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方法論記事

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

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DOI:

10.3791/51328

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2014年7月7日

 ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

この記事について

サマリー

ここでは、生きているゼブラフィッシュの胚の酸化ストレスを測定するためのプロトコルを報告します。この手順により、全胚組織と単一細胞集団の両方で活性酸素種(ROS)を検出できます。このプロトコルは、定性的分析と定量的分析の両方を実現します。

要約

活性酸素種（ROS）高レベルの酸化ストレス状態に向かって細胞の酸化還元状態の変化を引き起こすことがある。この状況は、分子（脂質、DNA、蛋白質）の酸化を引き起こし、細胞死に至る。酸化ストレスにも影響、糖尿病、網膜症、神経変性、および癌などのいくつかの病理学的状態の進行。これにより、単一細胞のレベルではなく、生物全体との関連においてのみならず、酸化ストレス状態を調査するためのツールを定義することが重要である。ここでは、そのような研究を行い、in vivoでの酸化ストレスを測定するためのプロトコルを提供するように、インビボ系において有用であるとゼブラフィッシュ胚を考える。 "i）の酸化ストレスの定性的測定のための「全胚ROS検出法」およびii）A：蛍光ROSプローブ及びゼブラフィッシュトランスジェニック蛍光線を利用して、我々は、 生体内で酸化ストレスを測定するための2つの異なる方法を開発単一細胞ROS酸化ストレスの定量的測定のための検出方法 "。ここで、我々は、酸化剤および生理学的または遺伝的方法によって、組織における酸化ストレスを増加させることによって、これらの手順の有効性を実証する。このプロトコルは、フォワード遺伝子スクリーニングのために適している、それはそのような神経疾患や癌などの酸化ストレスに関連する病状の動物モデルにおけるROSのアドレス因果関係を支援します。

概要

酸化ストレスは、特にアンバランス細胞のレドックス状態から生じる状態と定義される。日常の内側の細胞を発生する複雑な酸化還元反応は、細胞の酸化還元状態を決定する。酸化還元反応は、分子の還元および酸化を生産する生物学的分子の原子間の電子の移動で構成され、全ての化学反応（ すなわち酸化還元反応）で構成されています。これらの反応は極端な構造的な不安定性や近隣の生体分子と交換するアンバランスな電子の自然活性化を特徴としている電子的に活性種（ すなわち酸化促進種）によって触媒される。これらの不規則な反応は、DNA損傷、タンパク質カルボキシル化、および脂質酸化にもたらし、最終的に細胞死をもたらす1。酸化ストレスのレベルの増加は、加齢と異なる病態2の進行と関連している。酸化ストレスはあります糖尿病や心血管疾患3,4の血管の変化の原因であることが報告されて。それはまた、アルツハイマー病における神経変性に重要な役割を果たしており、パーキンソン病5。さらに、酸化ストレスは、癌の進行および転移性事象6,7を支配する重要な要因として実証されている。加えて、炎症および免疫応答を惹起し、さらに酸化ストレス8をサポートすることができる。

または窒素（RNS、反応性窒素種）、生きた細胞において、酸化促進種は、酸素（活性酸素種ROS）に由来する。 （OH）（O 2 - ）、過酸化水素（H 2 O 2）ROSは、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオンが挙げられる。主なRNSは亜酸化窒素（NO）である。二次反応種の一連のbetwee自発的相互作用によって生成することができるROS及びRNSまたはフリーの金属イオンが9 N。 H 2 O 2は、Fe 2 +、ヒドロキシルラジカルを生成すると反応しながら、 -例えば、スーパーオキシドアニオンはperoxynitrate（ONOO）を形成する亜酸化窒素と反応する。いくつかの生体分子と反応する能力のために、ROS及びRNSは、生理的な酸化還元状態10を維持するために危険な脅威と考えられている。酸化還元状態の細胞を維持するために抗酸化分子や酵素を解毒する一連のを完備しています。 11 -スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）は、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびペルオキシレドキシンは、本質的にH 2 O 2、OH及びOONO含む酸化促進種からの細胞の保護を提供する抗酸化酵素-武器を構成する。また、ビタミンCおよびE、ポリフェノールおよびコエンザイムQ10（コエンザイムQ10）のような抗酸化分子がROSとその危険な脱をクエンチする非常に重要である12,13 rivatives。しかし、ROS及びRNSの過剰産生、または抗酸化系における機能不全は、酸化ストレス14に向かって細胞の酸化還元状態に移行する。

