ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmRNA関連のアイソレーション

サマリー

ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAの多くはミトコンドリア外膜に関連している。私たちは、それに関連するmRNAおよびリボソームと酵母ミトコンドリアの分離を目的とした細胞下分画の手順が記載されている。このプロトコルは、mRNAの局在化およびミトコンドリア付近の局所的な翻訳の機構を明らかにするために、多様な条件下で増殖させた細胞に適用することができる。

要約

ミトコンドリアタンパク質の大部分は核内にエンコードされ、細胞小器官にインポートされる必要がある。タンパク質はミトコンドリアの近くに合成されている間、輸入が発生することがあります。この可能性のサポートは、ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAは、多くのミトコンドリア付近に局在することが示された最近の研究に由来する。一緒に外膜とのリボソーム協会の以前のデモで、これらの結果は、局所的な翻訳プロセスを示唆している。このような局所的な変換は、輸入の効率を向上させる独自の規制部位を提供し、異所性発現の例を最小にすることができる。多様な方法には​​、局所的な翻訳を媒介する因子および要素を特徴付けるために使用されてきた。これらの中で標準差動遠心分離によって細胞下分画である。このプロトコルは、単一の手順でのmRNA、リボソームとタンパク質の単離できるという利点がある。これらは、次いで、種々の分子と両性によって特徴付けることができるochemical方法。さらに、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクス法は、それによってゲノムワイドな洞察を可能にし、得られた材料に適用することができる。そのような研究のためのモデル生物としての酵母の使用は、速度、費用および単純性の利点を有する。さらに、高度な遺伝学的ツールおよび使用可能な削除株が候補因子の検証を容易にします。

概要

真核細胞は、特定の機能を有する個別のコンパートメントで構成されています。その機能を実現するためには、各区画には、その活性に必須であるタンパク質の固有のセットが含まれています。これらのタンパク質は、そのコンパートメントにアプローチを通して可能なメカニズムは、ローカライズ、翻訳^、1,2である。このプロセスにおいて、タンパク質は、そこに配置されるリボソームおよびmRNAにより目的地に合成される。ローカライズされた翻訳の可能性の利点の中で、タンパク質のターゲティングの効率を増加したタンパク質シャペロンの必要性が減少し、サイト固有の制御機構を可能にしています。また、ローカライズされたmRNAおよびリボソームは、一般的な翻訳が阻害される細胞ストレス、例に翻訳機構の人里離れた貯水池することができます。

ミトコンドリアは、近年ではローカライズされた翻訳を研究するための中心的なモデルとなりました。ほとんどのミトコンドリアタンパク質は、核内に符号化された細胞質ゾルに翻訳され、および細胞小器官にインポート。証拠の様々な線は、これらのタンパク質の多くは局所変換プロセスを介して産生されることを示している。最初に、電子顕微鏡および生化学的分画研究は、ミトコンドリア^3-5に関連したリボソームを検出しました。その後、共翻訳的に^6,7にのみインポートすることが判明した特定のmRNA上の仕事によってin vivoで裏付けられ、こ....

プロトコル

1。ミトコンドリア精製

細胞のペレットを計量。おおよそ0.6グラムを100mlの細胞から得られる。

1. 30で₆₀₀ = 1-1.5にOD酵母細胞100〜150ミリリットルの成長 ミトコンドリアを濃縮するために、このようなガラクトースベースの成長培地として非発酵増殖培地上℃、、。
2. 室温で5分間3000×gで遠心分離細胞、上清を捨てる。
3. 再び蒸留水と遠心でペレットを洗浄。上清を捨てる。
4. 細胞の0.5グラム当たり1ミリリットルのDTTバッファーでペレットを再懸濁します。それにより、加水分解性を向上させる、細胞壁内のジスルフィド結合を破壊するために、還元剤で細胞を処理することが重要である。
5. 30℃で10分間、細胞をインキュベート 穏やかに振盪しながら℃で。一方、細胞の1グラム当たり6ミリグラムザイモリアーゼを比較検討し、ザイモリアーゼバッファに一時停止。
6. 5分A用3000×gで遠心分離細胞Tの室温、上清を捨てる。
7. 細胞の0.15グラム当たり1ミリリットルザイモリアーゼバッファーでペレットを再懸濁します。ボルテックスを行います。
8. 水990μLでの細胞の10μlアリコートのOD _600を測定します。
9. β-1、3 - グルカン結合のグ....

