高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

過去数年間に報告された新興および再興性感染病原体の中で、結核菌(Mtb)は、2011年に140万人の死亡と870万人の新しい感染症の原因となる著名な場所を保持しています(世界結核レポート2012、www.who.int/topics/tuberculosis/en/)。多剤療法の利用可能性にもかかわらず、感染者数は依然として増加しており、多剤耐性(MDR)ならびに広範囲に薬剤耐性(XDR)Mtbは急速に世界中に広がっている^1。また、Mtb抗原の存在を考慮すると、全世界の人口の3分の1がMtbによって潜感染していると考えられることは明らか^である。したがって、Mtbと戦う新しい手段が緊急に必要とされています。この文脈で、我々は、自動共焦点蛍光顕微鏡³によるMtbの浸潤および増殖を宿主細胞に監視することに頼るインビトロ視覚表現型アッセイを開発した。384ウェルマイクロタイタープレートでのアッセイの適応は、自動画像取得および分析と組み合わせて、化合物、siRNAおよび細菌変異体の中規模ライブラリーの高含有量/ハイスループットスクリーニング(HC/HTS)を可能にした。この表現型アッセイに関するゲノムワイドRNAiライブラリのスクリーニングにより、Mtb人身売買や細胞内複製に関与する主要な宿主因子の同定が可能になっただけでなく、結核菌によって悪用される宿主経路の解明も可能になった。この特定の表現形学アッセイのもう一つの適応は、Mtbの食前体内持続性に不可欠な細菌因子の同定であった。例えば、ファゴソーム成熟の逮捕は、マクロファージにおけるMtbの生存および複製を促進する主要なメカニズムの1つと考えられている。蛍光標識酸性コンパートメントにおけるMtbノックアウト変異体の細胞内局在のモニタリングにより、生存プロセス4に関与する細菌遺伝子の同定が可能^となった。最後に、Mtbの高含有イメージングは、細胞内細菌増殖などの様々な現象を阻害するための薬剤効率を定量化する優れた方法も提供^する3。全体として、このタイプの高スループット表現型アッセイは、結核に対する創薬を加速することを可能にし、これらの異なるアプローチによって収集されたデータは、Mtbによって行われるホスト操作のより良い理解に寄与する。

1. ハイスループットゲノムワイドsiRNAスクリーニング

緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するMtb H37Rvに感染したヒトII型気球モデルA549細胞系でスクリーニングを行う。この手順の概要は 、図 1Aに示します。