彼らの否定的な意味合いのほかに、ROSは、異なる起源の細胞では、様々な生理的役割を再生することができます。細胞は通常、宿主防御および創傷修復の15〜17などの通常の生物学的事象を仲介するシグナル伝達分子として、ROSを生成する。反応種は、通常、シグナル伝達因子、成長因子、およびカルシウムレベル18,19の細胞内変動に応答してそのようなNOX（NADPHオキシダーゼ）およびXO（キサンチンオキシダーゼ）のような細胞内酵素により細胞内で産生される。これは、ROSを差動例えばATM-キナーゼなどのp53または細胞成分、DNA損傷に応答し20のマスター調節因子として重要な核因子の活性を調節し得ることが報告されている。同様にROSは強く目を媒介することによって細胞内シグナル伝達に影響を与える電子酸化及びシグナル伝達21の重要な調節因子として確立されているタンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）の不活性化。また、プロテオミクスベースの方法論は、RNSは、分子シグナリングの特定のタンパク質の修正および変更に責任があることを示している。 RNSは、S-nitrothiols（SNO）にそれらを変更し、このような炎症性疾患および自己免疫疾患などの病理学的状態22,23に付随する分子経路を誘発システインチオール基と反応する。

細胞培養実験は、部分的にのみインビボで作用する多数の因子を再現するので、動物モデル24,25レドックス研究を行うために非常に興味深い。これを達成するために、ゼブラフィッシュは、酸化ストレスのダイナミクス26を研究するために適切な脊椎動物動物モデルと考えられてきた。ゼブラフィッシュは、脊椎動物のDEV間、細胞および遺伝的事象を研究するいくつかの利点を付与する新たなモデル系であるelopmentと病気。胚の大きなクラスターが生成され、実験的なニーズのために毎週利用可能することができる。また、ゼブラフィッシュ胚の異常な光学的透明性だけでなく、その小さなサイズは、全生物27の単一細胞イメージングと動的トラッキングを可能にします。過去10年間では、ゼブラフィッシュ変異体の相当数は、癌や遺伝病28〜31のようなヒトの病的状態をモデル化するために生成されました。最も重要なことには、多数のトランスジェニック系統は、遺伝的および生物学的操作32の大規模な機会を可能にするように製造されている。例えば、トランスジェニック組織特異的なゼブラフィッシュ系統を定期的にin vivo研究のために利用される。これらの線は、インビボで単一細胞を同定する能力、ならびにそれらが含む解剖学的構造を提供する、選択されたプロモーターの制御下で蛍光タンパク質を発現する。

いくつかの毒物学的研究は、すでにTを使用していた彼は、創薬および酸化ストレス33-35のフィールドのための動物モデルとして、この脊椎動物の適合性を示唆し、酸化還元ホメオスタシスに対する化学物質のインビボ効果を評価するためにゼブラフィッシュ。いくつかの蛍光プローブは、ゼブラフィッシュの幼虫36,37における酸化ストレスを監視するために試験されているにもかかわらず、ゼブラフィッシュ組織および生体細胞内の酸化的ストレスのレベルを検出および測定するための確立されたアッセイは存在しない。ここでは、ゼブラフィッシュ胚の生細胞における酸化ストレスのin vivo定量化のための手順を記述している。イメージングツール、FACSソーティング、蛍光プローブおよび酸化促進条件が全てゼブラフィッシュ胚および組織中の酸化種の検出および定量のための単純な検定を生成するために組み合わされる。

