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方法論記事

全細胞MALDI-TOF質量分析は、マクロファージ活性化の異なるモードを分析するための正確かつ迅速な方法である

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DOI:

10.3791/50926

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2013年12月26日

 ,  ,  ,  , 
1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

この記事について

サマリー

このプロトコルは、真核細胞に対する全細胞MALDI-TOF質量分析の使用を説明しています。ここでは、マクロファージの微小環境に応じた複数の活性化状態を分析することにより、この手法の精度を示します。

要約

MALDI-TOFは、化学および生化学で広く使用されている質量分析技術です。また、分子やバイオマーカーを特定するために医学にも応用されています。最近では、臨床サンプルから増殖した細菌を、調製や分画のステップなしで日常的に同定するために微生物学で使用されています。私たちと他の人々は、この全細胞MALDI-TOF質量分析技術を真核細胞にうまく適用しました。現在のアプリケーションは、細胞タイプの同定から、細胞培養の品質管理評価、診断アプリケーションまで多岐にわたります。ここでは、サイトカインや熱死菌に応答したマクロファージのさまざまな分極表現型を探索するためのその使用について説明します。これにより、マクロファージのプロテオミクス応答の多様性を代表するマクロファージ特異的なフィンガープリントの同定が可能になりました。このアプリケーションは、メソッドの精度とシンプルさを示しています。ここで説明したプロトコルは、病理学的状態における免疫宿主応答の研究に役立つ場合もあれば、より広範な診断アプリケーションに拡張することもできます。

概要

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF MS)は、生体サンプルを研究するための一般的な質量分析技術です。レーザービームとエネルギー吸収マトリックスを使用すると、ソフトイオン化プロセス、つまり、主に単電荷の大きな生体分子の蒸発と生成が可能になります。このプロセスは脱着/イオン化と呼ばれ、頭字語MALDIを正当化します。次に、これらのイオンは電圧の印加によって加速され、TOFアナライザーに入り、これらのイオンの分離とそれぞれの質量の定量化が可能になります1。

MALDI-TOF MSは、生物学、化学、医学の分野で、分子やバイオマーカー2-4の同定や、proteins5,6の翻訳後修飾を監視するために広く使用されています。最近、いくつかのグループが臨床サンプル7,8からの微生物の同定にMALDI-TOF MSを適用しました。この微生物学的アプリケーションは、現在、臨床現場で日常的に使用されています。全細胞MALDI-TOFは、従来のMALDI-TOF MSアプリケーションと比較して多くの利点があり、全細胞を含むサンプルを直接処理するため、大量の材料を分画または分離するための時間のかかる手順を回避できます。さらに、さまざまなピークの特性評価は必要ありません:スペクトル全体がサンプルのフィンガープリントと見なされ、マッチングアルゴリズムはテストされたスペクトルを参照スペクトルのデータベースと比較します。

私たちや他の人々は、この全細胞解析技術を真核細胞に適用しました。この手法から多くのアプリケーションが導き出される可能性があります:(1)混合サンプル9-11から主要な細胞型を同定します。(2)細胞培養の生存率を経時的に評価する(品質管理産業への応用を含む)12;(3)単一細胞型13の活性化状態をモニターするステップと、(4)臨床サンプルの悪性形質転換を評価する14,15。

ここでは、サイトカインまたは熱死菌に応答するマクロファージのさまざまな分極表現型を探索するための全細胞MALDI-TOF MSの使用について説明します。マクロファージは、微生物病原体に対する免疫応答において極めて重要な役割を果たします。彼らは、リポ多糖(LPS)16などの保存された微生物パターンを検出できるパターン認識受容体を介して、組織内の感染性病原体を検出します。マクロファージは、T細胞と相互作用して適応免疫応答を開始する専門的な抗原提示細胞です。T細胞は、マクロファージの微殺活性を強化または調節するサイトカインを放出することにより、マクロファージに影響を与えます。Th1/Th2リンパ球分極と同様に、炎症性マクロファージ、殺菌性マクロファージ、殺腫瘍性マクロファージはM1マクロファージに分類され、免疫調節マクロファージはM2マクロファージとして分類されている17-19。M1という用語は、インターフェロン(IFN)-γや腫瘍壊死因子(TNF)などのI型サイトカイン、またはLPS18,20-23などの細菌産物によるマクロファージの古典的な活性化を指すが、代替経路(インターロイキン(IL)-4、IL-10、トランスフォーミング成長因子-β1)によって活性化されたマクロファージはM2マクロファージ19,24,25.マクロファージは、その微小環境に応答して表現型および機能的な可塑性が高いため、これらのマクロファージはMALDI-TOF MSアプローチによる微妙な変化の解析に有用です。

