新生児軟膜表面エレクトロ

サマリー

軟膜表面はますます注目を受けているCNSにおけるユニークな前駆ゾーンです。ここで、我々の詳細を修飾エレクトロポレーション法を使用して、この前駆ゾーンの迅速な遺伝子操作のための方法。この手順は、細胞系統および細胞分化に関与するシグナル伝達経路の細胞および分子研究のために使用することができ、娘細胞の運命および特性を解明する。

要約

過去数年間で軟膜表面は損傷後を含め、胚周産期および成人の神経およびグリア発生時の重要性の胚ニッチとして同定されている。しかしながら、これらの遺伝的に前駆細胞集団に問い合わせ、それらの系統を追跡するための方法は、特異性またはウイルスの産生時間を消費がないため限定されていた。したがって、この領域での進歩はこの場所の調査のほんの一握りでは比較的遅れている。エレクトロポレーションは、胚の神経幹細胞の特性を研究し、より最近では生後脳におけるする十年間使用されている。ここでは、適合したエレクトロポレーション法に基づく軟膜表面前駆細胞の遺伝子操作のための、効率的で迅速な、かつ簡単な手法について説明します。軟膜表面エレクトロポレーションは、このようにこれらの細胞を研究するための時間の節約で経済的なアプローチを表す、これらの前駆細胞の容易な遺伝標識及び操作を可能にする。

概要

神経幹細胞および前駆細胞は、哺乳動物CNS ^1、2を通して存在している。その性質や脳と脊髄の心室領域を取り巻く胚および成体胚ゾーンの特性は、広範囲過去十年間^1-3に記載されています。大部分は、これは、このようなフロックス対立遺伝子または^4をトレースするレトロウイルス系統の神経系の特定のCre組換えとしてますます正確な遺伝的なツールの開発になっている。しかし、1前駆地域軟膜表面前駆ゾーンは、しているのはごく最近では詳細^5-7に説明され、総合的な検討を待ってさ。

脳の軟膜表面は、脳の表面と周囲の髄膜⁸との間のインタフェースとして定義される。後の開発、神経上皮と、中は、放射状グリアエンドフィートは、この表面^9,10に接続します。モミの一部人間の脳およびニューロンの多くの有糸分裂における番目のニューロンは、この領域¹¹において観察される。その後、胚の神経発生の間に、皮質ニューロンは、中間ゾーンおよび脳室下帯^12-14におけるそれらの遊走の経路に加えて、軟膜領域を横断することが知られている。この期間中に、幹細胞は、このゾーンから培養することができる、それは神経およびグリア⁵の活性部位であると思われる。成体の脳において、介在ニューロンは、低酸素チャレンジ⁷以下の軟膜表面前駆細胞から生まれることができることが報告されている。しかし、胚および生後発育中にgenensisに彼に、この領域の寄与は、特にこの領域^6を調査することの困難に一部あいまいなままである。上丘におよび大脳皮質において、表面的な（または皮質の層I）介在ニューロンは、下にある興奮性ニューロン集団の回路出力を変調するため、significを貢献するかもしれないこれらの構造の機能にantly。具体的には、レイヤ1介在ニューロンは、皮質の列^15,16の表層と深層に彼らの広範な接続性与えられた大脳皮質の上位層を通してニューロンの発火を調整するために主要な位置にある。同様に、水平ニューロンは、比較的広い面積にわたって皮質および網膜繊維、プロジェクトから興奮性入力を受信し、遠隔視覚刺激^17,18に応答ニューロン集団の阻害を媒介すると推測される。また、その形態は現像視覚系¹⁹におけるパターン化された波の活動に潜在的な役割を果たしてよく適している。興味深いことに、ニューロンの発達と成熟は、出生後大幅に起こります。また、この成熟過程は、神経活動によって調節されることが見出されているので、回路機能^20,21上の生涯結果を伴う発達可塑性の基板である。注目すべきことに、NOプロモーターは、特にトランスジェニックこれらの細胞を標的とすることができるが記載されている。除する前駆細胞は、レトロウイルス⁷でターゲティングすることができるが、ウイルス産生は時間がかかり、細胞形質導入のために必要な高い力価を得るために熟練を要する。

