定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴

サマリー

私たちは、明視野と微分干渉コントラスト画像の組み合わせを通じて、細胞の質量、体積、密度の定量的測定を行うための標準的な光学顕微鏡の使用について説明します。

要約

我々は、明視野および微分干渉コントラスト画像の組み合わせを介して質量、体積、および細胞標本上の濃度の定量的測定を行うための標準的な光学顕微鏡の使用を記載している。全細胞集団および細胞内濃度分布の測定を行うために、noninterferometric定量的位相顕微鏡（NIQPM）及びヒルベルト体積を決定するために、微分干渉コントラスト顕微鏡（HTDIC）を形質転換：つの主要なアプローチが提示される。低開口数（NA）は、照明、弱い散乱、試料による光の弱い吸収：NIQPMが波の伝播を単純化したモデルに基づいており、3基礎的前提で、近軸近似と呼ばれる。幸いなことに、無染色細胞の標本は、これらの仮定を満たし、低NAの照明は簡単、市販の顕微鏡で達成される。 HTDICは、高NAのillumin下のスルーフォーカスDICの画像からの体積情報を取得するために使用されているATION条件。高NA照明は光軸に沿った試験片の強化された切片を可能にします。ヒルベルトDIC画像に対して変換処理を大幅にスタックすることは、背景とは、試料の強度のグレー値を分離することにより、三次元での検体の境界線の局在化のためのエッジ検出アルゴリズムを強化する。 NIQPMとHTDICの主な利点は、「既製」顕微鏡を使用して自分の技術、アクセシビリティに横たわっていた。商業スコープの遅いzスタックの取得時間は、現在より速く1フレーム/分以上の現象の調査を抑止する、第二に、回折効果を10まで0.2からオブジェクトへNIQPMとHTDICの有用性を制限します。これらのメソッドの二つの基本的な制限がありますそれぞれ直径（NIQPM）と20（HTDIC）程度、。したがって、関心のある試料とそれに関連する時間ダイナミクスは、これらのメソッドの使用を可能にするために一定の大きさと時間的な制約を満たす必要があります。おもしろいこと、ほとんどの固定蜂巣r個の試験片を容易に、これらの方法で調査している。

概要

光学顕微鏡を使用することになりました細胞生物の調査に遍在です。 、可視光スペクトルにわたって、その低い内因性の吸光度と弱い散乱特性のために、細胞が強く、それらを横断する光波の振幅に影響を与えるため、標準的な明視野顕微鏡で画像化したときに半透明表示されません。細胞の標本は、しかしながら、直線状の光が通過する空間の特定の領域における局所質量密度の量に関連する様式でそれらを通過する光波が遅くない。この不均一タイムラグまたは顕微鏡標本を透過した光の波の「位相」プロファイルの利用は最初のフリッツゼルニケ¹によって1935年に記載され、実験的にZernikein 1942 ²を実現した。ゼルニケは、この達成のために1953年にノーベル賞を受賞しました。ツァイスは1945年³この様式を商品化しました。 1955年に、スミスとNomarsk私は、微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡、コントラスト機構としての位相の空間勾配を使用していますモダリティの使用⁴と理論⁵上での初期の作品を提供してしまい。 DICは、ノマル⁶と1965in緊密に連携ツァイスによって商品化されました。 1981年に、2研究所は、DIC顕微鏡^7、8の光学列にビデオカメラを組み込むことで最初に記録された生きた細胞のDIC画像を示した。生細胞イメージングの時代が誕生しました。

この時以来、商業顕微鏡に位相差およびDICの両方の実行はほぼ横ばいとなっている。形態学のモニタリング、細胞内構造の追跡、および膜⁹のダイナミクスの研究：これらの方法は、主に定性的な目的のために、細胞の画像を生成する生物によって利用される。これらの技術は、位相とDIの両方としての「既製の」構成で定性的でC画像は、任意の光源強度の関数、照明光学系の設定、およびCCDカメラゲイン、ガンマ、および露光設定である。

物理学者や光学技術者の小さな軍団は、市販の画像診断法は、定量するために努めてきました。最初の努力の中で自然に2文字は、医師出身の生物物理学者ロバートBarer、市販の位相差顕微鏡を用いてこれらの細胞型を介して位相シフトを推定することによって細胞の細胞乾燥質量を測定するために位相差顕微鏡の使用を実証した1952年、1953年であった^10、11。位相差顕微鏡^10,11、微分干渉顕微鏡^12から17と、光路長、相、質量を決定するために、明視野^18〜22歳 ：フィールドは、3つの基本的なラベルフリーコントラストメカニズムをベースにその後の年間の技術を多数開発してきました密度、屈折率、および細胞容積。