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プロトコル

現在のプロトコルでは、全細胞MALDI-TOF技術を使用して、サンプルのフィンガープリントと見なされる質量スペクトルを取得します。バイオインフォマティクス分析により、これらの指紋の比較と分類が可能になりました。このプロトコルには、次の3つの主要な部分がありました。

  1. 生物学的サンプルの調製:マクロファージおよび異なるアゴニストで刺激されたマクロファージを制御します。
  2. 全細胞MALDI-TOF MSによるテクニカルレプリケートによる各タイプのサンプルの分析。
  3. 生データのバイオインフォマティクス分析。

細胞単離と培養のための無菌溶液を準備します。すべての試薬を調製し、4°Cで保存

します。

1. ヒト単球の調製

  1. 細胞培養液を調製します。55 mLのヒト血清AB+またはウシ胎児血清(FBS)と5 mLの抗生物質溶液(ペニシリン10,000 UI/mL、ストレプトマイシン10,000 μg/mL、最終濃度ペニシリン100 UI/ml、ストレプトマイシン100 μg/ml)をRPMI 1640培地(500 ml)に加えます。
    1. 末梢血単核細胞(PBMC)をロイコパック(白血球濃縮物)から単離します。
      1. 15mlのFicollを含む50mlのチューブを準備します。血液を生理食塩水で希釈します(vol / vol、1/10)。前述のように、30 mLの希釈PBMCをFicollに沈殿させる26。
      2. 700 x gで20分間遠心分離し、Ficoll(密度1.077 g/ml)と希釈血漿との間の界面でPBMCを回収します。PBMCを培地で希釈し、300 x gで5分間遠心分離します。
    2. 抗CD14抗体でコーティングした磁気ビーズを用いてPBMCからCD14+単球を調製します
      注:単球が採取されるまで、製品と細胞を4°Cに保ちます。
      1. pH 7.2のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、および2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)からなるランニングバッファーを調製します。
      2. ペレット化したPBMC(アッセイあたり107細胞)を80 μlのランニングバッファーに穏やかに解離します。
      3. 20 μl の CD14 MicroBeads を PBMC に添加します。 PBMCを15分間混合してインキュベートします。 PBMCを5 mLのランニングバッファーで洗浄し、300 x gで5分間遠心分離します。ペレット状PBMCを500 μlのランニングバッファーに穏やかに解離し、108 PBMCs.
        注:108 PBMCs未満のPBMC濃度には、500 μlのランニングバッファーを使用してください。
      4. 磁気分離に進みます.
        注:2 x 108 PBMC未満の場合は、MSカラムを使用してください。2 x 108 PBMC以上および2 x 109 PBMC未満の場合は、LSカラムを使用します。
      5. プレカラムとカラムをランニングバッファー(MSカラムの場合は500 μl、LSカラムの場合は3 mL)で洗い流します。 PBMCをプレカラムに追加します(ラベルのない細胞がカラムを通過するのを待ちます)。 ランニングバッファー(MSカラムの場合は500 μl、LSカラムの場合は3 mL)で3回すすぎます。 プレカラムを取り外します。
      6. カラムを15 mLチューブの上に置きます。 ランニングバッファー(MSカラムは1 mL、LSカラムは5 mL)をカラムに添加し、カラムに圧力をかけてCD14+細胞を溶出します。
      7. 溶出液を300 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。 単球ペレットを10mlの培地で洗浄します.
        注:抗CD14抗体とフローサイトメトリー(古典的に95%以上)を使用して、単球調製物の純度を分析します。
  2. 単球のマクロファージへの分化。
    1. 単球(1ウェルあたり106個の単球/ウェル、6ウェルプレート)を、10%ヒト血清AB+を含む3 mLの培地で37°Cでインキュベートします。4日後、ヒト血清を含む培地を10%FBSを含む3mlの培地でさらに3日間交換します。
    2. 得られた細胞集団をフローサイトメトリーにより、単球由来マクロファージ(MDM)として同定します(図1を参照)。
