ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmRNA関連のアイソレーション

サマリー

ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAの多くはミトコンドリア外膜に関連している。私たちは、それに関連するmRNAおよびリボソームと酵母ミトコンドリアの分離を目的とした細胞下分画の手順が記載されている。このプロトコルは、mRNAの局在化およびミトコンドリア付近の局所的な翻訳の機構を明らかにするために、多様な条件下で増殖させた細胞に適用することができる。

要約

ミトコンドリアタンパク質の大部分は核内にエンコードされ、細胞小器官にインポートされる必要がある。タンパク質はミトコンドリアの近くに合成されている間、輸入が発生することがあります。この可能性のサポートは、ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAは、多くのミトコンドリア付近に局在することが示された最近の研究に由来する。一緒に外膜とのリボソーム協会の以前のデモで、これらの結果は、局所的な翻訳プロセスを示唆している。このような局所的な変換は、輸入の効率を向上させる独自の規制部位を提供し、異所性発現の例を最小にすることができる。多様な方法には​​、局所的な翻訳を媒介する因子および要素を特徴付けるために使用されてきた。これらの中で標準差動遠心分離によって細胞下分画である。このプロトコルは、単一の手順でのmRNA、リボソームとタンパク質の単離できるという利点がある。これらは、次いで、種々の分子と両性によって特徴付けることができるochemical方法。さらに、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクス法は、それによってゲノムワイドな洞察を可能にし、得られた材料に適用することができる。そのような研究のためのモデル生物としての酵母の使用は、速度、費用および単純性の利点を有する。さらに、高度な遺伝学的ツールおよび使用可能な削除株が候補因子の検証を容易にします。

概要

真核細胞は、特定の機能を有する個別のコンパートメントで構成されています。その機能を実現するためには、各区画には、その活性に必須であるタンパク質の固有のセットが含まれています。これらのタンパク質は、そのコンパートメントにアプローチを通して可能なメカニズムは、ローカライズ、翻訳^、1,2である。このプロセスにおいて、タンパク質は、そこに配置されるリボソームおよびmRNAにより目的地に合成される。ローカライズされた翻訳の可能性の利点の中で、タンパク質のターゲティングの効率を増加したタンパク質シャペロンの必要性が減少し、サイト固有の制御機構を可能にしています。また、ローカライズされたmRNAおよびリボソームは、一般的な翻訳が阻害される細胞ストレス、例に翻訳機構の人里離れた貯水池することができます。

ミトコンドリアは、近年ではローカライズされた翻訳を研究するための中心的なモデルとなりました。ほとんどのミトコンドリアタンパク質は、核内に符号化された細胞質ゾルに翻訳され、および細胞小器官にインポート。証拠の様々な線は、これらのタンパク質の多くは局所変換プロセスを介して産生されることを示している。最初に、電子顕微鏡および生化学的分画研究は、ミトコンドリア^3-5に関連したリボソームを検出しました。その後、共翻訳的に^6,7にのみインポートすることが判明した特定のmRNA上の仕事によってin vivoで裏付けられ、これらの研究。ミトコンドリアでのmRNAの関連のゲノムワイドな研究では、mRNAのかなりの部分がミトコンドリア近傍^8月10日に局在していることを明らかにした。これらのmRNAの一部はさらに、FISH又はMタグ^9,11などのインビボ蛍光法によって特徴付けした。この関連の直接的な解釈は、これらのmRNAは、ローカライズされた翻訳のための鋳型として作用するということです。

これらのmRNAは、ミトコンドリアに接近するメカニズムは不明である。非コード領域（最もsignificantlyの3 'のUTR）はミトコンドリア¹² mRNAの会合に関与することが示された。これらのドメインは、それらの輸送​​を媒介するRNA結合タンパク質に対する結合部位として機能する可能性がある。酵母での研究では、タンパク質のPUMファミリーのメンバー（Puf3）はミトコンドリア^8,13とmRNAの関連付けをサポートしていることを明らかにした。他の家族の機能に基づいておりPuf3、もっともらしい役割は、mRNAは、ルート ¹⁴ 途中である間の翻訳を抑制することである。従って、mRNAは、非コード領域と相互作用するRNA結合タンパク質によって、非翻訳状態で輸送することができる。あるいは、作業の大きな体は、タンパク質が合成されている間輸送が生じることを示唆している。特に、翻訳阻害剤は、mRNAの会合^8,13に影響^を与えること^が示された。さらに、このようなAUGをミトコンドリア標的化配列（MTS）またはORF領域として翻訳された特徴は、局在^8,11,15を補助することが示された。 HSP70ファミリータンパク質のCHミトコンドリア外膜上aperoneおよびタンパク質受容体はさらに符号化されたタンパク質の機能は、mRNAの局在¹⁶にとって重要であることを示唆し、mRNAの関連付けをサポートすることが示された。これは、リボソームタンパク質はミトコンドリア新興¹⁷へのmRNA-リボソーム-タンパク質複合体を標的化するための認識要素として機能するモデルと一致する。