パラ中llel、カスタム光学機器の大規模なコレクションには、1950年代から開発されており、寄生虫の成長²³でのアプリケーションから、赤血球²⁵の膜動態を調査し、細胞周期^24を文書に至るまで光学測定を遠大てきた。具体的には、過去10年間では、回折位相差顕微鏡²⁶の形で断層位相差顕微鏡^27、デジタルホログラフィック顕微鏡^28、位相敏感光コヒーレンス顕微鏡^29、空間光干渉顕微鏡^30、ヒルベルトのラベルフリー定量的顕微鏡の富を見ている位相差顕微鏡^31、および定量的な位相差顕微鏡^32。彼らの集団的成功にもかかわらず、これらの商品は、その複雑な計測および計算要件に、大部分は、生物学による研究者の大きな分野に普及していない。

本明細書で我々は、dは明視野及びDICの画像を組み合わせて質量、体積、および細胞標本上の濃度の定量的測定を行うための標準的な光学顕微鏡の使用を傍接させる。体積を決定するために、全細胞質量及び細胞内濃度分布の測定を行うために、noninterferometric定量的位相顕微鏡（NIQPM）及びヒルベルト微分干渉コントラスト顕微鏡（HTDIC）を形質転換：つの主要なアプローチが提示される。 NIQPMとHTDICの主な利点は、その技術、アクセシビリティに横たわっていた。彼らの正常な実行に必要な撮影条件は、ほとんどの市販の顕微鏡の通常の操作の範囲内である。さらに、後処理アルゴリズムは、安定した迅速、かつ堅牢である - 可能な限り高速フーリエ変換（FFT）に基づくアルゴリズムを用いて変換MATLABにおいて実施された。

NIQPMは位相およびCELの軸方向に一体化質量密度を再構築する方法であり、明視野画像からlular標本。試験片の面積に対するこの軸方向に一体化質量密度の総和は、試料の全乾燥質量含有率を提供します。それは、細胞の位相プロファイルは、サンプルのスルーフォーカス明視野画像から再構成することができることが実証された- - NIQPMプロトコルはPaganinおよびニュージェント^18,19によって敷設基礎実験に基づいており、フランクの理論的研究、Altmeyer、およびウェルニッケ²⁰ -効率的なFFTベースの方法で、近軸波モデルの解決に。乾燥質量密度相の接続はBarer ^10、11とポペスク³³により作業に基づいています。

ボリュメトリック情報は、光軸に沿って試料の光学切片を有効に高NAの照明条件の下でスルーフォーカスDICの画像から得ることができる。ヒルベルトDIC画像スタックに変換処理を大幅に強化バックグラウンドとは、試料の強度のグレー値を分離することにより三次元の検体の境界線の局在化のためのエッジ検出アルゴリズム。我々は、コントラストとサンプルの自動化された容積測定分析のためのソーベルベースのエッジ検出方法を強化するために、両方のフーリエフィルタリング方法を導入しているが、この作品は、Arinson ら ³⁴で発信する。また、回折限界から最大直径^36〜20μmの大きさの範囲のポリスチレン球で以前HTDICを検証しています。

NIQPMとHTDIC両方が商業顕微鏡上での開発のために技術的にアクセス可能である一方で、これらの方法は、基本的に顕微鏡自身のハードウェア構成によって制限されます。これらの技術の主な制限は2倍以下のとおりです。商業スコープの遅いzスタックの取得時間による全体試料ステージの翻訳にだけ、対物レンズとは対照的に、現在、より速くおよそ1フレーム/分以上の現象の調査を制限し、第二に、回折効果はそれぞれ、直径10〜20μmの最大0.2のサイズの範囲のオブジェクトにNIQPMとHTDICの有用性を制限する。したがって、関心のある試料とそれに関連する時間のダイナミクスは、典型的な「既製の」楽器でこれらのメソッドを使用できるようにするために一定の大きさと時間的な制約を満たす必要があります。おもしろいこと、ほとんどの固定、携帯の標本は容易にこれらの方法を用いて調査されています。