      1. 培地を3mlのPBSと交換します。ゴム製の警官でMDMをこすり落とし、MDMのサスペンションを収集します。400 x gで5分間遠心分離します。ペレット化したMDMに2%BSAを含むPBSを添加し、細胞懸濁液を穏やかに攪拌します。細胞濃度を調整し(200 mL PBS中に106 MDM)、4°Cでインキュベー
        2. トします。
      2. 10 mLの抗CD14抗体と10 mLの抗CD68抗体をMDM懸濁液に加え、4°Cで20分間暗所でインキュベートします><。 注:これらの抗体は、フローサイトメトリー分析と一致する2つの異なる蛍光色素で標識する必要があります。例えば、抗CD14抗体は、フィコエリトリンと結合した抗体(単球染色用)および抗CD68抗体とAlexa Fluor 647を結合して結合させ(マクロファージ染色用)してもよい。
      3. MDMを400 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。細胞ペレットを穏やかに解離し、MDMを250 mLの3%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で15分間インキュベートします。PFA固定MDMを400 x gで5分間遠心分離します。MDMを3 mLのPBSで洗浄し、MDMを400 x gで5分間遠心分離します。MDMペレットを400 mL PBSで穏やかに解離します。
      4. 単球(CD14を発現するがCD68は発現しない)から単球(CD68を発現するがCD14は発現しない)への分化を解析します。注:従来、細胞の95%以上がMDMです。
  3. MDMの18時間刺激。
    1. 接着性MDMの培地を新鮮な3 mLの培地(FBSを10%含む)に交換します。
    2. M1またはM2分極を誘導するには、M1分極にはIFN-γとTNF、M2分極にはIL-4のヒト組換えサイトカインを使用します。M1マクロファージは、LPSによる刺激によっても得られます。サイトカインのストック溶液は-80°Cで保存され、LPSのストック溶液は-20°Cで保存されることに注意してください。
      1. IFN-gγ (1 mg/ml) の原液を培地で 1/100 で希釈し、希釈液 10 ng/mL にします。この IFN-γ 希釈液を 6 μl を MDM に加えて、最終的な IFN-γ 濃度 20 ng/mL を得ます。
      2. TNFのストック溶液(1 mg/mL)を培地で1/100で希釈し、10 ng/mLの希釈液を得る。このTNF希釈液を6 μlをMDMに添加すると、最終的なTNF濃度が20 ng/mlになる。
      3. IL-4 (1 mg/ml) のストック溶液を培地で 1/100 で希釈し、希釈液を 10 ng/mL にします。この希釈液を 6 μl を MDM に加えて、最終 IL-4 濃度を 20 ng/mL にします。
      4. LPSのストック溶液3μl(1 mg/mL)をMDMに添加して、最終LPS濃度1 μg/mlを得ます。
    3. バクテリアでMDMを刺激するには、熱殺されたバクテリアを使用します。生きているバクテリアをPBSで洗い、95°Cで1時間加熱します。Orientia tsutsugamushi(Kato株(CSUR R163)、Mycobacterium bovis(Bacillus Calmette-Guérin、BCG CIP株671203)、Coxiella burnetii(Nine MileフェーズI)は、これらの病原体がマクロファージに感染することが知られているためである。したがって、O. tsutsugamushi懸濁液を109 bacteria / mlで調製します。MDMに50μlを添加します。M. bovisとC. burnetiiについても同じ手順を繰り返します。
  4. MALDI-TOF MSの生体試料の調製
    1. Ca2+またはMg2+を含まないPBSで刺激されたMDMを洗浄します(細胞はCa2+またはMg2+の存在下で凝集する可能性があります)。ゴム製の警官でMDMをこすり落とし、MDMのサスペンションを収集します。MDMを遠心分離し、Ca2+またはMg2+を含まないPBSでMDMを400 x gで5分間再度洗浄し、FBS汚染を廃棄します。
    2. 細胞濃度を調整します(アッセイあたり2 x 106 MDM)。MDMを400 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。Ca2+またはMg2+を含まないPBS20 μlに細胞ペレットを回収します。
    3. サンプルはすぐに分析するか、分析前に-80°CのPBSに保存してください。

