機能回復プロファイルの徹底的な調査が著しく欠けている。増殖アッセイは、これまでのところ、ほとんどの研究でテスト唯一の信頼できるin vitroアッセイされているが、まだこれらの相互の影響に関する証拠の著しい欠如している上ventions：細胞傷害性T細胞の1）殺傷能力、2）ウイルス複製に対するT細胞の抗ウイルス効果、3）サイトカイン分泌プロファイル、および他の細胞サブセット上のCD4 T細胞ヘルプに4）の効果。

細胞内サイトカイン染色（ICS）は、マウスおよびヒトの両方における種々の細胞型においてサイトカインの産生を検出するために使用されるベースの非常に有用かつ広く使用されているフローサイトメトリーアッセイである。また、阻害性経路の遮断抗体の効果を調べるために使用されている。 ICSアッセイにおいて、サイトカイン分泌を、ブレフェルジンおよび/またはモネンシンを添加することによって遮断される。細胞内に捕捉されたサイトカインは、次いで、多色フローサイトメトリーを用いた蛍光抗体を用いて検出される。通常は、抗原添加の2時間以内に追加されブレフェルジンとモネンシン、どちらも細胞に対して毒性であるため、アッセイの期間は通常、抗原刺激後6か12時間に制限されています。 ICSアッセイは、便利なIされている強力な手法であるnは、細胞を抗体曝露後9時間の一定期間後に抽出されたマウスにおける抗体の介入を阻止するのインビボ投与の効果の調査。しかし、ヒト試料中の阻害性受容体の遮断の影響を評価するために、この実験的なアプローチを適用するためのいくつかの制限がある。 インビトロで 6または12時間刺激（ヒト試料と、典型的な場合）における阻害経路の抗体介入を行う場合は、標準的なICSアッセイにより測定されるように、ほとんどの場合、阻害性受容体の遮断が、抗原特異的T細胞応答の頻度を変化させない6,7。平均値または中央値蛍光強度によって測定されるセル当たりのサイトカイン産生の測定値は矛盾した結果が図6、図7、図10を与えている。一方、ICSは後後期の時点で実行されるときに、刺激（ すなわち、六日）、サイトカイン分泌数cの変化のエルを観察することができる。相違点は、変化した増殖、生存、および6時間の特定の期間にわたって蓄積するエフェクター機能の変化の複合効果である。部分的にこれらの制限を克服する1つの方法は、増殖が起こるのを待つことなく、サイトカイン分泌ブロッカーの添加前に抗原と、より長い期間（ 例えば 36時間、60時間など ）インキュベートすることである。我々は、正常にHIV特異的CD4およびCD8 T細胞11,12によるサイトカイン分泌の動態を決定するために、このメソッドを使用しているが、このアプローチは、小さな応答を検出することができず、発生した総サイトカイン分泌の統合された結果を得られる刺激以来。したがって、ICSはsupernatanにおけるサイトカインmRNA定量またはサイトカイン分泌の測定値と比較して、活性化T細胞によって産生されるサイトカインの量に対する阻害経路の遮断の影響を検出するための敏感な十分な方法ではない同じ時点でT。さらに、活性化T細胞によって産生されるサイトカインのほとんどが正または負のフィードバックに貢献する自己分泌様式で作用し、抗原提示細胞との相互作用を介してループする。したがって、ICSアッセイの間またはモネンシン、ブレフェルジンの添加は、サイトカイン分泌を防止し、従って、T細胞の刺激が最適ではない。最後に、ICと複数のサイトカインの検出は、フローサイトメトリーと同様に、任意のパネルで同時に使用することができる蛍光色素の数の制約によって可用性とサイトカインの検出のための抗体の感度によって制限されます。

