このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

MACSの精製された感光体前駆体細胞の成人マウス・レチナへの副腎移植

10.4K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/50932

⸱

2014年2月22日

 ,  ,  , 
1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

細胞移植は、感光体喪失を特徴とするレチン系変性の治療のための戦略を表す。ここでは、移植可能な感光体の濃縮方法と、その副レチング移植を成体マウスに説明する。

要約

視覚障害と、レチナの光感知細胞、すなわち感光体の喪失による失明 は 、先進国における障害の主な理由を表している。細胞移植による退化光受容体の置換は、将来の臨床応用における可能な治療選択肢を表す。実際、最近の前臨床試験では、出生後4日目に新生児マウスのレチナから分離された未熟な感光体が、副腎移植後に成人マウスの残毛に溶け込む可能性があることを実証した。ドナー細胞は、内外セグメント、外核層に位置する丸い細胞体、内因性双極細胞に近接したシナプス末端を含む成熟した感光体形態を生成した。実際、最近の報告では、ドナー感光体が機能的に宿主マウスの神経回路に統合することを示した。このような細胞置換アプローチの将来の臨床適用のために、選択した細胞の精製懸濁液を生成し、眼に適切に統合するために正しい位置に配置する必要があります。感光体前駆体の濃縮のために、並べ替えは、ドナー細胞の遺伝子レポーター修飾を避けるために、特異的な細胞表面抗原に基づくべきである。ここでは、磁気関連細胞選別(MACS)−細胞表面マーカーCD73に基づく感光体特異的レポーターマウスの新生児性レチナから分離された移植可能なロッド感光体前駆体の濃縮を示す。抗CD73抗体と共にマイクロビーズ共役二次抗体を用いたインキュベーションにより、MACSによるロッド感光体前駆体の濃縮が約90%となった。フローサイトメトリーと比較して、MACSはGMP規格に適用しやすく、また、大量の細胞を相対的に短期間にソートできるという利点があります。成人野生型マウスの皮下腔への濃縮細胞懸濁液の注入は、未ソートの細胞懸濁液と比較して3倍高い集積率をもたらした。

概要

ビジョンは人間の主要な感覚の一つです。この感覚と失明の障害は、先進国における障害の主な理由の一つです。視力障害または失明の主な原因は、黄斑変性症、網膜色素変性症、円錐棒ジストロフィー、およびその他の条件で観察することができるように、感光体細胞喪失を特徴とする網膜変性である。現在までに、失われた視力を回復するための効果的な治療法は利用できません。2006年および2008年には、2つの異なるラボが報告され、互いに独立して、ロッド感光体前駆体細胞を成体の野生型マウスのレチナ1,2に移植することに成功した。このように、感光体前駆細胞移植の可能性も生じて退化したretinaに、退化した感光体を置き換え、視力を回復させる。実際、最近、このような移植された感光体前駆体細胞は、適切に発達した外層3、内因性双極細胞に近接したシナプス末端、および外核層2-4に位置する丸い細胞体などの成熟した野生型感光受容体の形態学的基準を引き出し、また宿主神経回路5-7に機能的に統合する能力を有することが最近実証されている。この戦略の主な原則の1つは、出生後4日目(PN4、PN0は出生日として定義される)若いマウスのレティナの使用であり、移植のための異なる細胞タイプの混合物をもたらす。将来の治療アプリケーションの背景に、この混合物は、感光体前駆細胞のために精製されなければならない。CD73は、若い感光体に特異的な第1の細胞表面マーカーとして、レティナ8-10に記載されている。ここでは、この細胞表面マーカーに基づく光受容体前駆細胞精製法と、磁気関連細胞選別法(MACS)法を用いた方法を示す。MACSは、高速なソート時間とGMP条件の調整が容易であるため、蛍光活性化細胞選別技術と比較して利点があります。成人型の野生型レチナの皮下空間に濃縮された集団を移植する際に、〜90%の濃縮率と最大3倍の高い統合率を実証することができた。従って、MACSベースの感光体前駆細胞の濃縮および皮膜下移植は、レチナル変性の治療のための再生治療戦略の開発に対する信頼できる有望な技術である。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

動物の倫理的使用とケア声明:

すべての動物実験は、欧州連合(EU)およびドイツの法律(Tierschutzgesetz)に厳密に従って行われ、眼科および視力研究における動物の使用に関するARVO声明に従った。すべての動物実験は、TUドレスデンとランデスディレクションドレスデンの動物倫理委員会によって承認されました(承認番号:24D-9168.11-1/2008-33)。

1. 細胞解離と細胞ソートを開始する前に

  1. 3つの15 ml反応チューブにラベルを付けます:ウォッシュ(W)、正の分数(+)および負の分数(-)。

2. レチナ解離

  1. はさみを使用してPN 4の子犬の首を切る。
  2. 70%エタノールですぐに子犬の頭をすすいで、続いてPBSで洗浄します。
  3. ヘッドを冷たいHBSSに移し、目を核にします(すべてのヘッドに対してこのステップを繰り返します)。核を得るために、眼瞼を開き、視神経領域で湾曲した鉗子で目を固定する。その後、慎重に軌道から目を引きます。
  4. すべての目を核にした後、レティナを分離する:視神経に閉じたはさみを導入し、ブレードを開きます。ピールRPE/チョリドアウト。湾曲した鉗子を使用してレンズおよび血管を取り除く。
  5. 単離したレチナをパパイン溶液を含む1.5ml反応チューブ(パパイン解離キットによって提供される)に移します。
  6. 37°Cの水浴またはシェーカー(400rpm)で30〜60分間、パパイン溶液中のレチナをインキュベートします。
    1. レチナがパパイン溶液中でインキュベートする間、ピペット1mlのオボムコード溶液を15ml反応管に(ラベル「1」)にする。
    2. 60 μlのDNase I(10 mg/ml)+60 μlのオボムコイド溶液(キット提供)+520 μlのEBSSを15ml反応チューブ(ラベル"2")に加えます。
  7. パパインインキュベーション後、部分的に消化されたレティナを含むパパイン溶液を反応管「2」に移す。
  8. 火磨きピペットを使用して、機械的解離(10倍上下)を行います。
  9. 単一細胞懸濁液を反応管「1」にピペットする。細胞懸濁液をオボムコイド溶液の上に優しく重ねて2層を生成するようにしてください。
  10. 遠心分離機は300xg(約1,300rpm)で5分間を行った。
  11. 上清を捨て、500 μlのMACSバッファで細胞を再中断します。

3. 磁気関連セルソート(MACS)を用いたセルソート

  1. X μlラット抗CD73抗体を500 μlに加えて、10 μg/mlの最終濃度を達成します。
  2. 氷の上に5分をインキュベートします。
  3. 15 ml の反応チューブに MACS バッファーを 10 ml 充填し、300 x g の速度で 5 分間遠心分離します。
  4. 上清を取り除く。
  5. 480 μl MACS バッファーにペレットを再懸濁し、120 μlのヤギアンチラット IgG マイクロビーズを追加します。
  6. 氷の上に15分をインキュベート;攪拌、振ったり、混ぜたりしないでください。
  7. 15 mlの反応管をMACSバッファーで5 mlに充填し、300 x gで5分間遠心分離します。
  8. 反応管が遠心分離されているように:
    1. LSカラムを磁気スタンドに合わせて調整します。
    2. LS カラムの上に事前分離フィルタを配置します。
    3. 3 ml MACS バッファで事前分離フィルターと LS カラムをハイドレートし、MACS バッファを洗浄(W)チューブに集めます。
  9. 上清を取り除く。
  10. ペレットを500 μl MACSバッファに再懸濁します。
  11. 500 μl のセル懸濁液をフィルターにロードし、フィルターに 1 ml MACS バッファーを追加し、負の分数を負の分数 (-) 反応管に集める。
  12. 次に、3 x 3 ml の MACS バッファを列に追加して、列にバインドされていないセルを洗い流します。
  13. これらの9 ml がLSカラムを通り抜けると、磁気スタンドからカラムを取り外し、正の分数(+)反応管の上に取り付けます。
  14. 5 ml の MACS バッファを LS カラムに素早くロードし、LS カラムにプランジャを入れ、バッファ全体がカラムを通るまで押します。
  15. 300xgで5分間の正分を含む反応管を遠心分離する。
  16. 上清を取り外し、MACSバッファの500 μlで再中断し、4°Cに保ちます。
  17. 共通のセルカウントデバイスを使用してセルの合計量をカウントします。
  18. MACSバッファー内の2 x 105 セル/μlを含む正のソートされた分画から細胞懸濁液を調製し、4°Cに保つ

