鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

サマリー

スカベンジャーは無病領域に糞中の感染伝達性海綿状脳症プリオンを移動させる可能性を持っている。私たちはマウス適応スクレイピープリオンはアメリカのカラスの消化管（ アメリカガラス ）、死んだ動物の共通の消費者も通過した後、感染のままかどうかを判断するために使用される詳細な方法。

要約

感染性プリオン（PRP ^RES）材料は、おそらく致命的な神経変性伝達性 ​​海綿状脳症（TSE）の病気¹の原因である。例えば、慢性消耗病（CWD）などのTSE疾患の送信は、動物から動物への^2,3並びに環境源^4-6からであると推定される。スカベンジャーと肉食動物は、CWDに汚染された死肉の摂取と排泄を通してプリオン^{解像度材料}を移動させる可能性を持っている。最近の研究はアメリカのカラスの消化器系（ アメリカガラス ）、一般的な北アメリカのスカベンジャー⁷を通してプリオン^{解像度素材}の通過を文書化しました。

我々はアメリカのカラスを通じてプリオン^{解像度素材}の通過を記録するために使用される手順について説明します。カラスはRML - ひずみマウス適応スクレイピーで強制経口投与し、それらの糞は4時間後に強制経口投与を収集した。カラスの糞をし、その後プールし、腹腔内に注射したC57BL / 6マウス。彼らはマウススクレイピーの臨床徴候を表明し、その後、安楽死させたまではマウスを毎日モニターした。無症候性マウスは365日後に接種するまで監視した。ウェスタンブロット解析は、疾患状態を確認するために行った。結果は、プリオンがカラスの消化器系を通って移動した後に感染性のままであり、試験マウスにおいて疾患を引き起こす、糞便中に存在することが明らかになった。

概要

伝達性海綿状脳症（TSE）は、野生生物に影響を与える致命的な感染性の神経変性疾患、家畜、そしてヒトである。 TSE疾患の感染性病原体はプリオンタンパク質¹のミスフォールドまたは病原性アイソフォーム（PRP ^RES）であるように思われる。ヒツジおよびヤギにおけるスクレイピー;、牛海綿状脳症（動物TSE疾患はラバ鹿（ ミュールジカ ）、オジロジカ（ オジロジカ ）、エルク（ アカシカ ）、およびムース（ ヘラジカ ）の慢性消耗病（CWD）が含まれ国内の牛のBSE）;養殖ミンクにおける伝染性ミンク脳症、ネコのネコ海綿状脳症、ヒト以外の霊長類⁸にし、海綿状脳症、エキゾチックな動物園のエキゾチックな有蹄動物海綿状脳症は、家族ウシ科の反芻。単一のヒトTSE病、変異型クロイツフェルト·ヤコブ病は、稀で、 ^解像度のPrP-contaminを消費することによって取得されると考えられているated食品^9。汚染された牛肉が¹⁰消費された場合も、BSEはヒトに感染することができます。すべてのTSE疾患のうち、スクレイピーおよびCWDは、動物から動物^2,3,11にだけでなく、環境源^4-6からのものであると推定される自律的な流行と感染のソースでのみ2である。研究では、ほとんどのTSE疾患は臨床徴候が発現する前にプリオン^解像度素材^の自然曝露イベントからの注目すべき拡張潜伏期間が必要^2-4,6,8、見かけ種の壁を最小限に、しかし、種間伝播^12月14日の可能性を排除しないことを示唆している。

感染性プリオン（PRP ^RES）材料の普及のためのメカニズムを識別することはTSE疾患が風景を越えて移動する方法についての質問に答えるために非常に重要です。実験的研究は、昆虫^15,16、家禽および豚^17、およびアメリカのカラス（ カラスのブラチことが示唆されている^{hyrhynchos）7,18は、PrP解像度材料}の受動的なキャリアまたは分散機である。カラスの消化器系を通じてプリオン^のRES物質の通過は最近、TSE疾患⁷の分散でプレイしてもよい役割を示す、文書化されています。これらの結果は、カラス、スカベンジャーは、遭遇する可能性があること、それがもっともらしい作る消費し、無病領域に、糞の堆積により感染性物質を輸送する。

我々はここに証明する手続きは、カラスの消化システムを介してプリオン^のRES物質の通過を記録するために使用されたと大いに関連する今後の研究の他のスカベンジャーと肉食種特異的なモデルに、これらの方法の適用を容易にします。本研究では、従来の方法は、プリオン^{解像度素材}の広がりと全体的な重荷に貢献できるプリオン^{解像度素材}を、人身売買の型破りな手段を調査するために使用された。