ミトコンドリアの近くの局在化、翻訳電子顕微鏡（リボソームを可視化するため^{）3、FISH 9、（}特定のmRNAを検出するための）緑色RNA ¹¹と、生化学的分画（RNAおよびリボソームの両方を検出する^）10,18を含む様々な方法によって研究された。前者の方法は、インビボでの局在を検出し、トランスポート·ダイナミクスの可視化を可能にすることができるが、後者は単一の実験で多数の異なるmRNAの検出を可能にする。さらに、生化学的分画コードまたは非コードドメインの文献である必要はありませんteredは、したがって、それらの特定の役割を評価することができる。生化学的分画は正常に多くの異なる細胞区画の単離のために、長年にわたって使用されている。そのプリンシパルと制限は十分に確立され、人は簡単に様々な目的のために既存のプロトコルを変更することができます。必要な器具類は、したがって、それは通常、細胞内局在を研究するための選択の第一の方法で、多くのラボで標準です。私たちは、リボソームがミトコンドリアに関連しているながら、mRNAの単離のために最適化されたプロトコルを記述します。このプロトコルは、したがって、ミトコンドリアの近くに局在し、翻訳に関与する因子を研究するために最適である。

プロトコル

1。ミトコンドリア精製

細胞のペレットを計量。おおよそ0.6グラムを100mlの細胞から得られる。

1. 30で₆₀₀ = 1-1.5にOD酵母細胞100〜150ミリリットルの成長 ミトコンドリアを濃縮するために、このようなガラクトースベースの成長培地として非発酵増殖培地上℃、、。
2. 室温で5分間3000×gで遠心分離細胞、上清を捨てる。
3. 再び蒸留水と遠心でペレットを洗浄。上清を捨てる。
4. 細胞の0.5グラム当たり1ミリリットルのDTTバッファーでペレットを再懸濁します。それにより、加水分解性を向上させる、細胞壁内のジスルフィド結合を破壊するために、還元剤で細胞を処理することが重要である。
5. 30℃で10分間、細胞をインキュベート 穏やかに振盪しながら℃で。一方、細胞の1グラム当たり6ミリグラムザイモリアーゼを比較検討し、ザイモリアーゼバッファに一時停止。
6. 5分A用3000×gで遠心分離細胞Tの室温、上清を捨てる。
7. 細胞の0.15グラム当たり1ミリリットルザイモリアーゼバッファーでペレットを再懸濁します。ボルテックスを行います。
8. 水990μLでの細胞の10μlアリコートのOD _600を測定します。
9. β-1、3 - グルカン結合のグルコースポリマーを加水分解し、フェロプラストを生成する細胞にザイモリアーゼ（ステップ1.5）を追加します。この工程から、スフェロプラストは、溶解を避けるために等張溶液中に維持されるべきである。
10. 穏やかに振とうしながら30℃（ザイモリアーゼの最適活性のための）で15分間細胞をインキュベートします。細胞壁の加水分解およびフェロプラストの発生を確認するには、水を990μlの細胞を10μlを混ぜる。スフェロプラストは、浸透圧の差に溶解するために期待され、OD _600は、少なくとも、ステップ1.9で決定された値未満の10倍されるべきである。そうでない場合は、さらに15分間ザイモリアーゼとのインキュベーションを続ける。
11. 室温で5分間、3,000×gで遠心分離細胞。慎重にDISカード上清を、ペレットとして不安定になることがあります。
12. ザイモリアーゼBufferでフェロプラストを洗浄し、上清を捨てる。
13. 100ミリリットルの回復培地でフェロプラストを懸濁します。三角フラスコにフェロプラストを移し、30℃で1時間インキュベート 振とうしながら、Cを°。ザイモリアーゼ治療翻訳中に逮捕され、mRNAの局在が（ 図1B）破壊されたため、この回復手順が必要です。
14. 予備冷却50ミリリットルコニカルチューブに0.1 mg / mlのCHXおよび転送フェロプラストを追加します。 CHXの添加は、mRNAとリボソーム協会を凍結することが重要です。このように、ミトコンドリアとリボソーム依存mRNAの関連付けが維持されている。
15. 遠心機は、4℃で5分間3000×gでフェロプラスト、上清を捨てる。
16. 冷たいマンニトール緩衝液で2回洗浄します。
17. 4ミリリットル冷たいマンニトールBufferでフェロプラストを再懸濁し、タイトなフィットを搭載した15ミリリットルの容量のダウンスホモジナイザーに転送乳棒。優しく15ストロークでフェロプラストを破り、13ミリリットルチューブに溶解液を移す。
18. 核および破壊されていない細胞をペレット化し、4℃で6分間1500×gで溶解液を遠心分離する。
19. 慎重に新しいチューブに上清を移す。未分画サンプル（「合計」サンプル）として確保サンプルの1ミリリットル（25％）を設定します。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。 「合計」のサンプルの残りからの沈殿物のRNA（プロトコル3、RNAの沈殿を参照してください）​​。
20. 4時10分、10,000×gで上清を遠心分離 ミトコンドリアをペレット化°C。
21. 新しいチューブに上清（〜3ミリリットル）を転送し、氷の上に保管してください。これは、「細胞質」画分である。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。 「細胞質」は、試料の残りからの沈殿物のRNA（Protのを参照してください。ocol 3、RNA沈殿）。
22. 4℃で10分間万×gで再び3ミリリットルマンニトールバッファと遠心でペレットを洗浄
23. 3ミリリットルマンニトールバッファーでペレットを再懸濁します。このサンプルでは、ミトコンドリアが含まれ、「ミトコンドリア」画分と呼ぶ。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。

