方法論記事

3次元組織学ボリュームとマウス乳腺研究への応用再建

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DOI：

10.3791/51325

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2014年7月26日

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1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Platform Biological Sciences, Sunnybrook Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Physical Sciences, Sunnybrook Research Institute, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 6Manitoba Institute of Cell Biology, University of Manitoba

この記事について

サマリー

私たちは、細胞で構成されるマクロ構造のレベルで臓器の変化の研究を容易にする3次元(3D)組織学の体積再構成のための画像登録アプローチを提示します。このアプローチを用いて、野生型とIgfbp7欠損乳腺との間の3次元変化を研究した。

要約

組織学のボリューム再構成は、3D形状および細胞から構成されるマクロ構造のレベルで器官の体積変化の研究を容易にする。また、体積医療画像および療法における新規技術とアルゴリズムを調査し、検証するために使用することができます。異なる器官1,2,3の3D高解像度の地図帳を作成すると、組織学、ボリューム再構成の他のアプリケーションである。これは、組織の構造や様々な細胞機能の間の空間的関係を調査するためのリソースを提供しています。我々は、光blockface画像のセットを使用して組織学ボリューム再構成のための画像登録手法を提示する。再構築された組織学のボリュームには伝播された後処理登録エラーで処理された試料の信頼性の高い形状を表す。 2マウス乳房腺のヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色切片はEDから抽出された境界点を使用して、それに対応するblockface画像に登録されていた組織学およびblockface画像中の試験片のGES。レジストレーションの精度を目視で評価した。乳腺のマクロ構造の位置合わせは、視覚的にも高解像度で評価した。

この研究は、乳腺切除から3次元組織学ボリューム再構成に至るまで、この画像登録パイプラインの異なるステップの輪郭を描く。 2Dの組織学的画像は各項のペア間の構造的な違いを明らかにしながら、3次元組織像ボリュームは形状や乳腺の音量の違いを視覚化する機能を提供します。

概要

IGFBP7（結合タンパク質7インスリン様成長因子）はIGF結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、IGF1受容体4を結合することが示されている。異種移植片腫瘍モデルにおけるIGFBP7の再導入が大きくアポトーシスおよび細胞老化の誘導を介して7 6腫瘍増殖を阻害しながら、IGFBP7のダウンレギュレーションは、乳癌5における予後不良と相関することが知られている。 IGFPB7の影響を研究するために、IGFBP7ヌルマウスは5（未発表データ）を作成しました。これらのマウスが腫瘍を発症しないが、彼らは卵巣、筋肉および肝臓の組織像の変化だけでなく、乳腺の発達パターニング（未発表データ）の欠陥を示している。欠損マウスは、より小さなゴミの大きさを持っており、複数の大きな同腹仔（未発表データ）を維持することができないように欠陥のある表現型は、最初に示された。

組織学3Dボリュームは、有用なのinformatを提供する可能性を有しているボリュメトリック医用画像中の病理所見の定量および比較分析·評価するためのイオン。三次元共焦点、二光子顕微鏡法は、ローカル·エクステント14における腺の高解像度の細胞形態学的情報を提供することができるが、それは、ビューと深さの限られた視野を有する。組織学のボリュームの再構築がはるかに大きい空間範囲にわたってより多くの情報を提供しています。いくつかの....

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プロトコル

1。試料

  1. 3日間は、授乳の発症を投稿する野生型CDH1から外科的に乳腺だけでなく、IGFBP7欠損マウスを切り出す。
  2. ネイティブ乳腺形態を取り戻すためにガラススライド上に腺を広げた。

2。固定及び組織処理

  1. 4 Oで中性緩衝4％PFA O / N中の乳腺を修正しました。
  2. 組織処理前に70％エタノールでの腺に保管してください。
  3. 小さな組織処理カセットに腺を転送します。
  4. 自動化組織プロセッサを使用して組織を処理する
    1. 45分間、キシレン中で1時間及び2回、100％エタノール中で、45分間、95％エタノールで45分間、2回、3回、70％エタノールのエタノールおよびキシレン浴を増加させるに組織を脱水する。
    2. 印加圧力と真空中での1時間ごとに、パラフィン3回組織に浸透。
  5. ブロックを形成するためにパラフィンに組織を埋め込む、区画する。

3。組織学およびBlockfaceイメージング

  1. 過剰のパラフィンが除去されるまでロータリーミクロトームを用いてパラフィンブロックをトリミング。
  2. カセットに垂直なパラフィンブロックの少なくとも二つの隅部に1mmの孔を穿孔する垂直フライス盤を使....