それが神経前駆細胞^4、22、23におけるシグナル伝達経路の迅速かつ効率的な遺伝的尋問を可能にするので、エレクトロポレーションは、神経発達の研究でルネサンスにつながっている。エレクトロポレーションは^、一方向⁴脳室^の周囲の増殖性前駆細胞にDNAを駆動するために、ヘッドの外部への電気パルスの送出に続いて、プラスミドDNAの注入を伴う^22、23。エレクトロポレーションは、プラスミドの導入遺伝子²⁴の発現のために細胞周期のM期を通過する細胞の通過を必要とするように見える。具体的には、それだけであることが見出されているプラスミドのエレクトロポレーションの8時間以内にM期を通過する細胞は、心室壁²⁴の〜160ミクロン内の全ての細胞への効果的な配信にもかかわらず、導入遺伝子を発現する。これは、核透過性を引き起こす化学物質が有糸分裂後の細胞²⁵内のプラスミドの発現を誘導することができるように、これは、エピソームプラスミドの核へのアクセスを可能に核膜破壊の必要性によるものであると推測される。もともと胚²²で用い、エレクトロポレーションは、ずっと後^26,27生後脳内での使用に適合した。最近では、軟膜表面前駆⁶の遺伝子操作で使用するためのエレクトロポレーションを適応している。また、このアプローチを使用して我々は、前駆体の二つの異なる系統がこの領域-介在ニューロンおよびアストロサイト⁶に明らかに存在することが示されている。このプロトコルは、尋問のためにこれらの細胞を標的とするために簡単、迅速、かつ強力な方法を詳述これらの細胞の発達を調節する機構の。

プロトコル

この手順では、ヒマラヤスギシナイ動物実験委員会の要求に従う。調べでは、前に進むための制度IACUCのコンプライアンスを確保する必要があります。すべてのツールと​​試薬は使用前に滅菌する必要があります。

1。ツールの作成、ソリューション、DNA混合物

1. マイクロピペットプラーに100 mmの火ポリッシュホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを挿入します。約17.5ミリメートルのピペットチップを形成するために、標準的な重み付きプルを可能にするために加熱を設定します。およそ直径100μmの開口部を作成するために、先端の先頭からの距離が約8〜9ミリメートルで鋭い外科ハサミで先端をカットします。
2. ドライファストグリーンで（20μmのシリンジフィルターを利用する）フィルタリングヌクレアーゼフリー水を混合することにより、高速な緑色溶液w / vの1％株式を作る。
3. トリス-EDTA（TE）緩衝液で希釈し、高度に濃縮されている精製されたエンドトキシンフリーのプラスミドDNA（ すなわち > 3μgの/μl）を、分離します。プラスミドの所望の量を追加します。混合物に、TE緩衝液で希釈し（ファストグリーン0.1重量/容量％の最終濃度にする）、1％ファストグリーン溶液の1:10の比を加える。導入遺伝子の強い発現のためのプラスミドの0.5〜2.0μgの/μLの最終濃度を使用してください。