2。 RNA抽出

1. 8 MグアニジンHClおよび100％エタノールの2容積の各サンプル1ボリュームに追加。渦と-20℃で少なくとも2時間インキュベート ℃、
2. 4で20分間万×gで遠心分離サンプル ℃、上清を捨てる。ペレットが不安定になる可能性があるため注意が必要です。
3. 70％エタノールでペレットを洗浄。
4. RNaseフリー水400mlでペレットを再懸濁し、新しいエッペンドルフチュー​​ブに試料を移す。
5. 3 Mナトリウムacetatの0.1容量を追加することで、再びRNAを沈殿E pHは5.2〜100％エタノール2容量の。渦と-20℃で少なくとも2時間インキュベート ℃、
6. 4℃で20分間、20,000×gで遠心分離サンプル上清を捨て、70％エタノールで洗浄する。
7. 空気がペレットを乾燥し、RNaseフリー水で懸濁します。 -80で保存RNAサンプル ℃、試料は、ノーザン分析¹⁹またはマイクロアレイ分析^18（プロトコル3を参照）のために使用することができる。

3。マイクロアレイ解析のためのRNAの準備

1. RNaseフリー水650ミリリットルと歩調2.2からmRNAを懸濁します。
2. 積極的にクロロホルム（5:1、pHは4.7）とボルテックス：残留DNAまたはタンパク質を除去するために、等しい酸性フェノールの量（650ミリリットル）を追加します。 2分間最大速度で遠心分離する。
3. 新しいチューブに上相（水相）の500ミリリットルを転送します。それは、DNAが含まれているように、相間を取ることは避けてください。また、逆転写反応を阻害することができるフェノール、服用に注意してください。
4. RNAサンプルは、逆転写酵素の強力な阻害剤であるヘパリンの有意な量を含有する。このように、RT-PCRまたはマイクロアレイ標識のためにそれを除去する必要がある。塩化リチウム沈殿によりヘパリンを除去します。2 Mの最終濃度に塩化リチウムを追加し、-20℃で一晩サンプルをインキュベート ℃、
5. 4でサンプルを解凍 ℃〜4℃で20分間、20,000×gで遠心
6. 慎重に上清を廃棄し、80％エタノールでペレットを洗浄。ステップ3.5で説明したように再び遠心します。
7. 上清を捨て、空気乾燥およびRNaseフリー水150ミリリットル中にペレットを再懸濁します。
8. 任意の残留のLiClを除去するために、3 M酢酸ナトリウムpHが5.3体積の0.1〜100％エタノールを3倍量で再び沈殿させる。 -20でインキュベートする 少なくとも2時間、Cと°。
9. 4で20分間最高速度で遠心 ℃、 80％エタノール、空気乾燥で慎重に透明なペレットを洗浄。
10. 再懸濁を25mlのRNaseフリー水を用いてペレット化し、-80℃で試料を維持 ℃、
11. ^18,20で説明したRNA標識およびハイブリダイゼーションのための手順に従ってください。