プロトコル

我々のプロトコルは、我々が以前に^7を発表^した1から採用されている。動物に関わるすべての手続きは、米国農務省（USDA）、動植物衛生検査局（APHIS）、野生動物サービス（WS）、国立野生生物研究センター（NWRC）の施設内動物管理使用委員会によって承認された。

1。カラスGavaging

1. アメリカのカラスの消化管を通して「疑似脳物質 'の通過時間を見積もります。
   1. 調理の5ミリリットルを混合し、強制経口投与針2（ 図1）を用いた青色色素および強制経口投与1カラスと全卵をスクランブル。
   2. 青/緑に染色された糞はもはや排泄されるまで、30分ごとにカラスないことを確認してください。
2. 感染していないと末期RML（チャンドラー株）に感染したC57BL / 6マウスの脳を入手します。
3. 1Xと弾丸ブレンダーホモジナイザーの通常20％重量/容量、感染したマウス脳乳剤を生成リン酸緩衝生理食塩水（PBS）とガラスビーズを、次いで、より大きな粒子状物質を除去するために1分間3,000×gで遠心する。上清を除去し、無菌のPBS中の10％重量/体積を生成するために、1×PBS等容量の希釈した。必要になるまで-80℃で凍結する。
4. 前胃管栄養への17時間は、カラスのペンから、水食料を削除ではなく。
5. 無作為に処置群にカラスを割り当て、強制経口強制栄養針2を使用して正常または感染したいずれかのマウス脳ホモジネート5mlでそれぞれカラス。
6. 転送は、個々のケージにカラスや4時間後、胃管栄養法（ 図2）のために、各ケージ内のすべての糞を集め、プール。
7. 均一な組織が得られるまでガラスビーズと弾丸ブレンダーホモジナイザーの各カラスのためにプールされた糞を均質化する。 *カラスの糞は主に液体であり、容易に混合することができる。
8. 各カラスのために、10ミリリットルの全容量のために9.5ミリリットルの1X PBSに糞便ホモジネート500μlの希釈する。
9. 糞便homogenaを遠心分離1400×gで15分間のTE、上清を抽出します。
10. 二微生物感染の脅威を最小限ホモジネート、100μlの1〜100単位の液/ mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシン（Invitrogen社、NY）を用いて上清を治療するためにその後減少させるために20分間室温でUV光下に置くウイルスおよび細菌汚染のリスク。 UV露光した後、残りの微生物の膜を破壊するために30秒間70を設定することで、3000 Mpは超音波処理における超音波処理のサンプル。

2。マウス接種

1. 無作為に以下の処置群（ 表1）にマウスを割り当てる。
   1. グループ1 - 陽性の処置マウスは経口5ミリリットル感染マウスの脳を強制飼養カラスからの糞便ホモジネート1mlで腹腔内（IP）接種した。
   2. グループ2 - 負の処置マウスは、経口5ミリリットル、通常のマウスの脳を強制飼養カラスからの糞便ホモジネート1mlのIPアドレスを接種した。
   3. infecteを希釈1×PBSで1:100重量/容量のグループ3および4のdおよび正常マウス脳ホモジネート。
   4. 第3群 - 陽性対照マウスは、感染マウス脳ホモジネート1mlのIPを接種した。
   5. グループ4 - 陰性対照マウスは正常マウス脳ホモジネート1mlのIPを接種した。

	治療グループ	動物の数
グループ1	スクレイピー+クロウ糞	100
グループ2	スクレイピー - クロウ糞	25
グループ3	スクレイピー+マウス脳	10
グループ4	スクレイピー - マウス脳	5

表1スクレイピー接種の状況（負正+、 - ）と動物の数が^7を使用し^ていました。

2. 腹腔内にマウスに接種：
   1. 優しく首筋の親指と人差し指で背面の首の毛皮によるマウスとは、腹側を露出させ回転させます。
   2. ヘッドがやや低いので、マウスの後端部を上昇させる。
   3. 針ロック注射器を用いて仙腸関節にCM前部皮膚を通して25 G針1センチ、正中線の左右1cmの1-2を挿入します。
   4. 1mlを、マウスの体腔内に徐々に接種注入する。

