方法論記事

共有結合は、自己組織化単分子膜の手法を用いて表面上のBMP-2の結合

DOI：

10.3791/50842

⸱

2013年8月26日

 ,  , 
1Department of Biophysical Chemistry, Institute for Physical Chemistry, University of Heidelberg, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems at Stuttgart

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、表面上にBMP-2の効率的な固定化を達成するための方法を記載している。我々のアプローチは、その遊離アミン残基を介してBMP-2の共有結合を達成するために、自己組織化単分子膜の形成に基づく。この方法は、細胞膜でのシグナル伝達を研究するための便利なツールです。

要約

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骨形成タンパク質2（BMP-2）は、骨組織の細胞外マトリックス中に埋め込まれた成長因子である。このようにして治癒およびデノボ骨形成を刺激する骨芽細胞への間葉系細胞の分化のトリガーとしてBMP-2作用する。足場と組み合わせた組換えヒトBMP-2（のrhBMP-2）の臨床使用は、プレゼンテーションモードに基づいて、最近の論争を調達していると量が送達される。ここで紹介するプロトコルは、細胞へのin vitroでの研究のために、BMP-2を実現するための簡単で効率的な方法を提供します。私たちは、ヘテロ二官能性リンカーからなる自己組織化単分子膜を形成する方法を説明し、のrhBMP-2の共有結合固定化を得るために、その後の結合工程を示す。このアプローチでは、タンパク質の生物学的活性を維持しながら、BMP-2の持続的な提示を実現することができる。実際には、BMP-2の表面固定化は、非特異的な広告を防ぐことによって、ターゲットを絞った調査を可能にするorption、成長因子の量を低減しつつ、最も顕著には、表面からの制御されない放出を阻害する。細胞は、共有結合で固定化したrhBMP-2を提示する表面に露出しているときにBMP-2によって引き起こさ両方短期および長期のシグナル伝達事象は、BMP-2刺激に対する細胞応答に関するin vitro研究のためのこのアプローチが適して、行われている。

概要

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骨形成タンパク質2（BMP-2）は、 デノボ骨形成ならびに胚発生および成体のホメオスタシス1-3中のいくつかの組織の調節因子の誘導物質としてトランスフォーミング成長因子（TGF-β）ファミリーの作用のメンバーである。 生物学的に活性なホモ二量体のBMP-2タンパク質の各単量体は、非常にすべてのBMP 4に保存されている「システインノット」モチーフを、含まれています。第七のシステインは二つのモノマー5,6間の分子間結合を形成する、二量体化に関与しているのに対し、7個のシステイン残基の六つは、各単量体を安定化する分子内ジスルフィド結合を形成する。この高度に保存されたシステインノットは、BMP-2タンパク質の三次元構造を定義し、熱、変性剤及び酸性pH 7-9に対する抵抗としてのそのユニークな特性を決定する。 BMP-2は、それによってシグナル伝達を誘導する、セリン/スレオニンキナーゼ膜貫通受容体に結合する 10月12日。受容体のオリゴマーのモードに応じて、異なるシグナル伝達経路が活性化されています。のSmad非依存のシグナル伝達カスケードは、Smadの複雑な核移行との転写の活性化受容体リン酸化の結果によって活性化されたSmad依存性経路のに対し、p38シグナルを経由して、アルカリホスファターゼ誘導を導くこのような分化の阻害剤（Id）の12〜14などの特定の標的遺伝子。

骨形態では、BMP-2は、このように治癒および骨のデノボ形成を刺激、骨芽細胞への間葉系幹細胞の分化を誘導する。現在、組換え的にBMP-2は、骨折したサイトの治癒を促進するために臨床応用されている表現。骨組織工学における一般的な方法は、局所送達システムと比較して低侵襲性で注射可能な成長因子の使用である。しかしながら、 インビボ研究と臨床応用が示されているその短い生物学的半減期、非特異的locのalizationおよびBMP-2の迅速な局所的クリアランスは、いくつかの、地元の異所性および全身の問題15につながる可能性があります。従って、効果的なプレゼンテーションを得るために、材料内又は上にBMP-2の捕捉または固定化は、標的部位でのそのローカルおよび持続送達のために必要である。持続的な送達は、物理的捕捉、吸着またはイオン錯体16のような非共有結合性の保持の手法を用いて達成することができる。しかしながら、分子17の変性における表面へのタンパク質の非特異的吸着がよい結果が知られている。増殖因子の共有結合のために、支持体の種類は、過去10年間にわたって開発されてきた。例えば、タンパク質のアミノ基またはカルボキシル基を標的とする二官能性連結分子の使用は、必ずしも固定化を達成するために、タンパク質の修飾を必要としないアプローチの一種である。実際には、一方のタンパク質修飾は、タンパク質の配向を制御するという利点を提供人工的なドメイン、ペプチドタグおよび部位特異的鎖の導入は、成長の生物学的活性は、17因子変更することができる。従って、原因支持材料との相互作用のために変性を回避するために、表面が所望の因子18のカップリングに続いて、連結分子の自己組織化単分子膜（SAM）を用いて、例えば、予め官能化することができる。我々は、その遊離アミン残基を標的とすることによって共有結合的に表面にBMP-2を固定化するSAMベースのアプローチを使用して、固定化タンパク質がその短期および長期の生物学的活性の19の両方を保持することが示されている。このプロトコルは、細胞膜で発生し、骨形成シグナルを担当する細胞内シグナル伝達を調節するメカニズムに関するin vitro試験のための細胞にBMP-2を実現するための簡単で効率的な方法を提供します。