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プロトコル

1。楽器の準備と作業溶液

  1. 魚の水溶液を調製する。蒸留水50ml中の海塩「インスタントオーシャン」の2グラムを溶解することにより保存溶液を作る。 （最終濃度60μg/ mlの海の塩）魚の水を使用する準備ができて準備する1リットルの蒸留水に株式魚の水の1.5ミリリットルを追加します。使用法の前に魚の水を使用する準備ができてオートクレーブ。この溶液を、ゼブラフィッシュ胚培地として使用される。
  2. 胚マウント用メチルセルロースを準備します。滅菌魚の水50ml中に1.5gのメチルセルロースを溶解する。撹拌プレート上の磁石を使用して、溶解を容易にする。粉末が完全に溶解し、数時間が必要な場合があります。小さなチューブに透明度と分量のためのソリューションをご確認ください。ヶ月間-20℃で保存し、使用時に一定分量を解凍する。使用する前に、5分間950×gでメチルセルロースを遠心分離する。一定分量の凍結融解は避けてください。
  3. トリカイン/エチル3 - アミノ安息香mを50mlの調製を水100mlにトリカイン200mgの溶解し、トリス-HCl、1M液（pH 9）を用いてpHを7.0に調整することによってエタンスルホン酸塩（原液）。以上30日間、4℃で、この株式を保管してください。注意：トリカインは有毒である。適切な取り扱いのガイドラインに従って使用してください。
  4. ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスを誘導する
    1. 一般的な酸化的ストレス誘導のための酸化剤溶液を調製する：H 2 O 2ストック溶液（過酸化水素;の100mM）を加えることにより、酸化剤溶液50mlを加え、魚の水。 2 mMおよび100μMの間の最終濃度のH 2 O 2を使用してください。直前の使用前に、この溶液を調製する。酸化剤溶液は、全載ROS検出および単一細胞ROS検出方法の両方に適用することができる。このソリューションを保管しないでください。注意：H 2 O 2は危険であり、吸入したり、飲み込むと有害。可燃性物質と接触すると火災の原因になります。ヒュームフードの下で処理し、適切な私信を着用onal保護具。
    2. ミトコンドリア由来の酸化的ストレス誘導のための酸化剤溶液を調製：ジメチルスルホキシド（DMSO）2mlにロテノン3.9mgの酸化剤を溶解することによってストック溶液（5ミリモル）を作る。暗所で室温でこの溶液を保管してください。
      1. 溶液を用いることができるようにするまでに、魚の水10ミリリットルにロテノン原液を溶解。 5〜50μMの濃度でロテノンを使用してください。 100μMのより高い濃度でロテノンを使用しないでください。適切な濃度で、この酸化剤溶液は、全載ROS検出および単一細胞ROS検出方法の両方に適用することができる。注意：ロテノンは有毒、有害である。適切な注意書きに従って処理します。
    3. ノックダウン遺伝子によって酸化ストレスを誘発：ゼブラフィッシュ胚におけるノックダウンnrf2a遺伝子発現モルホリノマイクロインジェクションによって以前にTimme-Laragy A. らによって報告され、2012年38。
    4. OXIDを誘導組織損傷後のストレスをative：以前ニートハンマーら 、2009年39に記載されているように72 HPFのゼブラフィッシュ胚のテールフィンで巻きマージンを生成します。
  5. 単一セルのROS検出方法のため、ROS検出溶液の5ミリリットルを準備します。
    1. 一般的なROS検出のためのソリューション：作業溶液（：2.5-10μM濃度範囲）を作製するために、HBSS（ハンクス平衡塩溶液）の汎用のROSに敏感な分子プローブを溶かす。このソリューションは、使用直前に準備する必要があります。
    2. ミトコンドリアによって誘導された特異的な検出のROSのためのソリューション：使用直前にDMSOを5 mMの原液を作ると、ミトコンドリアのROS感受性プローブ​​を溶かす。ワーキング溶液（：2.5-10μM濃度範囲）を調製するために、HBSS中のストック溶液に溶解する。
      注：ROS検出ワーキングソリューションとそれぞれのストック溶液の光と酸素曝露を避ける。使用して光からチューブを守るアルミホイル。格納またはHBSSに溶解し再利用プローブしないでください。月の-20℃で保存溶液を保管してください。
      注意：適切なガイドラインに従って、ヒュームフードの下で分子プローブ及びDMSOを処理します。
  6. ホールマウント、ROSの検出方法のため、ROS検出溶液の5ミリリットルを準備作業溶液（：2.5-5μM濃度範囲）を作製するために、HBSS中（DMSOに安定化された）の一般的なROS感受性プローブ​​原液を溶解する。光や酸素暴露を避ける。光からチューブを保護します。使用前に、この溶液を調製する。このソリューションを保存したり、再使用しないでください。注意：適切なガイドラインに従って、ヒュームフードの下に分子プローブを処理します。
  7. PBS 1Xの15ミリリットルにウシ胎児血清10ミリリットルを追加することにより、停止溶液25ミリリットルを加えます。滅菌溶液を保管してください。 4℃で、このソリューションを保存するROS検出法 - このソリューションは、単一のセルに必要とされる。
  8. 28 AT＆ゼブラフィッシュ空気インキュベーターを設定＃176;で
  9. 単一セルのROS検出法、4℃で遠心分離器を設定します。