結果

このプロトコルは、細胞質ゾルの構成要素からミトコンドリアを含む画分を分離することができます。その成功をテストする最良の方法は、別の単離段階からサ ​​ンプルにノーザン分析およびウエスタン分析（ 図1）を実行することです。アイソレーション特性のための3つのパラメータは、これらの分析に由来する。まず、サンプル中のRNAまたはタンパク質が無傷であるかどうか - これらは分析において明瞭なバンドとして検出されます。分解イベントは付加的な、より短いバンドまたはスメアの出現を誘導する。第二に、入力（ すなわち合計）からの信号と、各ステップからの信号を比較する準備中に紛失に関する重要な情報を提供しています。重度の損失は、合計した信号の相対量の間に有意な差として観察されるであろう。最後に、そして最も重要な、ミトコンドリア及び細胞質ゾル成分との間の分離の品質を決定することができる。そのままmitochondriの分離唯一のミトコンドリア画分中ではなく、細胞質画分（ 図1A）中のミトコンドリア転写転写産物のシグナルになります。さらに、ミトコンドリア関連しているタンパク質は...

ディスカッション

画像内の科学技術の進歩は、mRNAの局在を研究するため、高解像度のツールが得られていた。今日、人はミリ秒時間スケール^23-26においても単一のmRNA分子の動きを測定することができる。しかし、上述のものなどの従来の生化学的アプローチもまた、有益であり、いくつかの場合に好適である。生化学的隔離はmRNAおよびタンパク質の大きなレパートリーの精製を可能にし、従って、ゲノムワイドな研究のために好ましい。単離において、一方はDNAマイクロアレイ又はRNA-seqの^18,27のいずれかによって、何千もの遺伝子の特徴付けを可能にするのに十分なmRNAレベルを得ることができる。並行して、一方がタンパク質を単離ミトコンドリア²⁸上プロテオームを特徴付けるためにプロテオーム解析を実行することができる。生化学的分画は、他の細胞小器官、特にER ²⁹からミトコンドリアを分離するように適合させることができる。これは、細胞の種類によっては有利であり得る高い空間的な重なりあったERおよびミトコンドリアの間で顕微鏡的局在解析を妨害する。生化学分画の重要な利点は、多くの異なるサンプ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酵母エキス
バクトペプトン
ガラクトー			クレーブしないでください ガラクトー
成長培地			ミトコンドリアの濃縮には、ガラクトースベースの成長培地 滅菌 1% 酵母エキス、2% バクトペプトン、2% ガラクトース
0.1 M Tris-HCl、pH 9.4	などの非発酵性炭素源を使用する必要があります
30 mM Tris-HCl、pH 7.6
ジチオスレイトール(DTT)
10 mM DTT バッファー			0.1 M TrisHCl pH 9.4、10 mM ジチオスレイトール(DTT)。毎回新鮮に
1.2 M ソルビトール
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μmフィルター
ザイモリアーゼバッファー			1.2 M ソルビトール、4 mM KH2PO4、16 mM K2HPO4.このバッファをフィルタリングします (0.2 μm)および将来の使用のために室温で保管
チモリアーゼ20T			20,000 U / g
回復培地			ガラクトースベースの増殖培地に1 Mソルビトール
0.1 mg / mlシクロヘキシミド(CHX)
0.6 Mマンニトール
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/mL ヘパリン
1 mM フェニルメタンスルホニルフッ化物 (PMSF)
マンニトール緩衝液			0.6 M マンニトール、30 mM Tris-HCl pH7.6、5 mM MgAc、100 mM KCl. 新たに追加:0.5 mg/mL ヘパリン、0.1 mg/ml CHX、1 mM (PMSF)。このバッファーをろ過し、氷冷
8 M グアニジニウム-HCl
100% および 70% エタノール (EtOH)
3 M 酢酸ナトリウム、pH 5.2
10 M LiCl ストック溶液
250 mM Tris HCl、pH 6.8
SDS
グリセロール
β-メルカプトエタノール
ブルー4x
LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8、8% SDS、40%グリセロール、20% β-メルカプトエタノール、および0.02%ブロモフェノールブルー
15mlの容量のホモジナイザー タイトフィット乳棒