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プロトコル

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1。 11-Mercaptoundecanoyl-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MU-NHS）の合成

  1. 室温（RT）で40 mlのジクロロメタン（PA）中の10 mlのアセトン（PA）（ジメチルアミノ）ピリジン1gの11 -メルカプトウンデカン酸- 500mgのN-ヒドロキシスクシンイミドの溶液及び30mgの4滴ずつ加える。
  2. 0℃に反応液を冷却し、（窒素雰囲気下）ジクロロメタン10mlを滴下1.1グラムN、N ' -ジシクロヘキシルカルボジイミドを加える。 1時間低温で反応を維持し、次いで室温で一晩撹拌する。
  3. 沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥させます。 1:1の割合で石油ベンゼン、酢酸エチル（PA）を用いるフラッシュクロマトグラフィーによって生成物を精製する。

2。均質な金層の作製

  1. 精密ワイプとし、酢酸エチル（PA）およびメタノール（PA）の1:1混合物を含有する溶液中で5分間超音波処理して清浄なガラスカバースリップ。 RinsE基質メタノールで、窒素気流下で乾燥させます。
  2. スパッタコーティング装置ではクリーンな基板を配置します。チャンバを排気。 60秒間スパッタ法により、クロムターゲットから最上部のクロム酸化物層を除去。金属線と40 nmの金の層を塗布し、その後10nmのクロム層でコートして下にサンプルを置きます。

3。 BMP-2の表面固定化

  1. 約1mMの最終濃度までNにおけるMU-NHS、N-dimethlyformamide（DMF）に溶解し、窒素雰囲気下で4時間RTにてMU-NHS溶液中に金基板をインキュベートする。
  2. 2分間DMF中で超音波処理表面は、DMF、MeOHで洗浄し、窒素気流下で乾燥させます。
  3. 100μg/ mlの（-80℃で保存アリコート）の濃度で滅菌した4 mMのHCl中のrhBMP-2のストック溶液を準備します。ワーキング希釈液（3.5μg/ ml）をするために、PBS / NaClを（PBSで1 M NaClを含む）と、中のストック溶液を希釈使用直前にpH8.5にdjust。
  4. 一晩4℃でのrhBMP-2作業溶液中にMU-NHS官能表面をインキュベートする。インキュベーション上清を取り除きます。超音波処理は、2分間、PBS / NaCl中に表面および滅​​菌PBS / NaClで3回洗う。

4。表面特性化

  1. 抗体の非特異的吸着をブロックするために、抗BMP-2抗体（1:100、1％（重量/体積とのインキュベーション、続いてRTで1時間PBS溶液中の5％BSA（w / v）ので表面をインキュベートするRTで1時間）BSA / PBS溶液）。 PBSおよび30秒間の超音波処理で二回表面を洗浄します。
  2. 次いで、PBSで二回洗浄し、RTで30分間HRP結合二次抗体（1:1,000、1％（w / v）のBSA / PBS溶液）で基質をインキュベートする。
  3. プレートリーダーを用いて570nmでのHRP酵素活性を測定するためにAmplifluレッドアッセイを使用する。

5。生物学的活性の解析

  1. シード1×10 6ウェルPLにおけるウェルあたり5マウスC2C12筋芽細胞10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび37℃/ 5％CO 2で24時間、それらをインキュベートを補充したピルビン酸塩を含有する高グルコースDMEMからなる増殖培地中でのATE。
  2. 固定化されたBMP-2で飾られた表面に播種する前3-5時間無血清DMEMで細胞を餓死。
  3. 短期的なシグナル誘導の調査のために、200μlの新鮮な無血清DMEMで培地を交換し、細胞上に固定化BMP-2の表面に配置します。表面は傷を避けるために、先端の細いピンセットで処理する必要があります。
  4. 優しく表面を削除し、ピペットで培地を吸引、PBSで2回細胞を洗浄。細胞応答の分析に進みます。
  5. 長期の生物学的活性の分析のため、細胞をプレート低血清条件（2％FBS）で表面及び37℃/ 5％CO 2で培養して上に6日間。

