方法論記事

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

DOI：

10.3791/51215

⸱

2014年6月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1The BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Medical School, 3Shriners Burns Hospital, 4Harvard University School of Engineering and Applied Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、堅牢で再現性の全血の1滴からヒト好中球走化性を測定するように設計分析について詳しく説明します。このアプローチは、好中球の分離のための必要性を回避し、アッセイ準備時間のほんの数分を要する。サンプル量が限られているマイクロ流体チップは、乳幼児や小さな哺乳類では時間の経過とともに好中球走化性の反復測定を可能にします。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

好中球は、感染および血液中のそれらの数に対する保護において重要な役割を果たして頻繁に診療所で測定される。低好中球数は感染症の高いリスクについて警告サインであるが、血液中の高い好中球数は、通常、進行中の感染症の指標である。その機能を達成するために、好中球はまた、感染症が発生する組織内に、彼らの人生の大半を費やし、血液から効果的に移動できるようにする必要がある。その結果、移行する好中球の能力の欠陥は、好中球は、血液中の適切な数で存在する場合にも、感染症のリスクを高めることができます。しかし、診療所での好中球の遊走能を測定することは、時間がかかり、困難な作業であり、多量の血液、及び専門的な知識が必要になります。これらの制限に対処するために、我々はまわり、未処理の血液の一滴を必要とする好中球遊走のためのロバストなマイクロ流体アッセイを設計した好中球の分離の必要性を通気し、簡単な顕微鏡で定量化することは容易である。このアッセイでは、好中球は、化学誘引物質源に向かって、小さなチャネルを通して、血液の液滴から直接移行します。同じチャネルを介して赤血球の粒状流れを防止するために、我々は、選択的に赤血球の進行をブロックすることになり直角と機械的にフィルタを実装した。我々は、指穿刺および静脈血から採取された血液の液滴からの好中球遊走を比較することによりアッセイを検証した。我々はまた、精製された好中球のサンプルから好中球の遊走これらの全血（WB）のソースを比較し、3ソース間の一貫性の速度と方向性を見つけた。このマイクロ流体プラットフォームは、健康と病気における好中球機能の理解を進めるために役立つクリニックや研究環境で、人間の好中球遊走の研究が可能になります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

好中球の人身売買は、アテローム性動脈硬化症1、細菌感染症や敗血症2を含む多くの炎症状態の進行と解像度を決定する上で重要な役割を果たしており、傷害3を焼く。健康と病気の状態への主要な貢献のために、好中球数は、多くの場合、臨床および研究実験室で検討標準的な血液分析の一部である。しかし、ほとんどのユビキタス試験の一つであるにも関わらず、感染症や敗血症の診断における好中球数の値が頻繁に4を疑問視されている。例えば、熱傷患者における好中球の1の研究では、好中球数及び好中球遊走機能は相関しないことを明らかにした。好中球が単独で数えることを意味して免疫状態3の正確な指標ではありません。測定することはより困難であるが、好中球の機能的能力は、広範囲の条件でより価値として提案されている。

tは ">重要なのは、好中球の欠陥の多くは一過性であり、恒久的な遺伝的欠陥によってトリガされず、大部分は最近まで、診療所で見過ごされてきた区別は。火傷の文脈では、好中球遊走はもちろん中に監視することができた炎症状態または感染3の指標として、患者の治療が、彼 ​​らは大量の血液を必要とするため、現在の研究室（Boydenチャンバー、ダン室、マイクロピペットアッセイ）で使用される従来の移動アッセイは、臨床現場に翻訳することができず、面倒で時間のかかる好中球の単離技術（ 表1）。好中球の単....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。マイクロ流体デバイスの作製

