大人のゼブラフィッシュにおける網膜再生研究で使用するための新規な光ダメージパラダイム

サマリー

多重光損傷プロトコルが損傷光受容体に記述され、その結果、成体ゼブラフィッシュ網膜再生の応答を誘導しています。このプロトコルは、着色された動物は、その損害賠償の全体にわたる網膜桿体と錐体光受容体の大部分を使用することができる改良された方法を説明します。

要約

光誘起網膜変性（LIRD）は、一般的にげっ歯類および損傷ロッドと錐体光受容体にゼブラフィッシュの両方で使用されています。成体ゼブラフィッシュでは、光受容体の変性は、細胞周期を再入力し、過渡増幅前駆細胞を生成するためにミュラーグリア細胞をトリガします。これらの前駆細胞は、彼らが最終的に新たな光受容体を生じさせる損傷領域への移行として増殖し続けています。現在、二広く使用されLIRDパラダイム、各々の再生応じて感光体の損失と対応する差異の程度の差が生じる。がある多くの遺伝的および薬理学的ツールは、再生時のその他の個々の遺伝子の役割をテストすることが可能であるので、堅牢なLIRDパラダイムを開発する必要がある。ここで我々は2以前に確立LIRD技術の使用を組み合わせているロッドとコーン光受容体の両方の広範かつ一貫性のある損失の結果そのLIRDプロトコルを記述します。さらにこのプロトコルはLIRD研究のためのアルビノ背景に関心のあるトランスジェニック系統を維持する必要がなくなり着色された動物における使用のために拡張することができる。

概要

光誘起網膜変性（LIRD）は、一般的にげっ歯類および損傷ロッドと錐体光受容体にゼブラフィッシュの両方で使用されています。成体ゼブラフィッシュでは、光受容体の変性は、細胞周期を再入力し、過渡増幅前駆細胞を生成するためにミュラーグリア細胞をトリガします。これらの前駆細胞は、彼らが最終的に新たな光受容体を生じさせる損傷領域への移行として増殖し続けています。現在、二広く使用されLIRDパラダイム、各々の再生応じて感光体の損失と対応する差異の程度の差が生じる。がある多くの遺伝的および薬理学的ツールは、再生時のその他の個々の遺伝子の役割をテストすることが可能であるので、堅牢なLIRDパラダイムを開発する必要がある。ここで我々は2以前に確立LIRD技術の使用を組み合わせているロッドとコーン光受容体の両方の広範かつ一貫性のある損失の結果そのLIRDプロトコルを記述します。さらにこのプロトコルはLIRD研究のためのアルビノ背景に関心のあるトランスジェニック系統を維持する必要がなくなり着色された動物における使用のために拡張することができる。

プロトコル

このプロトコルで説明されているすべての手順は、医学のウェイン州立大学で動物使用委員会によって承認された。

1。暗順応

1. 転送〜ダークエンクロージャに通常の住宅システムから10成体アルビノまたは着色された魚。可能であれば、タンクを通じて通常の水の流れを可能にゼブラフィッシュ住宅モジュールに組み込まれている暗い筐体を使用しています。 （そのようなシステムが利用できない場合には、酸素と魚を通気することを確認し、完全に暗いエンクロージャ内に水槽を配置）。
2. 10日間暗闇の中で魚を保管してください。動物を餌または暗箱に新しい魚を追加する場合は、光の長い期間に魚をさらす避けるためにできるだけ早く移動してください。