1. 1x siRNAバッファーで保存されている乾燥したsiRNAライブラリ(96ウェルプレート)を4μMの濃度に達し、その混合物の10μlを384ウェルの娘プレート(ドータープレート1)に移します。
2. 10 μlの1x siRNAバッファーを娘プレート1に加え、siRNAを2倍希釈します。siRNA再懸濁後、プレートは剥離可能なアルミニウムシールで密封され、少なくとも6ヶ月および2〜3年まで-20°Cで保存することができますが、貯蔵時間はsiRNAライブラリメーカーの推奨によって異なる場合があります。
3. 娘プレート1のsiRNAを娘プレート2に希釈し、500nMの濃度に達した。siRNA再懸濁後、プレートは剥離可能なアルミニウムシールで密封され、少なくとも6ヶ月および2〜3年まで-20°Cで保存することができますが、貯蔵時間はsiRNAライブラリメーカーの推奨によって異なる場合があります。
4. 使用前に、室温で娘プレート2を解凍する。
5. 2.5 μlのsiRNAを娘プレート2から取り出し、384ウェルアッセイプレートに入れる。
6. ステップ1.5の同じ384ウェルアッセイプレートで、2.5 μlの陰性および正のコントロールsiRNAをそれぞれのウェルに加えます。
7. トランスフェクション試薬を1x D-PBSで希釈して、各ウェルに0.1μlトランスフェクション試薬を提供するのに十分な溶液を得て、希釈トランスフェクション溶液を室温で5分間前キューバ化します。
8. トランスフェクション試薬/PBS溶液混合物をアッセイプレートの各ウェルに7.5 μl添加し、室温で30分間インキュベートします。
9. 10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMI 1640培地に懸濁したA549細胞(1,500細胞/ウェル)の40 μlを加えます。5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで3日間培養期間の細胞を維持する。これらの細胞は24時間ごとに分裂し、したがって約12,000個の細胞がトランスフェクションの3日後にウェル内にある。
10. 2週間前のGFP発現 Mtb H37Rv培養物をD-PBS(MgCl₂ およびCaCl₂から無料)で4,000 x gで5分間遠心して洗浄を廃棄します。このステップを 3x. 繰り返します(GFP-Mtb H37Rv カルチャ条件の場合はプロトコル 3 を参照してください)。
11. 10%FBSを添加したRPMI 1640培地の10mlで細菌ペレットを懸濁し、室温で1時間デカントして、細菌凝集体を堆積物にできるようにします。
12. 細菌の上清を収集し、測定OD_{600(OD 600} は0.6-0.8の間でなければならない)とGFP-蛍光(RFU値)をマイクロプレートリーダーを使用して細菌の濃度を決定します。同じ条件で調製された別の培養物に対して実験前に生成されたRFU値=f(CFU値)を表示する参照回帰線を用いて懸濁液の力価を算出する。感染の多重度(MOI)5に対応する2.4 x 10⁶ 個の細菌/mlを含む細菌懸濁液を調製します。
13. 384ウェルアッセイプレート内の培地を取り出し、25μlの新たに調製した細菌懸濁液を加えます。
14. 384ウェルアッセイプレートを5%CO2を含む雰囲気で5時間37°Cでインキュベートする。
15. 培地を取り出し、10%FBS 3xを添加したRPMI培地で細胞を静かに洗います。
16. 残りの細胞外細菌を殺すために、5%CO2を含む大気中で、50μg/mlのアミカシンを含む50μlの新鮮なRPMI-FBS培地を37°Cで1時間処理する。
17. 培地含有アミカシンを取り出し、10%FBSを添加した新鮮なRPMI培地を50μl加えます。384ウェルアッセイプレートを5%CO2を含む雰囲気で5日間、37°Cでインキュベートする。
18. 画像取得前に、PBSで作りたての30μg/mlのDAPI(最終濃度5μg/ml)を10 μl加え、37°Cで10分間インキュベートします。
19. プレートを自動共焦点顕微鏡に積み込みます。
    
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20. 露出パラメータを設定します。放出フィルター520 nmを用いた励起レーザー450nmおよびGFP蛍光を用いた励起レーザー405 nmを用いたDAPI蛍光を記録する。
    
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21. 取得する各ウェルのウェルとフィールドを選択し、レイアウトパラメータとサブレイアウトパラメータと呼びます。
    
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22. 手順 1.20 および 1.21 のパラメータを使用して実験ファイルを生成し、自動取得を実行します。
    
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23. リモート サーバーにイメージを転送します。
    
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24. 画像解析ソフトウェアを使用して画像を評価します。ピクセル強度特性アルゴリズムを用いて、核検出アルゴリズムとGFPチャンネルからの細菌領域を用いてDAPIチャネルから細胞核を検出する(図4A)。

注: このプロトコルは、細胞内 Mtb 成長に対する遺伝子サイレンシングの効果を調べるように最適化されています。 Mtb は、最適な条件で20時間ごとに分割する低成長細菌です。感染後5日後、細胞外 Mtb の量は、細胞内のリシスがない場合にはまだ少なく、分析の質に影響を与えなかった。このプロトコルは、広範囲に放出され、新しい細胞に感染することができる マイコバクテリアススメグマティスや大腸菌 のような急速成長細菌を使用してsiRNAスクリーンに適応する抗生物質治療およびインキュベーション時間の長さの点で最適化されなければならない。