2. 全細胞Maldi-TOF MSによるマクロファージの解析

  1. CHCAマトリックスの調製。
    1. アセトニトリル500 μl、10%トリフルオロ酢酸250 μL、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 水250 μlをバイアルに加えます。この溶液中のCHCA10 mgを最終濃度10 mg / mlに希釈します。少なくとも20分間混合し、超音波処理します.
      注:超音波処理はマトリックスの彩度を改善しますが、このステップは必須ではありません。
    2. 13,000 x gで5分間遠心分離し、ペレットを廃棄し、上清を保持します.
      注:マトリックス溶液は使用直前に調製してください。 結晶を含むマトリックス溶液では、サンプル分子の良好なイオン化ができず、スペクトルの品質に影響を与える可能性があります。
  2. MALDI鋼製ターゲットの準備。
    1. 磨かれたスチールターゲットを熱い水道水で湿らせます。精密ワイプ紙でこすります。70%エタノールを加えてこすります。こすって水ですすいでください。エタノール70%を加え、精密紙でこすります。
    2. ターゲットを70%エタノールに浸し、少なくとも15分間超音波処理し、ターゲットを500μl〜1mlのトリフルオロ酢酸で80%覆います。精密紙でこすり、拭きます。こすらずにHPLC水ですすいでください。ターゲットを室温で乾燥させます.
      注:ターゲットのクリーニングが不適切な場合、スペクトルの品質に影響を与える可能性があります。
  3. 預金の準備。
    1. きれいなターゲットを水平で水平なサポートに置き、均一な堆積物を取得します。
    2. MDMサンプルを氷上で静かに解凍します。注:急速かつ激しい解凍は、サンプルを変化させ、スペクトルの品質に影響を与える可能性があります。MDMをホモジナイズ(細胞懸濁液をピペッティングで前後に動かして)してから、MALDIターゲットに1μl(約1 x 105細胞を含む)を沈殿させます。サンプルにMALDIマトリックス溶液1μlを加えます。ピペットとのスポット混合は避けてください。スポットをピペットで混合すると、スペクトルの品質が変わります。12-16サンプル/アッセイを堆積させます(テクニカルレプリケート)。
    3. 室温で自然に蒸発します。注:蒸発は徐々に起こり、マトリックス/サンプル結晶の形成につながります。堆積物は、すぐに分析するか、分析前に数日間(最大2週間)暗闇で保管することができます。
    4. ユーザーは、実験で使用したサイトカインまたは熱死菌が、刺激されたマクロファージのスペクトルの範囲内でピークを提供しないように制御する必要があります。ここでは、サイトカインと熱死菌だけでは、研究範囲(0-20 kDa)内でシグナルが得られないことを確認しました。
  4. 質量分析計のチューニングとデータ取得。
    1. サンプルを含むスチールターゲットを質量分析計に挿入します。
    2. 質量分析計を構成し、データ取得を実行します。データの自動集録にはデフォルトの設定を使用します。
    3. 注:flexControlソフトウェアの設定の詳細については、付録/表1を参照してください。これは、使用する質量分析計やソフトウェアによって異なる場合があります。

3. バイオインフォマティクス分析

注:バイオインフォマティクス分析は、無料のオープンソース統計分析ソフトウェアRと特定の分析ライブラリ(MALDIquant)を使用して実行されました。Rは、そのWebサイトhttp://cran.r-project.org/ から無料でダウンロードできます。スクリプトの詳細な説明は、補足資料として提供されています。