2。 UV露光

1. UV源の電源がOFFになっていることを確認してください。蛍光実体顕微鏡からの紫外線フィラメントを取り外します。
   1. 反転を使用してくださいUVフィラメント用のスタンドとして直径15cmのガラスシャーレ（または類似した2センチメートルの高さのようなもの）。実験台にシャーレテープ。
   2. 反転したペトリ皿の上部にテープ紫外線フィラメント。フィラメント張り出し月末〜2ミリメートルペトリ皿になるよう配置します。
2. 250mlのガラスビーカーを取得します。背面アルミホイルでビーカーのカバー下部の½、側面、そして、箔の "光沢のある"側がビーカーの内側に面していることを確認する。ビーカーを卒業されている場合は、露出したビーカーの明確な半分を残して、ホイルでビーカーの文言の半分をカバーしています。
3. 魚施設システムから100mlの水で250mlのビーカーを埋める。
4. 4リットルのビーカーに250mlのビーカーを置きます。水位が250mlのビーカーに100mlの水ラインと偶数​​になるまで水を4リットルのビーカーを埋める。
5. 250mlのビーカーに10暗処置動物の最大値を追加します。アルミニウムの小片で250mlのビーカーをカバー箔。
6. UVフィラメントに隣接全体ビーカー装置を置きます。フィラメントは、4 Lのビーカーの外側に触れると250ミリリットルのビーカーの露出部分に直面しなければならない。 250mlのビーカーを4 Lのビーカーの底の中心にいることを確認してください。
7. 露出する動物のためにできるように、しかし、UVフィラメントの先端を見てから、任意のラボ要員を防止、4Lビーカー背後に大規模な、不透明な画面を配置します。警告：この障壁はUV源の電源を入れる前に所定の位置にあることを確認してください。
8. UV電源をオンにします。 30分のタイマーを設定します。どんな必要な警告ラベルは、その無防備なラボの担当者が誤って紫外線に自分自身を公開しないように置きます。
9. 30分後、UV電源を遮断する。魚と250mlのビーカーを取り外します。注：UV暴露の複数回が必要な場合、露出プロトコルを繰り返す前（〜20分）電源がクールダウンしましょう​​。 Tを交換することを確認してください彼は各露光のために新鮮なシステム水で100mlの水。 4リットルのビーカー中の水を交換する必要はない。

3。ハロゲンランプ露光

1. 1.8 L明確なアクリルの魚飼育用の水槽に250mlのビーカーから魚を移す。オーバーフローマークに給油して下さい。
2. ハロゲンランプ光処理領域を設定する。地元の金物屋からの4つの250 Wのハロゲンランプユーティリティを入手します。同じ方向に2つのランプに面しており、中央には別に29センチメートルを手配。同様の方法で、他の2つのランプを配置します。
   1. 彼らは、ランプの2つのセットの間の内〜73センチメートルを残して、ランプの第1のセットを対向されるようにランプの第2のセットを配置する。これは29×73センチメートルの長方形状の光治療領域を作成します。
3. 地元の金物屋から小さなファンを得る。ちょうど光処理領域外、ランプの2つのセットの間の等距離のファンを配置します。
4. の中心に水の完全な2 1.8 Lタンクを置きランプの2つのセットの間の等距離光処理領域。ランプ、タンクの外壁の間の距離は〜29 cmであるべきである。注：のみ1 1.8 Lタンクに10魚を治療する場合でも、このような構成を使用しています。両方のタンクは適切な範囲内で、各タンクの水の温度を維持するために必要とされる。
5. 各タンク内の酸素エアレーターを置きます。
6. ファンに最も近い端で1〜2センチのギャップを残し、透明アクリル蓋と各タンクをカバーしています。それがこの隙間に空気を爆破するようにファンを配置します。タンクの一方または両方に温度計を配置する。
7. ライト、ファン、エアレーターの電源をオンにします。最大4日間の光治療を維持する。これは動物に多くのストレスの水質と結果に影響を与えるような魚は、光治療中に供給されるべきではありません。
8. 日常的に温度と水位を監視します。 30-33で温度を維持℃に必要に応じて、ファンの回転速度および/またはタンク及びリチウムの間の距離を調整するghts。
   1. 必要に応じて、通常の毎日のシステム水で各タンクトップオフ。
   2. 常に100％近くの生存率を維持するために、健康な成人ゼブラフィッシュ（通常生後6-9ヶ月）を使用します。魚は水槽で死体で発見された場合しかし、それをすぐに削除し、全体のタンク内の水を交換してください。