2. ハイスループット複合スクリーニング

Mtb H37Rv感染宿主細胞に対してスクリーニングを行った。この手順の概要は 図 1Bで説明しています。

1. DMSO 100%で可溶化した化合物ライブラリーを含む384ウェルのマザープレートを解凍する。10%FBSを添加したRPMI 1640培地10μlを含む384ウェルのドータープレートに0.5 μlの化合物を移します。
2. 2週間前のGFP発現 Mtb H37Rv培養物をD-PBS(MgCl₂ およびCaCl₂から無料)で4,000 x gで5分間遠心して洗浄を廃棄します。このステップ 3x を繰り返します(GFP-Mtb H37Rv カルチャ条件の場合は、プロトコル 3 を参照してください)。
3. 10%FBSを添加したRPMI 1640培地の10mlで細菌ペレットを懸濁し、室温で1時間デカントして、細菌凝集体を堆積物にできるようにします。
4. 細菌の上清を収集し、マイクロプレートリーダーを使用してOD_{600(OD 600}は0.6-0.8の間でなければならない)とGFP蛍光(RFU値)を測定します。実験前に生成されたRFU値=f(CFU値)を表示する参照回帰線を用いて懸濁液の力価を計算する。典型的な濃度は1 x 10⁸の細菌/mlである。
5. 収穫 6 日古い初代ヒトマクロファージRPMI 1640 培地で 10% ウシ胎児血清 (FBS) および 50 ng/ml 組み換えヒト M-CSF (ヒト末梢血単球細胞の精製およびマクロファージ分化についてはプロトコル 4 参照) を補充した。
6. 希釈した一次細胞を異なるMOIで、1〜5の範囲で、37°Cで2時間90rpmで軽度の揺れを伴う懸濁液でインキュベートする。
7. 感染した細胞を350xgで遠心分離して洗浄し、細胞外細菌を除去する。各遠心分離工程の後、10%FBSを添加したRPMI 1640培地中のペレットを再懸濁する。この手順を 2x 繰り返します。
8. 10%FBSとアミカシンを50 μg/mlで補充したRPMI 1640培地中の感染細胞を一時停止し、37°Cで1時間の軽い揺れを伴う懸濁液をインキュベートする。
9. アミカシンを含む培地を350xgで遠心分離して除去し、10%FBSおよび50ng/ml組み換えヒトM-CSFを添加した完全なRPMI 1640培地で感染細胞を洗浄する。1 回繰り返します。
10. ステップ2.1の同じアッセイプレートに40μlの感染マクロファージ懸濁液を加え、すでに10μlの化合物希釈液を含んでいる。各ウェルのDMSOの最終濃度は1%に達しました。
11. 5%CO2を含む雰囲気の中で37°Cで5日間アッセイプレートをインキュベートする。
12. 細胞透過性の遠赤色蛍光色素で生細胞を染色する。
13. プレートを自動共焦点顕微鏡に積み込みます。
    
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14. 露出パラメータを設定します。発光フィルター520 nmを用いた励起レーザー488nmを用いた発光フィルター690 nmおよびGFP蛍光を用いた励起レーザー640 nmを用いた極赤色蛍光を記録する。
    
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15. 取得する各ウェルのウェルとフィールドを選択し、レイアウトパラメータとサブレイアウトパラメータと呼びます。
    
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16. 手順 2.14 および 2.15 のパラメータを使用して実験ファイルを生成し、自動取得を実行します。
    
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17. リモート サーバーにイメージを転送します。
    
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18. 画像解析ソフトウェアを使用して画像を評価します。ピクセル強度特性アルゴリズムを使用して、GFPチャンネルから、ピクセル強度特性アルゴリズムと細菌領域を用いて遠赤色チャネルから細胞領域を検出する(図4B)。