3。マウスの監視

1. 彼らはマウススクレイピーの臨床徴候を表現まで毎日マウスを監視します。臨床症状は含まれる：脊柱後、運動失調、硬い尾、グルーミング、衰弱、および嗜眠の欠如を。
2. 0目に見える=なし、1 =中等度、および2 =が激しいところ目に見える兆候は、明らかであるとき6臨床徴候のそれぞれにマウスを獲得。
3. 3日間、または365日後に接種（DPI）で連続6それぞれの記号の1日の総得点は1日の≥8に到達したときに、マウスを安楽死させる≥。
4. 収穫脳直後のeuthan-70℃でのアジアと店舗
5. 、スクレイピー診断を確認、次のように希釈されたプロテイナーゼK溶液（PK）の50μg/ mlのの3μlの脳サンプルを消化するために：3.1。 μlのPK、500mMのEDTA12.5μlの、pH8で、45℃で30分間、1×PBSの109.39μlを、次いで、8μlのローディング緩衝液を添加し、95℃で5分間、サンプルをインキュベートすることによってPKを不活性化する。 12％SDS-PAGEゲル電気泳動させると、室温で1時間、PBS中の0.2％のTween 20でイモビロンPVDF膜を5％脱脂乳でブロックへの転送上に負荷サンプル。次いで、室温で1時間のSuperblock中で希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ、Bar224にコンジュゲート抗プリオンモノクローナル抗体でプローブする。 PBS-0.2％Tween 20で1時間、膜を洗浄します。可視化するために、G-ボックスゲルドキュメンテーションシステムに化学発光基質およびイメージを使用してウエスタンブロット5分間インキュベートする。

結果

使用手順は、カラスの消化器系は、スクレイピー脳ホモジネート⁷の強制経口投与した後にPrPの^解像度感染性4時間を排除しないことを示している。プリオン^{解像度材料}で強制経口投与されたすべての20カラスはその後、マウスに糞を経由したPrP ^{解像度素材}を送信した。ウェスタンブロット分析によって完了した罹患したマウスは、臨床マウススクレイピー徴候および疾患確認の発現によって同定した。

カラスが摂取物質の保持時間の検討糞便中の染料の存在（ 図1）に基づいて、4時間であることが強制飼養カラスのための消化管の通過時間を明らかにした。すべての糞は、使い捨てピペットを用いて収集し、それぞれのカラス（ 図2）のためにプールした。生の糞便上清をパイロットテストのマウスに腹腔内注射されたときに未処理のカラスの糞便から急性毒性が発生しました。ペニシリン及びSTREと糞便接種を処理することによりptomycin、紫外線、超音波処理、我々はこの問題を軽減する。 ...

ディスカッション

私たちは、カラスの消化器系を通じてプリオン^のRES物質の通過を文書化するための手順を示しています。私たちは、カラスが無病の地域へのプリオン^{解像度素材}を転位する能力を持っているかどうかを判断するために、従来の方法を使用していました。他はそれを排除することができなかった、どちらも^19〜21と齧歯類^22,23消化液を反芻するプリオン^解像度の抵抗を評価した。彼らはまた、潜在的に死肉中のPrP ^{解像度材料}に遭遇し、プリオン病の蔓延を促進する風景全体でこの材料を輸送する可能性があるため、これらの技術の将来の適用は²⁴他の肉食動物に適用する必要があります。

私たちは、カラスの消化管を通して均質化されたマウスの脳のおおよその通過時間を評価するための簡単​​な方法を提供し、私たちのスクランブルエッグ "疑似脳の物質に青い食品着色料を追加しました。我々は最初のインに、この手法を検討して他の人にアドバイス実験動物の既存の糞の色をPECTしてか...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RML チャンドラー株 マウス適応スクレイピー	ロッキーマウンテン研究所
RC57BL/6 マウス	ヒルトップ 実験動物
アメリカカラ	野生捕獲
ペン/連鎖球菌	Invitrogen	15140-122
リン酸緩衝生理食塩水	Invitrogen	70011-044
ソニケーター	Misonix
Proteinase-K solution	Roche	3115887001
ローディングバッファー	Invitrogen	NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel	Invitrogen	NP0342
Immobilon PVDF membrane	Millipore	1SEQ00010
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Bulletブレンダーホモジナイザー	Braintree Scientific	BBX24B
2.3 mm ジルコニア/シリカビーズ	BioSpec 製品	11079125Z
Bar224 抗 PrP モノクローナル抗体	ケイマン ケミカル	10009035
スーパーブロック	サーモサイエンティフィック	37517
化学発光基質	ミリポア	WBKLS0500
G-boxゲルドキュメンテーションシステム	Syngene