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高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

DOI:

10.3791/51114

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January 17th, 2014

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1Inserm U1019 - CNRS UMR 8024, Institut Pasteur de Lille, Université de Lille

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In This Article

Summary

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ここでは、小干渉合成RNA(siRNA)、化学化合物、および 結核 菌変異体ライブラリーのハイスループット/高含有スクリーンに適用可能な表現型アッセイについて述べている。この方法は、自動共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識された宿主細胞内の蛍光標識型 結核 の検出に依存している。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

治療とワクチンが利用できるにもかかわらず、結核(TB)は世界で最も致命的で広範囲にわたる細菌感染症の1つです。数十年以来、多剤および広範囲に薬剤耐性株の突然のバーストは、結核の制御のための深刻な脅威です。そのため、結核の原因 物質である結核 菌(Mtb)にとって重要な新しい標的や経路を特定し、結核薬となりうる新しい化学物質を探ることが不可欠です。1つのアプローチは、干し草の山で針の検索を可能にする大規模なライブラリの遺伝的および化学的スクリーンに適した方法を設定することです。そのために、自動共焦点顕微鏡を用いて蛍光標識された宿主細胞内で蛍光標識 Mtb を検出することに頼る表現型アッセイを開発しました。この インビトロ アッセイは 、Mtbのホストへのコロニー形成プロセスの画像ベースの定量化を可能にし、siRNA-、化学化合物、または Mtb 変異体ライブラリのスクリーンに適した384ウェルマイクロプレート形式に最適化されました。その後、画像はマルチパラメトリック分析のために処理され、宿主細胞内の Mtbの病因に関する読み取り結果を提供します。

Introduction

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過去数年間に報告された新興および再興性感染病原体の中で、結核菌(Mtb)は、2011年に140万人の死亡と870万人の新しい感染症の原因となる著名な場所を保持しています(世界結核レポート2012、www.who.int/topics/tuberculosis/en/)。多剤療法の利用可能性にもかかわらず、感染者数は依然として増加しており、多剤耐性(MDR)ならびに広範囲に薬剤耐性(XDR)Mtbは急速に世界中に広がっている1。また、Mtb抗原の存在を考慮すると、全世界の人口の3分の1がMtbによって潜感染していると考えられることは明らかである。したがって、Mtbと戦う新しい手段が緊急に必要とされています。この文脈で、我々は、自動共焦点蛍光顕微鏡3によるMtbの浸潤および増殖を宿主細胞に監視することに頼るインビトロ視覚表現型アッセイを開発した。384ウェルマイクロタイタープレートでのアッセイの適応は、自動画像取得および分析と組み合わせて、化合物、siRNAおよび細菌変異体の中規模ライブラリーの高含有量/ハイスループットスクリーニング(HC/HTS)を可能にした。この表現型アッセイに関するゲノムワイドRNAiライブラリのスクリーニングにより、Mtb人身売買や細胞内複製に関与する主要な宿主因子の同定が可能になっただけでなく、結核菌によって悪用される宿主経路の解明も可能になった。この特定の表現形学アッセイのもう一つの適応は、Mtbの食前体内持続性に不可欠な細菌因子の同定であった。例えば、ファゴソーム成熟の逮捕は、マクロファージにおけるMtbの生存および複製を促進する主要なメカニズムの1つと考えられている。蛍光標識酸性コンパートメントにおけるMtbノックアウト変異体の細胞内局在のモニタリングにより、生存プロセス4に関与する細菌遺伝子の同定が可能となった。最後に、Mtbの高含有イメージングは、細胞内細菌増殖などの様々な現象を阻害するための薬剤効率を定量化する優れた方法も提供する3。全体として、このタイプの高スループット表現型アッセイは、結核に対する創薬を加速することを可能にし、これらの異なるアプローチによって収集されたデータは、Mtbによって行われるホスト操作のより良い理解に寄与する。