4. マウスのレチナへのMACソートされた感光体前駆細胞の移植

  1. 1 mlの滅菌PBSまたはHBSS、10 μl DNAse I、1-2 ml無菌脱イオン化H2O、4°Cの細胞懸濁液分画のアリコートを用意してください。
  2. メデトミジン塩酸塩(0.01 mg/10 g体重)の腹腔内注射(0.01mg/10 g体重)、ケタミン(0.75mg/10 g体重)で成人マウス(すなわち2~4ヶ月)を麻酔する。その後、痛みの軽減のためにブプレノルフィン(0.05 mg /kg体重)の皮下注射を行います。
  3. フェニレフリンの低下で瞳孔を拡張 2.5%-トロピックアミド 0.5% .
  4. マウスヘッドホルダーにマウスを固定し、ステレオ顕微鏡の下に置きます。
  5. 目の乾燥を防ぐために、Visidicゲルの滴を適用します。
  6. 針に30 G 1/2の無菌を使用して、スクレアラと角膜(それぞれ 、オレ)の境界に小さな穴を作ります。
  7. ダイヤモンドペンを使用して一般的なカバースライドを小さな(約5mm x 5mm)部分にカットし、これらの片の1つを角膜の上に置き、レティナを直接視覚化できるようにします。
  8. 殺菌したマイクロリットルのシリンジを脱イオン水で数回洗い流します。
  9. マイクロリットルシリンジに1 μlの細胞懸濁液を搭載し、結膜および結膜を通して針を直通し、点眼の半分の鼻の目視管理下に置きます。
  10. レチナル空間に到達するまで、静かにレチナに穴を開け、細胞懸濁液を皮下腔に注入する。
  11. 出血することなく網膜空間の約1/4を覆い、均一であるべき網膜の雄牛剥離を観察する。
  12. 注射器を優しく引き出し、レチナルホールが自動的にシールします。
  13. マイクロリットルシリンジを脱イオン水で数回洗い流します。
  14. ヘッドホルダーからマウスを離します。
  15. メデトミジン塩酸塩効果の逆転のためにアティパモゾール塩酸塩を注入することによってマウスを目覚めさせる。
  16. 暖かい暗い部屋(およそ25°C)で目覚めの時間のためのマウスを置く。
  17. 移植後2日後、ブプレノルフィン(体重0.05mg/kg)は、痛みの軽減のために、朝と午後に皮下注射によって投与されるべきである。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

マウスのレチナに統合するロッド感光体の能力を評価するために、マウスレポーターラインを使用し、GFPが神経性retinaロイシンジッパー(Nrl、Nrl-GFP)プロモーター11によって駆動される。Nrlは、成人期を通じてE12.5でその発現を開始するロッド感光体の最も初期のマーカーであり、ドナーロッド感光体細胞の特定の標識を可能にする。

PN 4 Nrl-GFPの子犬は首を切られ、目は欠核化された。次いで、レティナを、上記の方法を用いて分離および解離した。その結果生じたセル懸濁液を、CD73 ベースの MACS を使用してソートした(図1および2)。MACのソートに続いて、この手順で得られたエンリッチメントを分析しました。

図3Aに示すように、初期細胞懸濁液(Input)には30.4%のGFP陽性細胞、すなわち含まれていた。ロッド感光体。CD73ベースのMAC選別後、フローサイトメトリー...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