我々は、細胞（APC）及びナチュラルキラー細胞（NK細胞）が抗原提示するHIV特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌を調節し、続いてCD4ヘルプの免疫調節経路の影響を評価するための高感度インビトロ実験的なアプローチを開発した。この方法はまた、IMPAを評価するために使用することができるPBMCからCD4 T細胞を枯渇させることによってのみ、CD8 T細胞によって認識され、最適なペプチドを用いて刺激することにより、CD8T細胞機能に対する阻害分子の遮断のCT。細胞内サイトカイン染色アッセイとは対照的に、我々のことができるようにするために、HIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌を妨害しないことを決定した：1）産生されるサイトカインレベルのより正確な定量化を行うこと、2）広範なパネルを調べるサイトカインまたはエフェクター分子の、3）他の細胞サブセット上のHIV-特異的CD4 T細胞によって産生されるサイトカインの影響を評価する。私たちは、関心のある免疫調節経路のための抗体をブロックの存在下でのHIV-1のGagペプチドプールで、CD8枯渇したPBMCを刺激する。インキュベーションの所望の時間の後、通常48時間後、我々は、ビーズアレイを有するサイトカイン分泌を測定し、異なる細胞サブセットの表現型分析または転写解析のためにいずれかの細胞ペレットを収集するために、上清を集める。注目すべきは、tにおけるその48時間の時点で、我々は、T細胞の増殖し12の有意な集団を検出しない。これは、柔軟なアプローチであり、この設計のいくつかの適応は、異なる仮説に取り組むために適用することができる。 36時間さらにインキュベーションが上清および細胞ペレットの回収が続く前に、例えば、（例えば、HIV-特異的CD4 T細胞またはPD-1の高いCD4 T細胞などのような）個々の細胞サブセットを、インキュベーションの12時間後にソートすることができより具体的に定義されたPBMCのサブ集団によるサイトカイン分泌に対する遮断介入の影響を調査する。

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プロトコル

1。フィコール分離により枯渇し、PBMCの分離

  1. 全血50μL/ mlでヒトCD8 +枯渇カクテルを追加することにより、CD8 + T細胞を枯渇。
  2. よく混合し、室温（18〜25℃）で20分間インキュベートする。
  3. インキュベーション後、HBSS（Ca 2 +またはMg 2 +なしのハンクス液）で全血を混ぜてヒストを上の層。 30分（ブレーキなし、緩加速）のための340 RCFでスピン。
  4. PBMCをを収集し、新たな50ミリリットルコニカルに移す。 340 rcfで10分間スピンし、50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、及び1％HEPESを補充した45ミリリットルのRPMI 1640で2回洗浄。

2。抗体遮断および細胞の抗原特異的刺激

  1. 50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、及び1％HEPESを補充した10％ヒト血清を含有するRPMI 1640中で条件あたり2×10 6で細胞を再懸濁し、条件あたり500μLを占めている。
  2. FACSチューブあたりの細胞懸濁液の一部を500μl。
  3. 調べ経路に応じて、PD-L1、10μg/ mlの抗体でおよび/ ​​またはアイソタイプコントロールを遮断するIL-10Rαを添加し、37℃、5％CO 2で15分間インキュベートする。
  4. 1μg/ mlの/ペプチド最終濃度でのHIV-1のGagペプチドプールで細胞を刺激する。また、各ブロックする条件について「刺激なし」コントロールが含まれています。 37°C、48時間、5％CO 2でインキュベートする。

3。上清の収集と分析

  1. 48時間後、340 RCFで7分間FACSチューブをスピンダウン。
  2. 慎重にペレットを乱すことなく、ルミネックスビーズアレイ用のエッペンドルフチュー​​ブ内の2×225μlの上清を回収。
  3. 0.05％PBS-Tweenでの最終濃度を与えるために25μlの0.5％PBS-Tweenで回収した上清中のウイルスを不活性化する。
  4. IMMEDでない店回収した上清iately -80℃の冷凍庫で使用。
  5. 製造業者のプロトコルに従ってミリポアルミネックス·キットを用いて所望のサイトカイン濃度を測定する。