NIQPMとHTDICプロトコルの概要を図1に示す。 図2に、我々は、明視野およびDICの画像の両方のための低と高の両方のNA照明条件の下で最適と部分最適スルーフォーカスイメージングを示しています。3と4は、成功と失敗の実装を強調しNIQPMアルゴリズムのパラメータ依存性を実証する図 。 図5はHTDIC画像処理アルゴリズムに含まれるステップを示しており、細胞の体積を決定するためのアルゴリズムの最適な実装を示します。

プロトコル

1。顕微鏡仕様

正しい方法でイメージングを行うために顕微鏡は、次の仕様を持っている必要があります。

1. 微分干渉コントラスト（DIC）及び明視野（BF）コントラストの両方を有する。
2. コンピュータ制御のz軸の動きを有する。
3. 集光レンズの開口数を変化させるために調節可能な開口絞りを有する。段階的なルールや電子読み出しと開口部が開口数の値を知ることが必要である。開口数はHTDICためNIQPM 0.1から0.9（またはそれ以上）までの範囲でなければなりません。
4. 顕微鏡は、明視野イメージングのために利用される狭帯域カラーフィルタを有するべきである。このフィルタは、屈折増分、NIQPための質量密度に位相を変換するために使用される波長依存製作を修正するために必要とされている。

2。微分干渉コントラスト（DIC）Zスタック取得

1. SlideBookソフトウェアAを開くND画像収集のための新しいスライドを作成します。
2. 次に、フォーカスウィンドウを開きます。 フィルタセット ] セクションで、DICを選択します。 [スコープ ] タブで、 凝縮部の下、一番右の位置（すべての道を開く）に絞りスライドバーを調整します。これは、高開口数の照明を提供し、試料の光学切片を高める。
3. DIC対物レンズを用いたサンプルに焦点を当てています。サンプルが簡単に表示されるまでのハロゲンランプ強度を調整します。カメラは飽和していないようにするには、フォーカスウィンドウのカメラタブを選択し、ピクセル強度のヒストグラムが、カメラのダイナミックレンジ内にあることを確認してください。
4. イメージキャプチャ]ウィンドウを開きます。 キャプチャの種類]セクションでは、3Dボックスをチェックしてください。 3Dキャプチャセクションでは、 中心付近の範囲を選択し、 現在の位置に戻る ボックスおよびZ方向の範囲、面の数、及びステップサイズを指定する。 Z方向の範囲は、サンプル全体を組み込む必要があります。
5. イメージキャプチャ]ウィンドウの[ フィルタセット]セクションで、DICのチェックボックスをオンにして、露光時間を指定します。 イメージ情報]セクションで、（オプション）イメージに名前を付けて画像化を開始するために[開始]を選択します。

3。明視野（BF）のZ-スタック獲得

1. 顕微鏡は、試料のDICのzスタックの収集が終了したら、フォーカスウィンドウを開き、[フィルタの設定 ] セクションの下の[開く]を選択します。低NAの照明を提供するために、（すべての方法を閉じた）遠い左の位置に絞りスライドバーを調整します。
2. 緑に顕微鏡光パスフィルタを変更します。サンプルが表示されるまでのハロゲンランプ強度を調整します。選択して、カメラのない飽和がないことを確認カメラのフォーカスウィンドウのタブと画素強度のヒストグラムが指定された範囲内にあることを確認する。
3. イメージキャプチャ]ウィンドウを開きます。 DIC zスタック買収による3Dキャプチャ設定が表示されます。
4. イメージキャプチャ]ウィンドウの[ フィルタセット]セクションで、[開く ]チェックボックスをオンにし、露光時間を指定します。 イメージ情報]セクションで、（オプション）イメージに名前を付け、zスタック画像取得を開始するために[開始]を選択します。

4。 Z-スタック画像のエクスポート

1. zスタックキャプチャを開きます。 100パーセントにビューを変更します。 0カメラの最大画素値との間に表示される画素値のヒストグラムを調整する（16ビット、12ビットカメラ用4,095、65,535）。
2. [ 表示 ]> [ エクスポート]> [TIFFシリーズを選択します。これはTIFF画像のシリーズとしてzスタックをエクスポートします（それぞれのZ平面に1つ）。終わり（ すなわち 「DICスタック1_ "）にアンダースコアを持つ名前の別のフォルダにTIFFシリーズを保存します。各DICまたはBF zスタックでこれを繰り返します。