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Protocol

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1. ハイスループットゲノムワイドsiRNAスクリーニング

緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するMtb H37Rvに感染したヒトII型気球モデルA549細胞系でスクリーニングを行う。この手順の概要は 、図 1Aに示します。

  1. 1x siRNAバッファーで保存されている乾燥したsiRNAライブラリ(96ウェルプレート)を4μMの濃度に達し、その混合物の10μlを384ウェルの娘プレート(ドータープレート1)に移します。
  2. 10 μlの1x siRNAバッファーを娘プレート1に加え、siRNAを2倍希釈します。siRNA再懸濁後、プレートは剥離可能なアルミニウムシールで密封され、少なくとも6ヶ月および2〜3年まで-20°Cで保存することができますが、貯蔵時間はsiRNAライブラリメーカーの推奨によって異なる場合があります。
  3. 娘プレート1のsiRNAを娘プレート2に希釈し、500nMの濃度に達した。siRNA再懸濁後、プレートは剥離可能なアルミニウムシールで密封され、少なくとも6ヶ月および2〜3年まで-20°Cで保存することができますが、貯蔵時間はsiRNAライブラリメーカーの推奨によって異なる場合があります。
  4. 使用前に、室温で娘プレート2を解凍する。
  5. 2.5 μlのsiRNAを娘プレート2から取り出し、384ウェルアッセイプレートに入れる。
  6. ステップ1.5の同じ384ウェルアッセイプレートで、2.5 μlの陰性および正のコントロールsiRNAをそれぞれのウェルに加えます。
  7. トランスフェクション試薬を1x D-PBSで希釈して、各ウェルに0.1μlトランスフェクション試薬を提供するのに十分な溶液を得て、希釈トランスフェクション溶液を室温で5分間前キューバ化します。
  8. トランスフェクション試薬/PBS溶液混合物をアッセイプレートの各ウェルに7.5 μl添加し、室温で30分間インキュベートします。
  9. 10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMI 1640培地に懸濁したA549細胞(1,500細胞/ウェル)の40 μlを加えます。5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで3日間培養期間の細胞を維持する。これらの細胞は24時間ごとに分裂し、したがって約12,000個の細胞がトランスフェクションの3日後にウェル内にある。
  10. 2週間前のGFP発現 Mtb H37Rv培養物をD-PBS(MgCl2 およびCaCl2から無料)で4,000 x gで5分間遠心して洗浄を廃棄します。このステップを 3x. 繰り返します(GFP-Mtb H37Rv カルチャ条件の場合はプロトコル 3 を参照してください)。

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Results

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ハイスループットゲノムワイドsiRNAスクリーニング

Mtb は、他のいくつかの肺上皮細胞と同様 に、インビトロで 免疫細胞を植民地化することができる。例えば 、Mtbは、ヒトII型肺球5-7のモデルとして一般的に使用されているA549上皮細胞に感染し、損傷を与えることができる。Dectin-1は 、Mtb 取り込み、A549細胞における細胞内抗菌増殖に対する炎症反応および抗菌作用に関与する宿主細胞受容体として報告された。プロトコル1に記載されたsiRNA条件は、サイレンシング効率の85%につながった(データは示さなかった)。siRNAによるデクチン-1発現のサイレンシングは、A549細胞における細胞内マイコバクテリア量の減少につながった。実際、3日間のサイレンシングと5日間の感染後、非標的スクランブルsiRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、1デクチン-1のA549細胞で感染細胞の割合が2回減少する(図2A および ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、蛍光標識された宿主細胞に感染するためにGFP発現 Mtb H37Rv株を用いた表現型アッセイに必要な方法を説明し、高含有量/ハイスループットスクリーンに適しています。このプロトコルは、広範囲の化合物、蛍光プローブおよび Mtb 変異体に適用することができる。上述した各プロトコルについて、画像取得前に固定および免疫標識のステップを行うことができた。20X(NA 0.70)または60X(NA1.2)の水レンズを搭載した自動蛍光共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。共焦点顕微鏡は405、488、561および640 nmの励磁レーザーが装備されている。放出された蛍光は450-690 nmの範囲の検出波長をカバーするフィルターのセットに関連付けられる3つのカメラを使用して捕獲される。顕微鏡の励起と発光の設定の調整は、各実験で使用される染料または蛍光色素の種類によって異なることを注意することが重要です。表現型アッセイの場合、DAPIまたはHoechstは核を染色するために10分間5μg/mlで一般的に使用されます。しかし、細胞は、細胞質、膜または細胞骨格の検出に特異的な異なる蛍光色素で染色することもで...