2。成人魚の交配やゼブラフィッシュ胚の選択

  1. セットアップ大人のゼブラフィッシュのペアは、標準的なプロトコル40によると交差する。具体的な実験のニーズに応じた適切なトランスジェニック系統を選択します。
  2. 卵を収集し、魚の水/胚培地で90-mmディッシュに入れます。胚が開発し、目的の発達段階に成長するまで、28℃で卵を保つ（ 例えば 、48 HPF、72 HPF、HPF：時間後に受精）。
  3. 胚を開発するための画面が表示されます。すべての未受精卵または未発達の胚を除外します。
  4. 50ミリリットル魚の水にトリカインの1ミリリットル（ストック溶液）を添加することにより胚を麻酔。
  5. 実体顕微鏡下でのTg蛍光胚を選択します。

酸化剤エージェントと胚の3。治療

  1. 48時間の間に少なくとも30の胚を使うPFと異なる条件ごとに72 HPF。トリカインを除去するために、新鮮な魚の水で2回、胚を洗浄します。
  2. 3皿に蛍光胚を分割します。これ以上の30以上の胚/皿を置く。
  3. 洗浄溶液を除去し、対照溶液等の酸化剤溶液10ml又は魚10mlの水を加える。
  4. 28℃で1時間に10分間胚をインキュベートインキュベーション期間は、特定の組織において誘導される酸化的ストレスのレベルによって左右される。酸化ストレスの影響を受けた細胞が徐々に細胞死を受けるように短い期間は最高です。
  5. HBSSを含む新しい皿に胚を移し、回転させることによって胚を洗う。 28℃でのプレ暖かいHBSS

4。ホールマウントROS検出手法

  1. 酸化剤処理後の胚を収集し、小さな管には10以上の胚を置く。可能な限りHBSSで洗浄します。アルミ箔を使用した光からチューブを保護します。
  2. のため、ROS検出溶液の1ミリリットルを追加各チューブ。
  3. 光の露出を避けるために、28℃で15分間、暗所で胚を培養する。
  4. インキュベーション時間の間、全胚分析用のガラススライドを準備します。 「うつ病」スライドガラス上にメチルセルロースを300μlを入れ、ピペットチップでガラス面の上に敷い。メチルセルロースを放出しながら泡を避けてください。
  5. インキュベーション時間の終了時に、直ちにROS検出溶液を除去し、HBSS 2mlで二回洗浄する。チューブを数回転倒胚を洗浄します。ピペットまたはボルテックスしないでください。
  6. ガラスパスツールピペットに吸引胚まで。ピペットの開口部に近​​い、静かに位置胚をメチルセルロースにそれらを取り出す。細いナイロンラインと適切に胚を配向。
  7. 治療の胚と対照胚の蛍光を比較してください。すべての胚が同じものを使用して画像化されるように、別の方法として、蛍光実体顕微鏡や共焦点顕微鏡のパラメータを修正イメージングの設定。