注:このプロトコルは、蛍光タンパク質を発現する変異体(1つのウェル/ワン変異体)によって化合物を置換することによってMtb変異ライブラリースクリーニングに適応することができる(図1C、Brodinらも参照)。⁴⁾蛍光変異体は、まずウェル(ウェルあたり20μlの細菌懸濁液)に播種される。細菌は、その後、細胞懸濁液の30 μlによって回収されます。350xgで1分間遠心分離した後、プレートを5%CO2を含む雰囲気中で37°Cでインキュベートする。インキュベーション時間とMOIはアッセイに依存します。例として、ファゴソーム酸性化などの初期の細胞事象を可視化するために、細胞は1〜20の範囲のMOIで2時間感染することができる。リソソームは、5%CO2を含む雰囲気の中で37°Cで1.5時間2μMのリソトラッカー色素を使用して染色され、10%ホルマリンまたは4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定されます。共焦点画像は、リソソーム検出および細胞内局在化のための適切なアルゴリズムを特徴とする画像解析スクリプトを用いて取得し、最終的に解析される^。

3. 緑色蛍光タンパク質結核菌H37Rv(GFP-H37Rv)の培養条件を発現

長期保存のために、GFP-H37RvはD-PBSで凍結した(バイアルあたり約1 x 10⁸ マイコバクテリア)。

1. ミドルブルックOADC濃縮10%、グリセロール0.5%、Tween-80 0.05%、ハイグロマイシンB(50μg/ml)を添加した7H9スープ培地50mlを含むエルレンマイヤーフラスコ中のGFP-H37Rvの冷凍在庫バイアルを再懸濁します。
2. 37°Cで8日間インキュベートする。
3. GFP-H37Rv培養の_OD600 を測定する。
4. GFP-H37Rv培養液を希釈して、ミドルブルックOADC濃縮_10%、 グリセロール0.5%、Tween-80 0.05%、ハイグロマイシンB(50μg/ml)を添加した新鮮な7H9ブロス培地でOD 600=0.1を得る。
5. GFP-H37Rvを37°Cで8日間インキュベートしてから、アッセイに使用してください。

4. 全血またはバフィーコート調製からのヒト末梢血単球細胞精製

1. 1%FBSを含む1x D-PBS(MgCl 2および_CaCl2から解放)で血液ポーチ_2xを希釈します。
2. 400 x g で Ficoll 密度勾配遠心分離により 20 分間、単球を分離します。
3. 単球を収集します。
4. 1x D-PBS(MgCl₂ およびCaCl₂から自由)で1%FBSを含む1%FBSを室温で10分間400xgで遠心分離して、単球3xを洗浄します。
5. 細胞を1 x 10^7の細胞 /mlまで濃縮します。
6. メーカーのプロトコルに従ってCD14磁気ビーズを使用して単球を精製します(材料を参照)。
7. CD14-単球精製後、細胞を1.5 x 10⁶細胞/ml RPMI 1640で播種し、10%FBSおよび40ng/mlのヒトマクロファージコロニー刺激因子(hM-CSF)を補い、5%CO2を含む雰囲気で37°Cで4日間インキュベートした。
8. 4日後、培地を新鮮なRPMI 1640で交換し、10%FBSと40ng/mlのhM-CSFで補い、5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで2日間インキュベートした。
9. 6日後、細胞はアッセイに使用することができる。