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Disclosures

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利益相反は宣言されていません。

Acknowledgements

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この作業に対する財政的支援は、欧州共同体(ERC-STG INTRACELLTBグラントn°260901、MM4TBグラントn°260872)、アジェンス・ナショナル・ド・レシェルシュ、フェダー(12001407(D-AL)エクイペックス・イマジックス・バイオメッド)、および地域ノルド・パ・ド・カレーによって提供されました。私たちは、プラットフォームBICeLからガスパール・デロイソン、エリザベス・ヴェルクマイスター、アントニーノ・ボンジョヴァンニ、フランク・ラフォントの技術支援を感謝しています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
&マイクロ;クリアプレートブラック、384ウェルGreiner Bio-One781091127.8/86/15 MM 蓋付き、TC処理
CellCarrier 384ウェルプレートPerkinElmer6007550ブラック、クリアボトム、蓋付き、TC処理
Vボトムホワイト、384ウェルプレートGreiner Bio-One781280 
シーリングテープ、通気性、滅菌Corning3345 
リポフェクタミン RNAiMaxLife Technologies13778150トランスフェクション試薬
ジメチルスルホキシSigma-Aldrich34943 
RPMI 1640 + GlutaMAX-ILife Technologies61870-010細胞培養培地
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2Life Technologies14190-094ダルベッコ'リン酸塩基
バッファーD-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2Life Technologies14190-091Dulbecco'リン酸塩分緩衝液
ウシ胎児血清ライフテクノロジーズ2610040-79 
Ficoll Paque PLUSDutscher17-1440-03Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells Purification
CD14 MicroBeads, humanMiltenyi130-050-201Purification of CD14+ Monocytes
Human M-CSF, premium gr. (1000 μg)Miltenyi130-096-493マクロファージコロニー刺激因子
LSカラムMiltenyi130-042-401CD14+単球単離用カラム
Tween 80Euromedex2002-Aマイコバクテリア培養
グリセロール高純度 Euromedex50405-EXマイコバクテリア培養
 ミドルブルックOADC濃縮ベクトン・ディキンソン211886マイコバクテリア培養
7H9クトン・ディキンソンW1701Pマイコバクテリア培養
Versene 1xLife Technologies15040033非酵素的細胞解離溶液
DAPILife TechnologiesD1306色素
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570核色素
Syto60Life TechnologiesS11342核/細胞質色素
ホルマリンSigma-AldrichHT5014細胞固定液
siRNA 標的 Dectin-1Santa-Cruzsc-63276 
*siGenome* ノンターゲットsiRNAプール ダルマコンD-001206-14 
リファンピシンSigma-AldrichR3501抗生物質
イソニアジド (INH)Sigma-AldrichI3377-50G抗生物質
ハイグロマイシン Bライフ テクノロジーズ 10687-010抗生物質
アミカシンSigma-AldrichA1774抗生物質
全米共焦点顕微鏡 OPERAPerkinElmer画像取得
コロンバス 2.3.1 サーバー データベースPerkinElmerデータ転送、保存、分析
アカペラ 2.6 ソフトウェアPerkinElmer画像ベースの分析
GraphPad Prism5 ソフトウェアGraphPad統計分析
Excel 2010マイクロソフト統計分析
ド ベ核

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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