5。単一細胞のROS-検出法

  1. 3.5：ステップから始める。各条件について、少なくとも35の胚を持っていることを確認します。
  2. 新しい皿に胚を移す。可能な限り魚の水を除去する。氷冷PBS 1Xの10ミリリットルを加え、プロテアーゼ阻害剤カクテル400μlの。手動鉗子で胚をdechorionate、細かい針で卵黄袋を取り外します。注意：卵黄袋を削除すると、次のFACS分析のためにクリーンなサンプルを保証します。このステップは、FACS装置によれば回避することができる。
  3. 転送デyolked 24穴マルチウェルプレートに胚（15胚/ウェル）は、すべての魚の水を除去する。
  4. 各ウェル中のHBSS300μL、30μlのコラゲナーゼP、50μlのトリプシン-EDTAを追加します。
  5. 優しく厳しいピペットチップ（1,000μL）を上下にピペッティングして胚を均質化する。
  6. 20分間28℃でインキュベートし、5分毎にピペッティングすることにより、サンプルを均質化する。
  7. 組織DISRを確認してください複合顕微鏡でのホモジネートのアリコートを観察することによってuption。ピペッティングにより単一細胞懸濁液を容易にする。 30分以上のための胚をインキュベートしないでください。
  8. 停止溶液200μlを添加して反応を停止させます。静かにピペッティングして混合します。
  9. タイトなボトムであらかじめ冷却チューブに細胞懸濁液を転送します。チューブを氷上に維持し、光の露出を避けてください。
  10. 4℃で250×gで5分間遠心
  11. 優しくピペッティングして氷冷HBSSで上相と再懸濁細胞を除去。
  12. 細胞をカウントして、あなたのすべてのサンプル中の細胞の数が同じであることを確認してください。未満2×10 6個の細胞を使用しないでください。
  13. 4℃で250×gで5分間遠心細胞
  14. 上清を除去し、ROS感受性プローブ​​を含む氷で冷やしたHBSS 1mlでペレットを中断。
  15. 暗闇の中で3分間室温で静置する。酸化ストレスのレベルに応じて、インキュベーション時間を変化させ、tに彼プローブの感度は。
  16. FACSチューブに細胞を移す。氷上でチューブを保持し、FACS分析の前に光の露出を避けてください。
  17. 蛍光活性化セルソーター（FACS）を用いて細胞をソートする。 Tgが組織蛍光（ 例えば 、GFP）及びROSの検出（ 例えば 、特定のミトコンドリアのROSに敏感なプローブ、一般的なROS敏感なプローブ）のために使用される分子プローブの励起/発光スペクトルに応じて設定波長。
  18. 各条件について、同じFACS設定を適用することによって、同じ実験セッション内のすべてのサンプルを測定します。異なる生物学的反復の平均値としての蛍光細胞の割合を計算します。各条件のための少なくとも2つの複製を分析する。

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結果

ここに記載された方法を適用することによって、我々は簡単にゼブラフィッシュ胚組織における酸化ストレス（ROS及びレベル）を測定し、検出することができる。大人のゼブラフィッシュを横断した後、卵を回収し、72時間後に受精（HPF）に28℃で開発することが許可されています。強い酸化促進試薬との胚の1）の処置または2）組織損傷後のROS形成を促進する酸化的ストレスを誘導するために、我々は2つ​​の異なるアプローチを提案する。

過酸化水素（H 2 O 2）、一般的な細胞性ROS形成剤として、およびロテノン、特定のミトコンドリアのROSドライバとして得た：最初のアプローチでは、特定のニーズに応じて二つの異なる試薬を用いる。ロテノンは規制緩和が酸化ストレス41の原因であるETCの複合体Iの阻害剤である。

第二のアプローチにおいて、我々は、ゼブラフィッシュ胚のテールフィンで創傷を作成することにより、ROSの蓄積を誘導し39。また、酸化ストレス条件がモルホリノ...