4。組織採取

1. ハロゲンライト治療の発症後48時間は、治療エリアから魚を取り外す。
   1. 新鮮なエタノールホルムアルデヒド固定液（1部37％ホルムアルデヒド、9部100％エタノール）を準備。
   2. 2 - フェノキシエタノールの麻酔過剰投与（0.4 mg / Lで）とゼブラフィッシュを安楽死させる。
   3. ペーパータオルに安楽死させたゼブラフィッシュを転送します。湾曲したピンセットを使って目を摘出。
   4. 4℃で固定し、店O / Nで除核の目を置き
2. 目をCryoprotect。
   1. 室温で30分間、5％スクロースを1×PBSで目を洗い、その後に置き換える2時間のために新鮮な5％蔗糖1X PBS。次に、4℃で30％のショ糖1X PBS O / Nで目を洗う4℃で組織凍結培地、30％ショ糖1X PBS O / Nの1:1（等分）で目を洗う
3. -80℃で100％の組織凍結培地や店舗で目を埋め込む℃にオリエント組織の凍結切片を腹/背軸上で実行されるように、目。
4. スライドガラス上の凍結切片組織と場所。 55℃で2時間のためのウォームスライド-80°Cまたは直後にストアスライドは、標準的な免疫組織化学を行う。
5. 蛍光顕微鏡^40,51と切片の組織および画像上の標準的な免疫組織化学を実行します。

結果

上述光治療プロトコルはLIRDの個々の方法と比較した。暗い処置成体動物のアルビノ （ 図3-5）において、個々の光治療が重要なロッドの損失（ 図3）とコーン（ 図4）感光体が得られた。ただし、両方の個々の治療は、主に比較的軽い治療（ 図3及び図4）から保護腹側網膜を残して、網膜の背側半分に感光体が損傷している。また、ハロゲンライトの治療と比較して、紫外線治療は、網膜の背側半分（それぞれ、Cと図4Bを比較）より錐体が破損。 UVおよびハロゲン光トリートメントを組み合わせることで、主にn個を排除し、網膜全体の桿体と錐体光受容体の両方に有意に大きな損失をもたらした網膜の腹側（ 図3および図4）のeuroprotection。合成光治療プロトコルを用いた場合、個々のLIRDの方法と比較し、増殖の増加に対応するも、腹側網膜におい...

ディスカッション

ここでは、広範な光受容体の損失や堅牢な再生レスポンスの継続明るい光露光結果と短い紫外線照射を組み合わせることを示している。個人LIRDの方法と比較して、この結合方法は、また、網膜の両方の半分にロッドとコーンの両方を損傷するための最も効果的なプロトコルです。重要なことに、この処置は、着色された動物と同様に、 アルビノ動物において効果的である。

我々はより広範囲かつ一貫性のある損傷を合わせプロトコルの結果は個々のLIRD方法と比較しているという証拠を提供しますが、科学的な考察はLIRDパラダイムを選択する前に議論されるべきである。我々のデータは、全体の網膜組織（ すなわちプロテオミクス、リアルタイムPCR）分析のために収集されたときに合成法が利用されるべきことを示唆している。私達は結合された方法は、ハロゲン暴露が続く最大の病変の大きさ、そして最後にUV照射を持っていたことが分かった。我々は提案します示差桿体と錐体の再生を行うことができる遺伝子または経路を調査する際に組み合わせる方法を用いることもできる。これは実用的な理由のために可能でない場合、我々の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
UV光源	ライカ	EL600
ガラスシャーレ (150×20mm)	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS3160152BO
250ml ガラスビーカー	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS1000250
4Lガラスビーカー	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS10004L
アルミホイ	ル Fisher	01-213-105
250W ハロゲンランプ	ワークフォース	265-669
1.8 L 透明アクリルタンク	アクアニアリング	ZT180T
1.8 L 透明アクリルタンク蓋	アクアニアリング	ZT180LCL
ファン	ハネウェル	HT-900
エアレーター	テトラ	77853-900
温度計	コールパーマー	YO-08008-58
ベント鉗子 (5/45)	ワールド精密機器	504155