2。動物麻酔、ピペットロード、軟膜表面プラスミドインジェクション

1. 5-8分（PUP年齢/体重に依存時間）、氷上に置かれたペトリ皿に配置して1〜2日出生後のマウスに低体温麻酔を誘導する。低体温は、つま先つまむ、および/または尾レフからの移動の欠如によって確認されると、マウスが注入される準備ができている。痛みの反射が明らかである場合は、氷の上に戻って動物を配置します。低体温症、注射、エレクトロポレーション手順がそれに応じて適切な麻酔を維持するための時間に、注射手順とエレクトロポレーションは、合計未満2〜3分かかる。
2. 麻酔中に、標準的なピペットを使用して、慎重にピペットplasmiの量を所望D参照のためにパラフィンワックスフィルム片の上に（0.5-2μl）を注入される混ぜる。ここでは、プラスミドミックス0.5μLの全容量が注入される。次に、マイクロインジェクターを用いて、慎重にプラスミド混合物を含むチューブ内に組み立てられたガラスキャピラリーピペットを挿入する。それは、チューブの端に触れていないことを確認することにより、破損、先端を防ぐために、余分な予防措置をとる。ゆっくりと移動ダイヤルを背面ダイヤルすることによりピペットに溶液を吸引除去する。十分なボリュームがピペットにロードされると、0ヘクトパスカルの中立位置に圧力が戻るまで前方に回します。
3. （2.2）からピペットパラフィンワックス膜基準噴射近くチップを配置しても軟膜表面/髄膜空間を充填するために適切な圧力を確保し、一方を排出するマイクロインジェクタからフットペダルを使用する注射用300〜450 hPaの圧力を用いてパラフィンワックス膜上にボリューム。イジェクト量は、以前にピペットでreferencに等しくなるまでそれに応じて圧力を調整Eのボリューム。
4. 先端が平衡化されており、麻酔が確認された後、仔を注入する準備ができている。
5. 実験の目的は、軟膜表面前駆細胞（ 図1A）内に下方DNAのエレクトロポレーションを可能にするために頭蓋下及び軟膜表面の上方プラスミド混合物を注入することである。皮質注射のために、あまり利き手の親指と人差し指を使って子犬を押したままにします。皮質半球など上丘など他の表面的な構造は、これらの構造（ 図1B）の容易なターゲティングを可能にP0とP2との間表示されます。皮質の利き手とターゲット所望の領域（等すなわちモーター、体性感覚）を用いて、脳動脈を避けるように注意しながら、皮膚や頭蓋骨を過ぎピペットを挿入します。 （ちょうど頭蓋骨を貫通した後に、さらに抵抗性の欠如によって示されます）頭蓋骨過去先端のさらなる浸透を防ぐようにしてください。
6. 血漿を注入IDソリューションマイクロインジェクタのフットペダルを使用して、組織（ 図2A）に均等に分散させることを確認してください。
   注意：これは、経験的に、流体圧力による血腫を回避しながら、プラスミド送達を最大化するアプローチを決定することは非常に重要である。これは、注入の持続時間、角度、体積、および血管破壊を回避するために正確な標的部位を調整することによって行うことができる。
7. 試してみて、パラフィン紙またはプラスチックパラフィンフィルム上に以前に行った注入からの試験液滴でチップを配置することによって、注射の間に乾燥するの先端を保つようにしてください。これは、チップと矛盾送達体積の目詰まりをもたらすことができる蒸発させ、結晶化DNA溶液の先端の蓄積を防止する必要がある。

3。エレクトロ

1. 各パルス間に950ミリ秒間隔で、50ミリ秒続く、5パルスの135から150 Vのエレクトロポを設定します。コンダクタンスを増加させるために、及び皮膚の燃焼を防止するため、電気穿孔ゲルで3 mmのプラチナtweezertrodesをカバーしています。麻酔を確実にするために、この時点でつま先つまんで尾反射神経をチェックしてください。応答性の場合、麻酔を数分間氷上に置きます。
2. 皮質（および上丘）注射のために、（ -脳室帯のエレクトロポレーションに使用され、10mmの電極7と比較して）仔の生存率を増加させるために3mmの電極（ 図2B）を使用する。注入された領域の上に電極と電極の向きが正中線（ 図2C）に45〜60°の角度であるように、目下の反対側の領域の周囲正に帯電したプローブの負に帯電したプローブを配置します。
3. 曲率を占めているときの電流をトリガーするエレクトロのフットペダルを使用して、効果的に基礎と軟膜表面の細胞にDNAを対象に、PUPの年齢と体重に応じて、3〜5パルスのための場所でtweezertrodesを開催半球の。
   注：負極のパルスまたは大きな電極がエレクトロポ面積を増加させるために使用することができる間に注入領域にわたって掃引することができる。
4. すぐにエレクトロポレーション後、慎重に子犬からゲルをきれいし、約5分間加熱ランプの下に配置します。
5. PUPは急性チアノーゼによるエレクトロポレーション後数分で、自然の赤みがかったピンクの色合いを失うことになる。それらのケージに戻す前に、自然な色と通常の移動の開始を回収するために子犬を観察します。
6. 彼女が戻って巣に子犬をもたらし、それらをグルーミング始まるかどうか観察することによって、母親と再社会化を確実にする。彼女は攻撃的になった場合、必ず子犬がゲルの残党があり、子犬に臭いを転送するための寝具のいくつかと、それらをインキュベートしないようにしてください。