ハイスループットゲノムワイドsiRNAスクリーニング

Mtb は、他のいくつかの肺上皮細胞と同様 に、インビトロで 免疫細胞を植民地化することができる。例えば 、Mtbは、ヒトII型肺球5-7のモデルとして一般的に使用されているA549上皮細胞に感染し、損傷を与えることができる。Dectin-1は 、Mtb 取り込み、A549細胞における細胞内抗菌増殖に対する炎症反応および抗菌作用に関与する宿主細胞受容体として報告された。プロトコル1に記載されたsiRNA条件は、サイレンシング効率の85%につながった(データは示さなかった)。siRNAによるデクチン-1発現のサイレンシングは、A549細胞における細胞内マイコバクテリア量の減少につながった。実際、3日間のサイレンシングと5日間の感染後、非標的スクランブルsiRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、1デクチン-1のA549細胞で感染細胞の割合が2回減少する(図2A および 2B)。我々は、Zスコアを定義するためにスクランブルと比較して、デクチン-1を標的とするsiRNAのサンプルベースの正規化を適用した。 図2Cに示すように、デクチン-1を標的としたsiRNAに対して-15前後のZスコア平均を得た。Dectin-1は、SiRNAスクリーンの陽性対照として使用して、Dectin siRNAと同じ表現型を有する可能性のある肺炎球中の Mtb コロニー形成に関与する他の新しい宿主因子を発見することができる。スクリーン中の各マイクロプレートのコントロールとして表現型に影響を与えるsiRNAを使用することで、各プレートの正規化が可能になり、全ゲノムスクリーン解析を行いたい場合に便利です。統計パラメータZ'は、siRNAスクリーニングデータの検証に許容される値である、スクランブルおよびsiRNA標的Dectin1に対する制御ベースの正規化を使用して0.1であった。

高含有化合物スクリーニング

細胞内細菌増殖に対する化合物効率は、用量応答曲線(DRC)を確立することによって評価され、参照陽性化合物および負化合物溶媒制御に正規化される。代表的なDRCの2つの基準化合物は、イソニアジド(INH)およびリフィンピシン(RIF)、Mtb増殖に対して活性が図3に示されている。 これらの曲線は、GFP発現Mtb H37Rv株に感染したヒトの主要マクロファージで得られ、感染後5日後に読み出しが行われている。DMSO と INH をそれぞれ 1% と 0.1 μg/ml の最終濃度で使用すると、一般的に陰性および正のコントロールとして使用され、基礎レベルの効率 (0 および 100%)(図3A)図4Bに詳述した画像解析プロセスに続いて、マルチパラメトリックデータは、自動共焦点顕微鏡で撮影した感染ヒトマクロファージの共焦点蛍光画像から抽出される。宿主細胞におけるMtbの細胞内複製に影響を及ぼす活性化合物は、マイコバクテリア負荷の低下を引き起こし、これは画像上の細胞内のGFPシグナルの領域に相当する(図3B)。細胞内細菌領域と全細胞面積との比率は、画像ベースの解析ソフトウェアを用いて計算し、化合物濃度の関数でプロットされ、DRCを生成する(図3B)。これらの曲線は、細菌負荷を50%減少させるために必要な濃度(IC50)と、細菌複製の99%を阻害するのに必要な最小濃度(MIC99)の両方を決定することを可能にする(図3C)。Z'はコントロールDMSO 1%とコントロールINH 0.1 μg/mlに基づいて0.49であった。このZ'は、本当に0.5に近い、このアッセイを検証するために許容される。

図 1.ビジュアル高コンテンツスクリーニングアプローチsiRNA(A)、化学化合物(B)およびMtb変異体(C)スクリーンに使用されるMtb感染モデルシステムの模式的表現。 (A)siRNAライブラリースクリーン:細胞を384ウェルプレートで3日間siRNAでトランスフェクションした。siRNAトランスフェクション細胞は、GFP-Mtbに感染し、5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで5日間インキュベートした。次いで細胞を染色し、自動共焦点顕微鏡を用いて画像を採取した。(B)化合物ライブラリー画面:化合物を384ウェルプレートに分布した。細胞懸濁液とGFP-Mtbを37°Cで2時間一緒にインキュベートした。 感染した細胞をプレートに播種し、5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで5日間インキュベートした。次いで細胞を染色し、自動共焦点顕微鏡を用いて画像を採取した。(C)蛍光性-Mtb変異体ライブラリー:蛍光Mtb変異体を384ウェルプレートに播種し、宿主細胞懸濁液を分配した。インキュベーション時間はアッセイによって異なった。細胞または細胞小胞を、自動画像取得前に染色した。ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。