感光体前駆細胞の低レチナル移植は、これらの光感受性細胞を有意な数1,2の宿主のレチナに統合することを達成するための信頼できるツールを表す。これにより、将来6のレチン性変性疾患の治療のための細胞療法の確立が可能になる可能性があります。現在PN4のレティナから単離されている細胞のドナー集団は、異なる細胞タイプの混合物であり、そこから、感光体前駆細胞のみが、皮膜下注射後に統合される。CD73ベースのMACソートを用いることによって、ドナー細胞懸濁液内の感光体の割合を≈90%に増加させることができ、未分類の細胞集団8と比較して野生型宿主レチナにおける約3倍の高い集積率を可能にする。フローサイトメトリーと比較して、MACSは高速選別手順の利点があり、GMP規格に比較的簡単に適用できることです。移植可能な光受容体の精製は、多能性幹細胞12〜14からの光受容体のインビトロ発生に対する最近の利点に照らして特に関心がある。分化された多能性幹細胞の培養は、多様な細胞タイプで構成されており、特定の選別手順の利用可能性を細胞移植療法における将来の使用に不可欠な前提条件としている。

<...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

謝辞

私たちは、Nrl-GFPマウス、技術サポートのためのヨッヘンハース、動物の畜産のためのシンディベーメとエメリーレスマンを提供してくれたアナンド・スワロップに感謝したいと思います。

この研究は、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG):FZT 111 - 再生療法ドレスデンのセンター、CRTD種子補助金プログラム、SFB 655、およびProRetina e.Vによってサポートされました。 財団、DIGS-BB大学院プログラムドレスデン、およびフンダサンパラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジア(SFRH/BD/60787/2009)

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
パパイン解離システムワージントン・バイオケミカル・コーポレーション供給LK003150DNase Iは、メソッドでは使用されていません
精製ラット抗マウスCD73、クローン TY/23BD Pharmingen550738ストック濃度 0.5 mg/ml
ヤギ抗ラット IgG マイクロビーズMiltenyi130-048-501総量 2 ml
PBSGibco10010-015細胞の総数を数えるために使用
DNase ISigmaD5025-150KU
HBSSGibco14025050網膜の解離に使用
トリパンブルーSigmaFluka93595細胞の総数を数えるために使用
VidisicDr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
DomitorPfizer76579
ケタミン 10%Ratiopharm7538843
Antisedanファイザー76590
フェニレフリン 2.5%-トロピカミド 0.5%University Clinics ドレスデン薬局
Preseparation フィルターMiltenyi130-041-407
LS カラムMiltenyi130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303
QuadroMACSセパレーターMiltenyi130-090-976
ファイヤーポリッシュガラスパスツールピペットブランド74777 20ピペットの先端はファイヤーポリッシュとオートクレーブ処理が必要です。
MACS 15 mlチューブラックMiltenyi130-091-052
セルカウントチャンバーカール・ロスT728.1
滅菌済み 15 ml チューブグライナー バイオワン188271
ライカ M651 MSDライカM651 MSDリンパス SZX10
リンSZX10ライカ M651 MSD
の代わりに使用できますオリンパス 倒立型実体顕微鏡 CKX41オリンパスCKX41
細胞培養フード サーモサイエンティフィック MSC-Advanceサーモサイエンティフィック51025411
1.5 ml 反応チューブザルスタット 727706400
2 ml 反応チューブサルスタット72695
エッペンドルフ 遠心分離機 5702VWR (エッペンドルフ)521-0733
マウスヘッドホルダーmyNeurolab471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 inBD Pharmingen304000
Hamilton microliter syringe 5 & micro;l、75RNハミルトン065-7634-01針なしでお届け
ハミルトン RN 特殊針 34 Gハミルトン065-207434鈍器、長さ 12 mm
Vannas-Tübingen スプリングはさみ - 5 mm ブレード ストレートファイン サイエンス ツール15003-08
デュモン #7 鉗子 - チタン バイオロジーファイン サイエンス ツール11272-40
ダイヤモンド ペンツールテック
15 mm x 15 mm カバー スリップパークスMIC3366
オ オパス ス

参考文献

  1. Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
  2. MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
  3. Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
  4. Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
  5. Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
  6. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
  7. Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
  8. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
  9. Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
  10. Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
  11. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
  12. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  14. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  15. Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

MACS EnrichmentCD73 AntibodyRetinal Cell IsolationImmunofluorescence MicroscopyCell Integration AnalysisMagnetic Cell SortingPhotoreceptor Morphology
MACSの精製された感光体前駆体細胞の成人マウス・レチナへの副腎移植
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。