  1. 生データの読み込みと前処理。
    1. 生データは、質量分析計に関連付けられたコンピューター上の複数のファイルやフォルダーに保存します。実験のルート フォルダーとすべてのサブフォルダーを取得します。分析のためにルートフォルダをパソコンにコピーします。
    2. readBrukerFlexData ライブラリと MALDIquant ライブラリを使用して、生データを読み込んで分析します。
      注:readBrukerFlexDataを使用すると、質量分析計からの生データをRの特定のオブジェクトにロードして、さらに分析することができます。詳細については、MALDIquant の説明27 を参照してください。
    3. 生成されたスペクトルを解析.
      注:各スペクトルは、それぞれの質量と強度(相対存在量)を持つピークのリストで構成されています。強度の平方根を使用して、スペクトルのグラフィカルな視覚化を強化します。ベースライン推定のための統計感度非線形ピーククリッピングアルゴリズムを使用して背景を修正します27。P/N比6を使用してピークを検出します。質量/電荷(m/z)の値が 2,000 ppm ウィンドウ内にある場合、検出されたピークはスペクトル全体で類似していると考えてください。
  2. スコアの定義と計算。凝集のワードアルゴリズムとJaccard距離に基づく非類似度行列を備えた階層クラスタリングを使用してスペクトルを分類します。
    注:Jaccardインデックスは、ブールサンプルセット間の類似性(つまり、ピークのリストの有無)を測定します。
  3. スペクトルと表示の比較。
    1. 生のスペクトルプロットを解析します。注: x 軸は m/z 比 (ダルトン単位) を表し、y 軸は強度 (相対存在量) を表します。
    2. 階層クラスタリングにより、スペクトル間の類似性を評価します。類似性(または発散)を樹形図として表します。
    3. 仮想ゲルビュー表現の平均により再現性を評価します。注:仮想Gel-View表現は、相対的な存在量が青の強度の増加とともに色分けされている修正ヒートマッププロットです。

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結果

本プロトコルの目的は、マクロファージの微小環境に対する応答性を評価するにおける全細胞MALDI-TOF MSの正確性を実証することである。

図1は、血液サンプルからの刺激マクロファージの調製について説明しています。図2は、フローサイトメトリーによる単球およびMDMの解析を示しています。単球はCD14を発現していましたが、CD68は発現していなかったことに注意してください(図1A)。逆に、MDMはCD68を発現していましたが、CD14は発現していませんでした(図1B)。

図 3は、全細胞MALDI-TOF MSの原理を示しています。細胞をマトリックスと共にターゲットプレート上に堆積させます。質量分析計内で、レーザービームをサンプルに複数回（240ショット）照射することで、分子の脱離とイオン化を誘導します。生成されたイオンは磁場によって加速され、チューブ内で

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ディスカッション

このプロトコルは、真核生物の全細胞に対するMALDI-TOF-MSの使用について説明しています。ここでは、マクロファージの微小環境に応答した複数の活性化状態を分析することにより、この方法の精度を説明します。

プロトコルの成功は、いくつかの重要なステップに依存しています。まず、溶液汚染物質がスペクトルを変化させる可能性があります。たとえば、ターゲットに沈着する前に、PBSで細胞を洗浄して培地と血清タンパク質を除去することが重要です。再現性のある結果を確保するには、1 x 105 細胞/μlの細胞濃度も必要です。第二に、結晶化はプロトコルの重要なステップです。高品質の結果を得るには、ターゲットプレートを注意深く洗浄し、ターゲットにサンプルを堆積させる前にマトリックスを調製する必要があります。最良の結果は、マトリックス溶液の直前にサンプルをターゲットに堆積させると得られます(ターゲットに堆積する前にサンプルをマトリックスと混合することは避けてください)。サンプルとマトリックス溶液の間の正しい自発的な混合には、均質な堆積物が必要です。第三に、全細胞MALDI-TOF-...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。RO、JLM、CCは、「Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF」と名付けられた国際特許WO 2011/154650の発明者です。

謝辞

Richard Ouedraogo は、Ministère de la Santé (PHRC 2010) からの助成金によってサポートされています。技術支援を提供してくださったLaurent Gorvel氏、Christophe Flaudrops氏、Nicolas Amstrong氏に感謝します。

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