  1. 標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して、クラス千クリーンルーム内でマスターモールドウェハを作製。パターン製造業者の指示に従って、移行チャネルを定義するための第3μmの薄いエポキシベースのネガ型フォトレジスト層を形成する。パターンセルローディングおよびケモカイン室を定義する第50μmの厚さの層。
  2. ポリジメチルシロキサン（PDMS）デバイスをキャストするようにパターン化ウェハを使用しています。激しく大きなプラスチック秤量トレイのプラスチックフォークを用いて5分間、開始剤（2g）を用いてPDMS（20g）に混合する。
  3. 慎重に、金型上に、PDMSを注ぐ。
  4. 1時間真空乾燥器にあけ、PDMS金型を配置することによって、PDMSを脱気。
  5. 焼くと65℃に設定したオーブンで、少なくとも3時間、PDMSマイクロ流体デバイスを治す
  6. 1.5ミリメートルの先端径とパンチャーを使用して中央WBLCsを打ち抜く。
  7. 穿刺を用いて全ドーナツ型のデバイスをパンチアウト5.0ミリメートルの先端径と彼女。
  8. 粘着テープを使用したドーナツデバイスから粒子を除去する。
  9. 脱イオン水で12ウェルプレートを洗い流してから窒素で乾燥。 5分間60℃のオーブンにプレートを置きます。
  10. 酸素プラズマは、二回の12ウェルプレートを治療する;一回だけでは35秒してから、再度、別の....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全血（WB）好中球走化性アッセイは、fMLPの勾配（ 映画S1）に向かう好中球の蓄積を測定することにより確認した。結果は、好中球（ブルー）が積極的に全血（ 図3Aと動画S1）から移動することができますが赤血球を濾過コームにトラップされていることを確認。全血のマイクロ流体装置によって形成された安定な化学誘引物質線形勾配（緑色）は、FITC-標識デキストラン（ 図3Aの挿入図）を用いて確認し、経時的な蛍光のレベルを測定した。これらのデバイスで生成さ勾配が小さい分子のための24時間までの、より大きな分子量のために週まで安定していた。洗浄プロトコルの効率はWBLCで無信号がFCCにローカライズされた蛍光信号を画像化する、またはデバイスを囲むことにより確認した。デバイスは、次の異なるBLから好中球遊走の差を評価するために使用されたOOD源。

小説のWB走化性プラットフォームを使用して得られた結果は、静脈、WBからのWBの指穿刺液滴からの好中球、または静脈血か.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、血液の小滴（2μL）から好中球の走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォームを開発しました。積極的に好中球の移行からのRBCのオンチップ·機械的ろ過は、好中球を活性化することにより、成果物を導入する傾向があるような密度が10の勾配などの煩雑な細胞分離方法は、ポジティブ選択11、または負の選択12の必要性を回避する。 RBCの機械的ろ過は、好中球の遊走をプロービングするための他のマイクロ流体チップから私たちの技術を区別します。例えば、我々の研究室13からの先行研究ビーブらの前に走化性アッセイに全血サンプルからの好中球を分離するためのチップ上に8利用セレクチン、。セレクチン表面上の分離した後、好中球遊走は、緩衝液中に発生した。これらの条件下では、好中球走化性に対する血清の影響を除去した。また、セレクチンが知られている特定の受容体を係合することにより細胞を活性化するので、 インビトロ走化性測定値に変更することができる。私たちのデバイス内の赤血球ろ過コームによる機械.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

開示する特別の利害関係はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

国立衛生研究所からのサポートはしてシュライナーズホスピタル·バーンズ（GM092804、DE019938を付与）。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Device Fabrication
SU-8MicrochemY131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)Ellsworth AdhesivesSylgard 184 1.1 lb. Kit
標準スライドガラスFisher Scientific1254951 X 3 インチ
ガラス底板MatTekP12G-1.5-14-F
ハリスユニコア 先端径5.0mmテッド・ペラ社15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mmTed Pella, Inc. (株)15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tipFisher Scientific02-707-139
SyringeFisher Scientfic309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.ブリコメディカルサプライBN3005
バキュテイナー、ヘパリンベクトンディキンソン
HBSSシグマアルドリッチ
ヒト血清アルブミンシグマアルブリッチA5843-5GHBSS
シグマアルドリッチF3506-10MGの最終濃度0.2%
SurgiLance 安全ランセット 深さ 2.2 mm 22 GSLN240
Hoescht stainLife TechnologiesH3570
Positive Control
HetaSepSTEMCELL Technologies Inc.7906
EasySep ヒト好中球濃縮キットSTEMCELL Technologies Inc.19257
プラズマアッシャーマーチ インスツルメンツP-250
リンドバーグ/ブルー M オーブンサーモサイエンティフィック13-258-30C
ステンレス鋼精密ピンセットテクニ ツール758TW458
ベルアート サイエンスウェア 耐薬品性真空デシケーターフィッシャー サイエンティフィ08-594-15A
データプレート デジタル ホットプレートAlpha MultiservicesPMC 720
Nikon TiE倒立顕微鏡Nikon - Micro Video Instruments Inc.
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd 対物レンズニコン - マイクロビデオインスツルメンツ株式会社
MRH20101 Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikonニコン - Micro Video Instruments Inc.500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA 狭帯域 32 mm エキサイタ - 25 mm エミッタクロマ - Micro Video Instruments Inc.31013v2
Retiga R 2000 冷却 CCD カメラ 1,600 x 1,200 ピクセルQimaging - Micro Video Instruments Inc.RET-2000R-F-M-12-C
フィブロネクチンシグマアルドリッチF0895-1MGfMLPック MEA53100

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
  2. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  3. Butler, K. L., et al.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

PDMS

関連記事