結果

このプロトコルは、細胞質ゾルの構成要素からミトコンドリアを含む画分を分離することができます。その成功をテストする最良の方法は、別の単離段階からサ ​​ンプルにノーザン分析およびウエスタン分析（ 図1）を実行することです。アイソレーション特性のための3つのパラメータは、これらの分析に由来する。まず、サンプル中のRNAまたはタンパク質が無傷であるかどうか - これらは分析において明瞭なバンドとして検出されます。分解イベントは付加的な、より短いバンドまたはスメアの出現を誘導する。第二に、入力（ すなわち合計）からの信号と、各ステップからの信号を比較する準備中に紛失に関する重要な情報を提供しています。重度の損失は、合計した信号の相対量の間に有意な差として観察されるであろう。最後に、そして最も重要な、ミトコンドリア及び細胞質ゾル成分との間の分離の品質を決定することができる。そのままmitochondriの分離唯一のミトコンドリア画分中ではなく、細胞質画分（ 図1A）中のミトコンドリア転写転写産物のシグナルになります。さらに、ミトコンドリア関連しているタンパク質は.......

ディスカッション

画像内の科学技術の進歩は、mRNAの局在を研究するため、高解像度のツールが得られていた。今日、人はミリ秒時間スケール^23-26においても単一のmRNA分子の動きを測定することができる。しかし、上述のものなどの従来の生化学的アプローチもまた、有益であり、いくつかの場合に好適である。生化学的隔離はmRNAおよびタンパク質の大きなレパートリーの精製を可能にし、従って、ゲノムワイドな研究のために好ましい。単離において、一方はDNAマイクロアレイ又はRNA-seqの^18,27のいずれかによって、何千もの遺伝子の特徴付けを可能にするのに十分なmRNAレベルを得ることができる。並行して、一方がタンパク質を単離ミトコンドリア²⁸上プロテオームを特徴付けるためにプロテオーム解析を実行することができる。生化学的分画は、他の細胞小器官、特にER ²⁹からミトコンドリアを分離するように適合させることができる。これは、細胞の種類によっては有利であり得る高い空間的な重なりあったERおよびミトコンドリアの間で顕微鏡的局在解析を妨害する。生化学分画の重要な利点は、多くの異なるサンプ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酵母エキス
バクトペプトン
ガラクトー			クレーブしないでください ガラクトー
成長培地			ミトコンドリアの濃縮には、ガラクトースベースの成長培地 滅菌 1% 酵母エキス、2% バクトペプトン、2% ガラクトース
0.1 M Tris-HCl、pH 9.4	などの非発酵性炭素源を使用する必要があります
30 mM Tris-HCl、pH 7.6
ジチオスレイトール(DTT)
10 mM DTT バッファー			0.1 M TrisHCl pH 9.4、10 mM ジチオスレイトール(DTT)。毎回新鮮に
1.2 M ソルビトール
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μmフィルター
ザイモリアーゼバッファー			1.2 M ソルビトール、4 mM KH2PO4、16 mM K2HPO4.このバッファをフィルタリングします (0.2 μm)および将来の使用のために室温で保管
チモリアーゼ20T			20,000 U / g
回復培地			ガラクトースベースの増殖培地に1 Mソルビトール
0.1 mg / mlシクロヘキシミド(CHX)
0.6 Mマンニトール
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/mL ヘパリン
1 mM フェニルメタンスルホニルフッ化物 (PMSF)
マンニトール緩衝液			0.6 M マンニトール、30 mM Tris-HCl pH7.6、5 mM MgAc、100 mM KCl. 新たに追加:0.5 mg/mL ヘパリン、0.1 mg/ml CHX、1 mM (PMSF)。このバッファーをろ過し、氷冷
8 M グアニジニウム-HCl
100% および 70% エタノール (EtOH)
3 M 酢酸ナトリウム、pH 5.2
10 M LiCl ストック溶液
250 mM Tris HCl、pH 6.8
SDS
グリセロール
β-メルカプトエタノール
ブルー4x
LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8、8% SDS、40%グリセロール、20% β-メルカプトエタノール、および0.02%ブロモフェノールブルー
15mlの容量のホモジナイザー タイトフィット乳棒

ス オートス します した 、、、ブロモフェノールを装備