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結果

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それは生物学的に不特定の化学的な調整可能なシステムを提供していますので、我々のセットアップでは、金を賦形剤として選ばれた。さらに、自己組織化単分子膜の適用は、多くの利点を伴う。それらの官能末端基をさらに修正することができながら、SAMは自然に、金属や欠陥の少ないフォーム単層上での「ヘッドグループ」を経由して吸着する。こうして彼らは、制御された、まだ適応性の高い方法で20で、インターフェイスの特性を調整するためのプラットフォームを提供します。

金でコーティングされた表面上のBMP-2の固定化のために、我々は、2段階のアプローチを使用した：1）タンパク質（ 図1参照）とリンカーとを反応さ）の金層にMU-NHSリンカーと結合して、[2。のrhBMP-2の結合を証明するために、我々は、酵素免疫測定法を使用した。このアッセイにおいて、固定化されたrhBMP-2を提示する表面は、BMP-2特異的抗体およびHRPとコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした。後者の結合は、Dが可能Amplifluレッド溶液を使用してetermined。過...

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ディスカッション

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このプロトコルでは、生物活性のrhBMP-2で官能化表面の調製が記載されている。 ;のrhBMP-2タンパク質の2）の共有結合固定金表面上の二官能性リンカーの自己集合単分子層（SAM）の1）初期形成：このアプローチは、2つのステップを含む。以前の研究では、二官能性リンカーおよび成長因子の有効な結合を検証し、表面固定化のrhBMP-2は、その生物学的活性19を維持することを実証した。固定化された形で提示成長因子の生物活性はまた、タンパク質の放出およびそれらのその後の内在化は、細胞刺激24,25に必須でないことを示す、他の研究で示されている。細胞膜22,2であるため、異なるタイプの受容体の増強された占有率の有効投与量を維持しながら、実際には、成長因子の共有結合固定化は、標的細胞の持続的な刺激を可能にする3,26-28。

固定化されたrhBMP-2、気を提示する表面の調製のために全体の手順を通して表面の処理にとのrhBMP-2溶液を製造する際に注意が必要です。カバーガラスは、清潔で乾燥しなければならず...

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開示事項

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著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は彼の親切なサポートのために教授JPスパッツ（生物物理化学、ハイデルベルク大学、新素材やバイオシステムズの専攻、知能システムのためのマックスプランク研究所、シュツットガルト）に感謝。マックスプランク研究機構とドイツ学術振興（EAC-AへのDFG SFB/TR79。）からの財政支援も大幅に認められている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
N-ヒドロキシスクシンイミドSigma-Aldrich130672 
4-(ジメチルアミノ)ピリジンSigma-Aldrich522805 
アセトンAppliChemA2282 
11-メルカプトゥンデカン酸Sigma-Aldrich674427 
ジクロルメタンメルク106050 
N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドSigma-AldrichD80002 
石油ベンゼンメルク 
ガラスカバースリップカールロスM 875 
酢酸エチルChemA3550 
メタノールカールロス4627 
N,N-ジメチルホルムアミドカールロスT921 
rhBMP-2R&D Systems355-BMキャリアフリー; E.coli
PBSPAAH15-002  で表されます。
NaClロスHN00.2 
ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)ダウコーニング 
シルガード184シリコーンエラストマーキットダウコーニング 
対rhBMP-2シグマB9553 
ヤギ抗マウスIgG-HRPSanta Cruzsc-2005抗体
アンプリフルレッドアッセイSigma90101 
ダルベッコ モディファイド イーグル ミディアム (DMEM) (1x)、液体Gibco41966高グルコース
ウシ胎児血清 (FBS)SigmaF7524滅菌ろ過、細胞培養試験
Pen/StrepGibco15140 
トリプシン 0.05% (1x) と EDTA 4NaGibco25300 
グリシン (0.1 M)Riedel-de Haën33226 
IGEPAL CA-630 (1%)SigmaI8896溶解バッファー (ALP アッセイ)19
>塩化マグネシウム (MgCl2)(1 mM)Carl RothHNO3.2 
塩化亜鉛 (ZnCl2) (1 mM)Carl Roth3533.1 
p-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)SigmaS0942ホスファターゼ基質
抗ミシン重鎖(MHC)発生研究 ハイブリドーマバンク、アイオワ大学MF20モノクローナル抗体
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスIgGInvitrogenA11001 
DAPIシグマD9542 
Equipment
Ultrsonicバス(Sonorex Super RK 102H)、周波数35 kHzBANDELIN electronic GmbH Co. KG 
MED 020 スパッタコーティングシステムBAL-TEC AGコーティング条件
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 プレートリーダーTecan 
カール二次済み

参考文献

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