上丘を標的とする4。変更

ターゲティング：

1. 麟蹄皮質と同じ方法で上丘CTが、対象領域がちょうど後方ラムダへとおよそ正中線（ 図3Aと図3B）の横にあることに注意してください。成功した注射で、プラスミドミックスが自然に上丘の輪郭を塗りつぶします。注射は正常に行われると、動物は、エレクトロポレーションの準備ができている。

エレクトロポレーション：

1. 非常によく似た方法で、上丘の注射のために、上丘の表面的な領域（ 図3C）にDNAを駆動し、注入されたエリアと目、鼻やあごの周りに正に帯電したプローブ上には、電極の負に帯電したプローブを配置。この場合、電極の向きは正中線に対して25〜40°の角度にある。

結果

細胞-主に前駆細胞-AT軟膜表面⁶またはそれに近い中でのプラスミドDNAの発現の軟膜表面のエレクトロポレーションの結果。具体的には、電極の向きは、プラスミドの動きとその後の発現の方向を口述において重要である。従って、二重電極構成において、プラスミドは、負と正電極との間のほぼ直線状ベクターに向けられる。負極が注射部位の上に配置し、正極、負極に腹ですしておけば、プラスミドが軟膜表面に強制されます。これは、面に垂直な電流ベクトルを生成するように電極を配向させることが最も理想的であると仮定される。適切な電極の向きと、より小さく、より局所的に標的化電極を用いて、生存率は100％である。しかしながら、このような脳などのいくつかの地域で、ケアは、心臓を停止することができる電流の送達を避けるように注意しなければならないので、コーEエレクトロポレーション仔マウスの生存率を低下させた。新しく記載トリ電極構成または他の修飾は、例えば、心拍数²⁸などの重要な機能に関与する構造を避けることによって、より困難領域を標的とするのを助けることができる。これは、動きや色によって明らかである彼らの自然な体温に適切な再温暖化の子犬...

ディスカッション

軟膜表面前駆細胞の正常なエレクトロポレーションのための最も重要な側面は、次のとおりです。1）軟膜表面にプラスミドミックスの標的; 2）注射部位における血腫の発生を回避すること;および3）中脳電気穿孔に関連した死亡率を回避する。

適切に標的化は、軟膜表面は軟膜表面の浸透を避けるために、頭蓋骨の測定と慎重なパンクチャリングすることによって達成される。覆っている皮膚または基礎心室もしくは脳実質に標的に不適切なのによって証明されます。そっとティッシュをこすりすると皮膚とのファストグリーン色素の1）の変位（ファストグリーンは、皮膚および結合組織中の頭蓋骨の上に局在しているIE）または2）ファストグリーン色素の消失によって脳内に、プラスミドミックスは心室および/または実質になったことを示す。プラスミドミックスの適切軟膜表面の局在は、頭蓋骨番目の下での色素の蓄積によって証明されるで穏やかに肌の変位によって妨害することはできません。それにもかかわらず、練習と器用さは、この成功を標的に必要です。血腫形成は可能性が高いプラスミド注射による血管系の破壊が原因で発生します。血餅は、組織が...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ファイヤーポリッシュホウケイ酸チューブ	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
マイクロピペットプーラー	サッター機器	P-30
ファストグリーンFCF	シグマ・アルドリッチ社	F7528
XenoWorks デジタルマイクロインジェクター	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	ハーバード装置、BTX装置Div	45-0052
3-mmプラチナピンセット	ハーバード装置、BTX装置Div	45-0487
SignaGel電極ゲル	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTAバッファー、pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
赤外線ヒートランプ	VWR36547-009
細かいはさみシャープ	ファインサイエンスツール	14060-09