4。フローサイトメトリーを経由して収集し、細胞の表現型解析

  1. 上清を収集した後、3ミリリットルのPBSで細胞を洗浄。 340 RCFで7分間細胞をスピンし、過剰な洗浄をデカントします。
  2. 製造業者のプロトコールに従って生/死修正可能なの死細胞染色キットを用いて、生存に染色。
  3. 340 RCFで、4℃で7分間、PBSで細胞を洗浄100μlのPBS、1％FBS中に再懸濁。
  4. のFcRは、試薬と混合する渦をブロックする1.4μLを添加することにより、単球、または他の抗原提示細胞は、ブロックのFc受容体を染色した場合。
  5. 4℃で10分間インキュベート
  6. 、表面抗体を追加し、ボルテックスし、暗所で4℃で20分間インキュベートする。
  7. PBS、1％のFBSで細胞を洗浄、過剰な洗浄をデカントし、200μlの4％パラホルムアルデヒドを追加します。インキュベート暗所で20分間室温で加えた。
  8. 250μLのPBS、1％FBS中で、PBS、1％のFBS、再懸濁して細胞を洗浄し、フローサイトメーターマルチレーザに取得（ 例えば 、BD LSRIIまたはFortessa）。

5。定量RT-PCRによる細胞の分析

  1. 細胞のためのフローサイトメトリーを介して分析していない：上清回収後、1％β-メルカプトエタノールを含む300μlのキアゲンバッファーRLT中の細胞を溶解。プロトコールを継続しない場合は、細胞は、この時点の後、-80℃で凍結することができる。
  2. 製造業者のプロトコルに従ってRNA単離キットを用いてRNAを単離する。
  3. 製造業者のプロトコルに従ってcDNA合成キットを用いてRNAからcDNAを合成する。
  4. サイバーグリーン技術を用いた定量的PCRを行う。
  5. 各プライマーのためのプライマーミックスを作成する10の最終濃度を与えるようにヌクレアーゼフリー水にプライマーを添加することにより、ハウスキーピング遺伝子（ 例えば、IL-13、IL-10、IFN-γ、GAPDH）を含んで使用程度である。氷の上においてください。
  6. うまく10.5μLのヌクレアーゼフリー水、12.5μlのSYBRグリーン、およびプレートあたり1μlのプライマーミックスを追加することによって、各プライマーのためのマスターミックスを作成します。氷の上においてください。
  7. 使用されるプレートの各ウェルにピペット24μlのマスターミックス。
  8. テンプレートに従って各ウェルに1μlのcDNAを追加します。
  9. 800 RCFで3分間キャップ井戸と遠心プレート。
  10. 定量RT-PCR装置、 例えばストラタMX3005P機器でプレートを実行します。

6。 48時間で細胞内サイトカイン染色のための適応

ブレフェルジンとモネンシン前細胞内サイトカイン染色に6時間を追加します。モネンシンは、メーカーの説明書に従って添加しながらブレフェルジンを10μg/ mlの濃度で添加される。便宜上、ブレフェルジンは5μg/ mlの濃度で染色する前の12時間後に添加することができる。

  1. 表面染色した後、中のため、PBS、1％FBSおよび染色で細胞を洗浄固定/透過処理ソリューションキットおよびプロトコルを使用して、例えば、IL-12、IFN-γおよびTNF-αなどのサイトカインtracellular。
  2. 洗浄細胞、250μlのPBS、1％のFBSに再懸濁し、マルチレーザフローサイトメーター（ 例えば 、BD LSR IIまたはFortessa）上で実行されます。

7。セルを並べ替えるための適応

  1. 製造業者のプロトコールに従って生/死修正可能なの死細胞染色キットを用いて、生存に刺激、染色後の16時間。全体の手順の間、氷上で細胞を維持する。
  2. 340 RCFで、4℃で7分間、PBSで細胞を洗浄100μlのPBS、1％FBS中に再懸濁。
  3. 、表面抗体を追加混合するボルテックスし、20分間、暗所で氷上で細胞をインキュベートする。
  4. 340 rcfで4℃でPBS、1％FBSで細胞を洗浄し、500μlの中で再懸濁し、10％ウシ胎児血清を含有する冷RPMI 1640 50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および1％を補充したHEPES。
  5. 5ミリリットルポリスチレンテープを使用したフィルタセルセルストレーナーキャップ付きルネ丸底チューブ。
  6. ウシ胎児血清を各チューブに50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、及び1％HEPESを補充した10％を含有する200μlのRPMI 1640を添加することによってソートコレクションチューブを準備する。並べ替え中に氷の上で全てのチューブを保管してください。
  7. ライブバイオハザード材料のために装備施設に位置して、機器（ 例えば 、BD FACSアリアII）の利息の細胞サブセットを並べ替える。
  8. 細胞がソートされた後、戻って所望の時間のためのインキュベーター内で、上澄み収集/ルミネックス解析、細胞ペレット収集/ PCR解析をたどる場所細胞。