図 2.Dectin-1サイレンシングは、A549細胞におけるMtbコロニー形成に及ぼす影響を示す。(A)非標的siRNA(スクランブル)またはデクチン-1に特異的なsiRNAを用いてトランスフェクトしたA549細胞の代表的な共焦点像(10X空気レンズ)を、GFP-Mtb H37Rv(MOI5)に5日間感染した。スケールバーは、200 μm (A) GFP-Mtb H37Rv を緑色で、細胞を赤で視覚化した。細胞数(A.細胞検出)および細胞内GFP-Mtb H37Rv負荷(A.細菌領域)は、画像ベースの解析ソフトウェアを用いて決定した。(B) スクランブルsiRNA(青い円)およびデクチン-1 siRNA(赤い円)の5つの複製(w1〜w5)における感染A549細胞の割合のグラフィック表現。(C)スクランブル siRNA および Dectin-1 siRNA の Z スコア平均のグラフィック表現(*** p値 < 0.0001)。ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。

図 3.ヒトマクロファージにおけるMtbに対する活性基準化合物の用量応答曲線。(AおよびB)MOI1に感染したヒトマクロファージ(赤、赤色蛍光色素で標識された細胞)の代表的な共焦点像(20X水レンズ)をMOI1で5日間感染した。スケールバーは50 μmを表します。(A)DMSOでインキュベートされた感染細胞の画像1%をアッセイにおいて陰性対照として使用した。(B) イソナジド(INH)とリバンピシン(RIF)の2つの参照化合物の濃度を増加させてインキュベートされた感染細胞の画像。(C) INHおよびRIFの用量応答曲線(DRC)画像ベースの分析により、試験した各化合物に対するDRCの判定が可能になった。DRCは、細胞内GFP-細菌領域と全細胞領域(Y軸)との比率を表し、化合物濃度(対数スケール、x軸)の機能を有する。各グラフにおいて、化合物のDRCを、0.1μg/mlの濃度での陰性対照DMSO1%(0%阻害)および正対照INH(100%阻害)のそれを正規化した。各化合物について、細菌コロニー形成の50%を阻害するために必要な濃度(IC50)および最小の阻害濃度(MIC99)をDRCから算出した。ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。

図 4.蛍光細胞内抗酸菌を決定するための標準的な画像ベースの分析。384ウェルプレートからの画像は、自動共焦点顕微鏡を使用して取得しました。この場合、同じウェル(フィールド)の4つの異なる画像が記録されました。その後、各フィールドを画像ベースの解析ソフトウェアAcapella 2.6(パーキン・エルマー)を用いて分析した。(A)各フィールドには、次のアルゴリズムを使用してセグメント化された細菌(緑色)と細胞核(青チャネル)用の2つのチャネル(2色)が含まれていました: i)組み込みのAcapella手順を使用して核検出、 ii)細胞質検出は、核集団に基づいて、組み込みのアカペラ手順を用いて、iii)手動で定義された閾値より高い画素のみを保持することにより細菌検出、iv)細胞を細菌の位置と合体して感染細胞を同定する。最終結果は、4つの分野の平均として表され、総細菌面積、細胞の総数、感染細胞の割合および細胞あたりの細菌面積(全感染細胞の平均)である。(B)各フィールドには、細菌用(緑色チャネル)用と細胞核用(遠赤色チャネル)の2つのチャンネルが含まれており、次のアルゴリズムを使用してセグメント化された(i)アンチメジアンフィルタを使用して元のチャネルをフィルタリングし、 ii)強度が手動で定義された閾値よりも高いピクセルのみを保持する(各チャンネルは独自の閾値を有する)、iii)各チャンネルの残りのピクセル数を数え、iv)チャネルをマージし、細菌と核の両方が共有するピクセル数を数えて細胞内細菌を定量する。最終結果は、4つの分野の平均として表され、総細菌面積、総細胞面積、細胞内細菌の総面積、細胞内細菌領域と細胞の総面積との比率である。ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。

利益相反は宣言されていません。