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ディスカッション

重要なステップ

本明細書に記載されるゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスを検出するための手順は、2つの異なる方法を含む。単一細胞ROS検出方法（ 図1）のより具体的な定量的測定を可能にしながら、ホールマウントROS検出方法は、主にROS検出のための定性的なアッセイである。どちらの方法も、ゼブラフィッシュ胚に、生体内のROS検出を評価するための迅速かつ簡単な方法を提供します。しかし、どちらも、いくつかの重要なステップを紹介します。

方法Iに関連する重要なステップ

ホールマウントROS検出するための第1の方法は容易に生きた胚（ 図2）の全ての組織における酸化ストレスを検出するために大きな利点を有する。胚組織に対するプローブの1）の透過性、2）プローブ毒性および3）番目：しかし考慮されなければならないとアッセイの結果に影響を与える可能性があります3の重要な重要な側面があります低ROS濃度に電子プローブ感度...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

マッシモ・サントロ研究室での

サポートは、HFSP、Marie Curie Action、Telethon、AIRCから来ています。原稿を批判的に読んでくださったDafne Gays氏とEmiliano Panieri氏に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
過酸化水素溶液SIGMA516813DO NOT STORE DILUITIONS
ハンクの平衡塩溶液 1xGIBCO14025
メチルセルロースSIGMAM0387
インスタントオーシャンアクアリウム 海塩混合物INSTANT OCEANSS15-10
TricaineSIGMAA5040
汎用 ROS 感受性プローブ: CellROX Deep Red ReagentINVITROGENC10422
ミトコンドリア特異的 ROS 感受性プローブ: MitoSOX INVITROGENM36008、1 つのバイアルを 13 μl DMSO
ヒドロエチジンINVITROGEND23107
ロテノンSIGMAR8875DMSO に 5 mM ストック溶液を調製します。 
ジメチルスルホキシドSIGMAD2650
VAS2870; 3-ベンジル-7-(2-ベンゾオキサゾリル)チオ-1,2,3-トリアゾロ(4,5-d)ピリミジンエンツォライフサイエンスBML-EI395粉末をDMSOに溶解します;魚水中の希釈石
ヨウ化プロピジウム Molecular probes
(Life Technologies)		P3566
7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD) Molecular probes
(Life Technologies)		A1310
Nrf2a MorpholinoGeneTools5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'Ref		: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413);小林et al.;2002 (PMID:12167159)
コラゲナーゼ PROCHE11213857001粉末を100 mg/mlで滅菌HBSSに溶解します。アリコートを-20°Cで保管します。C
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)GIBCO10010-056
ウシ胎児血清 GIBCO10082-147
完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠ROCHE1錠を1mlの水に溶かします
0.5% トリプシン-EDTA (10x)、フェノールレッドなしGIBCO15400-054使用前に1x作業溶液を準備し
複合顕微鏡 ZEISS
実体顕微鏡NikonAZ100
カメラZEISSAxioCamMRm
ソフトウェアZEISSZEN 2011
蛍光活性化セルソーターBD FACSCalibur
Centrifuge エッペンドルフ5417R
FACSチューブ BD342065
マルチウェルプレート BD Falcon353047
滅菌済み、未処理のペトリ皿 90 mmVWR391-1915
共焦点顕微鏡ライカSP5
ははます 蛍光照明付き 蛍光画像取得用

参考文献

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