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結果

このin vitro系を用いてサイトカインの測定を行う場合には、刺激なしコントロールに比較して抗原特異的応答を区別することができることが不可欠である。一般的に、我々は、アッセイの直線範囲内であった、少なくとも三倍の無刺激対照と比較してサイトカインレベルの増加および抗原刺激を与える任意の値として正の応答を検討した。我々は、弱い抗原特異的CD4 T細胞応答を観察するために、私たちが可能0.16 pg / mlでできるだけ低いサイトカインの濃度を検出できる高感度ビーズアレイアッセイを使用している。試料は、正確な値が得られることを確実にするために重複して実行される。 図2Aは、IFN-γ産生のために、アッセイは、無刺激と比較して800倍の増加の中央値を検出することができることを示している。これらの値は、無刺激と比較して、例えばIL-13およびIL-2などのために、それらのいくつかについて試験したサイトカイン、低い値に依存するであろう観察される。同様のアプローチは、種々のサイトカインテストのmRNAの転写プロファイリングにも適用されます。 図2Bは、刺激後（3...

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ディスカッション

上澄みCollectionこの実験計画の不可欠な部分です。ルミネックスアッセイのための上清を採取する際に、アリコートを作製し、サイクルの凍結融解に起因するタンパク質の分解を防止するために-80°Cで保存した。凍結融解のタンパク質について、凍結解凍を最小化することによって、過酷なプロセスであることができ、信号は、アッセイにおいて最大となる。したがって、同じ回数の凍結融解されてきたアリコートから作業する場合、反復可能かつより正確なデータを得ることが容易である。

我々は以前に、HIVのGagペプチドプール12で刺激した後、サイトカイン分泌およびmRNAレベルの動力学的分析を行った。これらの動力学に基づいて、我々はサイトカイン分泌の測定を実行するために48時間の時点を選択した。 mRNAおよびタンパク質の分泌だけでなく、種々の刺激の間に観察された差異を考慮すると、研究者が刺激に応じて、独自の運動解析を行うことが肝要である彼らは、mRNA発現またはタンパク質サイトカイン分泌を測定しているかどうかを使用して。

細胞サ...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

我々は、抗PD-L1ブロッキング抗体を提供するためのゴードン·フリーマンに感謝します。私たちは、マサチューセッツ総合病院と、このプロジェクトでの重要な役割のためのすべての研究参加者で、臨床および実験室のスタッフに感謝します。

、国立心臓肺および国立衛生研究所の血液研究所（RO1 HL-092565; DEK）、この研究は、国立アレルギー研究所と国立衛生研究所の感染症（DEK PO1 AI-080192）によってサポートされていました。 DEKは、ケベック州保健研究基金研究員のキャリア賞（FRQS）でサポートされています。 FPが研究ハーバード大学グローバルヘルス研究所（HGHI）にマサチューセッツ総合病院経営委員会のフェローシップの助成金によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Ca2+またはMg2+シグマH9394
RPMI 1640シグマR0883
Histopaque-1077シグマ10771
血清ABジェミニバイオプロダクツ100-512
ニシリン/ストレプトマイシンメディアテック30 001 CI
L-グルタミンMediatech25 005 CI
HEPES バッファーMediatech25060CI
FcR ブロッキング試薬、ヒトMiltenyi130-059-901
RosetteSep ヒト CD8+ 枯渇カクテル幹細胞15663
LIVE/DEAD 固定可能な死細胞染色キット、UV 励起用InvitrogenL23105
Rneasy Mini KitQiagen74104
Improm-II Reverse Transcription SystemPromegaA3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master MixAgilent600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714
Tween-20FisherBP337100
IFN-γ プライマーInvitrogenFOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primerInvitrogenFOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG
ヒトペ

参考文献

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