5。体積測定

1. 「JoVE_HTDIC_v1.m」と題しHTDIC MATLABプログラムを開きます。
2. HTDICプログラムのセクション0の下では、依存関係のディレクトリ変数を更新。コピーと「dependencies_directory = "次の一重引用符の間にあるエクスプローラからhilbert_transform_dic.mとsobel_edge_detect.mファイル（PC）を含むディレクトリを貼り付けます。 JoVE_HTDIC_v1.mプログラムのExecuteSection 0。
3. 第1に、「images_directory」を更新します。もう一度、一重引用符の間に。TIF形式でスルーフォーカスの画像を含むディレクトリをコピーして貼り付けます。一度だけセクション1を実行します。
4. アライメントとヒルベルトのための画像の回転は実行]コードのセクション2に変換する。 「HTDICパラメータの定義」というタイトルのダイアログボックスが表示されます。五numbeRSは、ユーザーから要求されています。サンプルのDIC画像がフォーカスされている焦点面番号、横方向の解像度（画像中のミクロン/ピクセル）、距離分解能（これは0.1ミクロンの軸ステップで画像取得のために0.1である）、ヒルベルト変換を実行するために必要なDIC画像の回転角、典型的な値は、45および-135である。最後に、関心の大きさの領域に入る、このパラメータは、その後表示されるボックスの一辺の長さを定義する - 一般的な値は400です。 [OK]をクリックします。
5. 焦点面番号で指定されたDIC焦点面の画像は、青色のボックスが表示されます。セル例えば 、関心のある特徴の上に箱を置きます。ボックスは、正方形である必要はありません。ボックスはボックス内に所望の領域をダブルクリックの上に配置された後。
6. 別の図は、今表示されます。この図は、前のステップで選択した関心領域のトリミングされたと回転した画像が含まれています。画像のコントラストなものであるべきで明るい特徴が右側に表示されている間、その暗い特徴は、左側に表示されます。関心のある領域の上青いボックスをドラッグし、必要に応じて再構築する。
7. 第3節では、zスタックキューブためのマスクを生成します。細胞の周りに長方形、手で目的の細胞の輪郭をフリーハ​​ンドツールを作成する長方形のマスク：利用可能なマスクの2種類があります。
8. 長方形のマスク、コメントを外し、ライン167とコメント行170を（その行の先頭に「％」を配置することにより、行をコメントアウト）を生成する。プログラムのセクション3を実行します。画像をクリックして、長方形のマスクの定義を開始するには、マウスをドラッグします。それを受け入れることをボックスをダブルクリックします。
9. 手描きのマスク、コメント行167とコメント解除ライン170を生成し、第3節を実行します。クリックして、マウスを使って、所望のマスクを描画します。それを受け入れるためのマスクをダブルクリックします。
10. ヒルベルトを構築4toランセクションは、DICの画像スタックと関心領域の対応するDICの画像スタックを変形させた。3章で構築されたマスクは、DICスタックおよび「maskON」がライン179で1に設定されている正規のDICスタックをヒルベルト変換に適用されます。 0に "maskON"を設定すると、マスクを適用せずに画像スタックを構築します。
11. 関心領域のxz断面画像の画像分割を最適化するために、セクション5を実行します。プログラムによって生成され、図500、コントラスト、3つの異なるタイプが表示されます。セルの境界線を見つけるためのアルゴリズムの成功は、使用されたマスク、プログラムの行229の「しきい値」の値の組み合わせに依存している。 0.5の値で始まります。しきい値の値を調整し、適切なアウトラインは、列のいずれかで達成されるまで、プログラムのこの部分を再実行してください。
12. アウトラインは、列1で最高だった場合は、DICの画像分割を使用してボリュームを決定するために、第6節を使用しています。列2は、最適な結果が得られた場合は、ヒルベルト変換された微分干渉画像から細胞容積を決定するために、第7節を実行します。もし3列GAVE最適な結果は、フーリエフィル​​タリングヒルベルト変換されたDICの画像を使用してボリュームを決定するために、セクション8を実行します。
13. 立方ミクロン（オンス）で報告された試料の測定された体積は、体積測定が選択されるかに応じて、プログラムによって生成される図600,700、または800のタイトルに提示される。