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結果

従来の顕微鏡技術の落とし穴は、顕微鏡レベルで器官の理解は一度に一つの視野に限定されることである。スライド全体のセクションを提供しても「全開示」スライドを、三次元情報を提供することができない。スライド全体の開発、動的なスキャン技術を使用すると、そのセクション全体を参照する当社の能力が増加している、しかし、構造体を外挿すると、3次元組織学ボリューム再構成が必要になります。

より良いIGFBP7ヌルマウスの欠損を特徴づけるために、乳腺の3D再構成が授乳の3日後に開始を切除した腺上で実施した。 図1は、3D組織学の再構築のための提案されたアプローチのパイプラインを示しています。 blockface画像は、第一のパラフィンブロックの角に穴を使用して整列される。 図2A〜Bは、野生型およびIGFBP7ヌルmammのblockface容積を示すそれぞれ進の腺。組織学画像は、次いで、組織学ボリュームを再構成するために、それらの対応する整列blockface画像に登録されている。 図3A〜Bは、野生.......

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ディスカッション

本研究では、組織を歪める可能性があり、組織内の内部ランダムに選択されたランドマークまたは移植基準マーカを必要としないシリアル2D組織学的画像から三次元組織学ボリュームを再構成する画像レジストレーションのワークフローを開発した。記載の方法により、光学blockface画像自体は従来セクショニングを参照画像として使用される。我々は、blockface画像を位置合わせするのを助けるために、カメラの前でパラ​​フィンブロックの2D横方向の動きを補正するためにパラフィンブロックに穿孔された外部の穴を使用。 2Dの組織学的画像は、欠陥の連続切片をブロックから生じる場合にも、登録エラーの伝播を防止し、正確な組織学のボリュームを再構築するために、対応する2D blockface画像に整列している。組織のタイプおよび使用される組織学的染色のワークフローを独立させるために、境界点は、登録を実行するために使用される。この点は、ベースd個のアプローチは、より少ない計算上厳しいので、より良好な非常に大きなデジタル病理画像に対処することができるされていること（強度ベースの方法より）という利点を有する。

組織学.......

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開示事項

著者は開示するものは何もありません

謝辞

著者は、サニーブルック研究所のバイオマーカーイメージング研究所(BIRL)の組織学サービスに感謝したいと思います。この研究の支援は、テリー・フォックス財団、カナダ乳がん財団-プレーリー-NWT、およびCIHR助成金(#MOP-97996)によって提供されました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
16% PFAVWR International1571016% パラホルムアルデヒド溶液
小組織処理カセットVWR InternationalCA95029-956
Leica ASP300 自動組織処理装置Leica14047643515
100% EthanolFisher ScientificS25307B
XyleneVWR International CA95057-822
パラフィン サーモフィッシャー39501006パラプラスト組織包埋培地
ライカ EG 1160 包埋センターライカ
ライカロータリーミクロトームライカ
フライス盤アルゴ
マイクロスコープ スライドVWR インターナショナル CA48312-015
H&EステインVWRインターナショナル
オートマチックステイナー
カバースリップ VWRインターナショナル 48404-452
MEDITE RCM 7000 ガラスカバースリッパーMEDITE
Leica SCN400 スライドスキャナーLeica
MATLABMathWorks IncMATLAB 2007b開発ソフトウェア
MeVisLabMeVis Medical Solutions AGMeVisLab 2.13D 視覚化ソフトウェア

参考文献

  1. Sunkin, S. M., et al. Brain Atlas: An integrated spatiotemporal port for exploring the central nervous system. Nucleic Acids Research. 41, 996-1008 (2012).
  2. Shen, E. H., Overly, C. C., Jones, A. R. The Allen Huma....

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