6。質量測定

1. 「JoVE_NIQPM_v1.m」と題しNIQPM MATLABプログラムを開きます。
2. NIQPMプログラムの第0の下で、プログラムを実行するのに必要な3つのディレクトリの場所を更新。これらは「dependencies_directory」「brightfield_directory、」と「dic_directory。 "
3. 次に、第1を実行します。コー​​ドのこのセクションでは、画像のセット全体の完全な視野の明視野像キューブが生成されます。一度だけセクション1を実行します。
4. 次に、第2節を実行します。 「NIQPMパラメータの定義」というタイトルのダイアログボックスが表示されます。の明視野像焦点面番号：4つの数字は、ユーザーから要求されるサンプルがフォーカスされている、横方向の解像度（画像中のミクロン/ピクセル）、軸方向の解像度が（これは0.1ミクロンの軸ステップで画像取得のために0.1である）、および金利の大きさの領域は、このパラメータには、の辺の長さを定義しますその後、表示されるボックス - 一般的な値は200です。 [OK]をクリックします。
5. 焦点面番号で指定された明視野焦点面の画像は、青色のボックスが表示されます。
   1. 画像の焦点が合っていない場合は、青色のボックスを再実行し、セクション2をダブルクリックして、ダイアログボックスで焦点面数を調整してください。
   2. 画像の焦点が合っている場合は、画像の周囲に青色のボックスをドラッグして、ボックスのノードを選択し、必要に応じてドラッグしてサイズを変更します。関心のある特徴の周りにボックスを配置し、 例えば 、細胞。ボックスは、正方形である必要はありません。それを受け入れることを、ボックス内をダブルクリックします。
6. 次に、明視野画像のスタックを構築するための実行第3章では、内の領域にトリミングterest。
7. 位相マップ、疑似DIC画像、明視野画像と真のDIC画像との比較を生成するには、第4節を実行します。
8. 擬似でDICおよび質量密度マップ、総質量、および細胞密度のヒストグラムできるだけ同じ真のDIC画像は、セクション5aと、5bのを実行することによって決定することができる。ライン300で最適化する「閾値」 - - 部5aは、フィールドの自動ボーダー検出を行う典型的な値は0.1〜1の間で変動。しきい値の値を最適化するために、必要に応じてこのセクションを再実行してください。ユーザは、目的の細胞を概説した後部5bは質量決定等を行う。

結果

スルーフォーカス画像取得中に正しいサンプル照明はNIQPM ND HTDICアルゴリズムの実装を成功させるために重要である。 図2に、我々は2C、2I、図2A。DICおよびポリスチレン球とヒト大腸腺癌細胞株SW620用明視野コントラストの両方で低域と高NAの照明を示しており、2Kは NIQPMに最適なイメージングを示しています。2F、2Hを、図2Nと2Pは HTDICに最適なイメージングを示しています。

図3と図4は、成功と失敗の両方の実装を強調NIQPMアルゴリズムのパラメータ依存性を示しています。期待プロファイルが理論的に知られているので、NIQPM再建と直接比較することができます- 図3において、我々は4.8ミクロン径のポリスチレン球の位相プロファイルを探る。 図2LにNIQPMで捕捉することができる。

ディスカッション

一般的に、NIQPMは0.25から44.7までの光路長で検証回折限界的な技術である。検証は、Fluoromount G（データは示さず）に懸濁0.11-9.8ミクロンより= nの上に、直径1.596の範囲のポリスチレン球を行った。細胞はほぼ0〜7までの範囲の光路長を有している。

試料の濃度分布を測定する場合、1は密度マップは、不要なバックグラウンドの寄与を保有しながら、擬似DIC画像が正常に見えることがあります。これはNIQPMアルゴリズムへの入力として使用される試料の明視野画像におけるノイズによるものである。 NIQPMメソッドへの二つの可能な修飾は、不要なバックグラウンドの寄与を排除するために使用することができる：第一に、一方が信号対雑音明視野画像内を高めるために長い露出時間を使用することができる。光学的に薄い標本を撮影する場合、これは特に重要です。あるいは、zスタックのacquisitの軸方向間隔を減少させることができる一緒NIQPMアルゴリズムにそれらを入力する前0.1〜0.05ミクロン、平均2〜3面からのイオン。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Zeiss Axio Imager 2 顕微鏡	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, ドイツ	Axio Imager D2	顕微鏡
グリーンフィルター (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	グリーンフィルター
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
ポリスチレンmicrospheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	ポリスチレン球
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	封入剤