ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

酸化ストレスは、特にアンバランス細胞のレドックス状態から生じる状態と定義される。日常の内側の細胞を発生する複雑な酸化還元反応は、細胞の酸化還元状態を決定する。酸化還元反応は、分子の還元および酸化を生産する生物学的分子の原子間の電子の移動で構成され、全ての化学反応（ すなわち酸化還元反応）で構成されています。これらの反応は極端な構造的な不安定性や近隣の生体分子と交換するアンバランスな電子の自然活性化を特徴としている電子的に活性種（ すなわち酸化促進種）によって触媒される。これらの不規則な反応は、DNA損傷、タンパク質カルボキシル化、および脂質酸化にもたらし、最終的に細胞死をもたらす^1。酸化ストレスのレベルの増加は、加齢と異なる病態²の進行と関連している。酸化ストレスはあります糖尿病や心血管疾患^3,4の血管の変化の原因であることが報告されて。それはまた、アルツハイマー病における神経変性に重要な役割を果たしており、パーキンソン病^5。さらに、酸化ストレスは、癌の進行および転移性事象^6,7を支配する重要な要因として実証されている。加えて、炎症および免疫応答を惹起し、さらに酸化ストレス^8をサポートすることができる。

または窒素（RNS、反応性窒素種）、生きた細胞において、酸化促進種は、酸素（活性酸素種ROS）に由来する。 ^（OH）（O ₂ ^{- ）、}過酸化水素（H ₂ O _2）ROSは、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオンが挙げられる。主なRNSは亜酸化窒素^（NO）である。二次反応種の一連のbetwee自発的相互作用によって生成することができるROS及びRNSまたはフリーの金属イオンが⁹ N。 H ₂ O _2は、Fe ^{2 +、}ヒドロキシルラジカルを生成すると反応しながら、 ^-例えば、スーパーオキシドアニオンはperoxynitrate（ONOO）を形成する亜酸化窒素と反応する。いくつかの生体分子と反応する能力のために、ROS及びRNSは、生理的な酸化還元状態¹⁰を維持するために危険な脅威と考えられている。酸化還元状態の細胞を維持するために抗酸化分子や酵素を解毒する一連のを完備しています。 ^{11 -}スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）は、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびペルオキシレドキシンは、本質的にH ₂ O _2、OH及びOONO含む酸化促進種からの細胞の保護を提供する抗酸化酵素-武器を構成する。また、ビタミンCおよびE、ポリフェノールおよびコエンザイムQ10（コエンザイムQ10）のような抗酸化分子がROSとその危険な脱をクエンチする非常に重要である^12,13 rivatives。しかし、ROS及びRNSの過剰産生、または抗酸化系における機能不全は、酸化ストレス¹⁴に向かって細胞の酸化還元状態に移行する。

彼らの否定的な意味合いのほかに、ROSは、異なる起源の細胞では、様々な生理的役割を再生することができます。細胞は通常、宿主防御および創傷修復の^15〜17などの通常の生物学的事象を仲介するシグナル伝達分子として、ROSを生成する。反応種は、通常、シグナル伝達因子、成長因子、およびカルシウムレベル^18,19の細胞内変動に応答してそのようなNOX（NADPHオキシダーゼ）およびXO（キサンチンオキシダーゼ）のような細胞内酵素により細胞内で産生される。これは、ROSを差動例えばATM-キナーゼなどのp53または細胞成分、DNA損傷に応答し²⁰のマスター調節因子として重要な核因子の活性を調節し得ることが報告されている。同様にROSは強く目を媒介することによって細胞内シグナル伝達に影響を与える電子酸化及びシグナル伝達²¹の重要な調節因子として確立されているタンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）の不活性化。また、プロテオミクスベースの方法論は、RNSは、分子シグナリングの特定のタンパク質の修正および変更に責任があることを示している。 RNSは、S-nitrothiols（SNO）にそれらを変更し、このような炎症性疾患および自己免疫疾患などの病理学的状態^22,23に付随する分子経路を誘発システインチオール基と反応する。

細胞培養実験は、部分的にのみインビボで作用する多数の因子を再現するので、動物モデル^24,25レドックス研究を行うために非常に興味深い。これを達成するために、ゼブラフィッシュは、酸化ストレスのダイナミクス^26を研究するために適切な脊椎動物動物モデルと考えられてきた。ゼブラフィッシュは、脊椎動物のDEV間、細胞および遺伝的事象を研究するいくつかの利点を付与する新たなモデル系であるelopmentと病気。胚の大きなクラスターが生成され、実験的なニーズのために毎週利用可能することができる。また、ゼブラフィッシュ胚の異常な光学的透明性だけでなく、その小さなサイズは、全生物²⁷の単一細胞イメージングと動的トラッキングを可能にします。過去10年間では、ゼブラフィッシュ変異体の相当数は、癌や遺伝病^28〜31のようなヒトの病的状態をモデル化するために生成されました。最も重要なことには、多数のトランスジェニック系統は、遺伝的および生物学的操作³²の大規模な機会を可能にするように製造されている。例えば、トランスジェニック組織特異的なゼブラフィッシュ系統を定期的にin vivo研究のために利用される。これらの線は、インビボで単一細胞を同定する能力、ならびにそれらが含む解剖学的構造を提供する、選択されたプロモーターの制御下で蛍光タンパク質を発現する。

いくつかの毒物学的研究は、すでにTを使用していた彼は、創薬および酸化ストレス^33-35のフィールドのための動物モデルとして、この脊椎動物の適合性を示唆し、酸化還元ホメオスタシスに対する化学物質のインビボ効果を評価するためにゼブラフィッシュ。いくつかの蛍光プローブは、ゼブラフィッシュの幼虫^36,37における酸化ストレスを監視するために試験されているにもかかわらず、ゼブラフィッシュ組織および生体細胞内の酸化的ストレスのレベルを検出および測定するための確立されたアッセイは存在しない。ここでは、ゼブラフィッシュ胚の生細胞における酸化ストレスのin vivo定量化のための手順を記述している。イメージングツール、FACSソーティング、蛍光プローブおよび酸化促進条件が全てゼブラフィッシュ胚および組織中の酸化種の検出および定量のための単純な検定を生成するために組み合わされる。

1。楽器の準備と作業溶液

1. 魚の水溶液を調製する。蒸留水50ml中の海塩「インスタントオーシャン」の2グラムを溶解することにより保存溶液を作る。 （最終濃度60μg/ mlの海の塩）魚の水を使用する準備ができて準備する1リットルの蒸留水に株式魚の水の1.5ミリリットルを追加します。使用法の前に魚の水を使用する準備ができてオートクレーブ。この溶液を、ゼブラフィッシュ胚培地として使用される。
2. 胚マウント用メチルセルロースを準備します。滅菌魚の水50ml中に1.5gのメチルセルロースを溶解する。撹拌プレート上の磁石を使用して、溶解を容易にする。粉末が完全に溶解し、数時間が必要な場合があります。小さなチューブに透明度と分量のためのソリューションをご確認ください。ヶ月間-20℃で保存し、使用時に一定分量を解凍する。使用する前に、5分間950×gでメチルセルロースを遠心分離する。一定分量の凍結融解は避けてください。
3. トリカイン/エチル3 - アミノ安息香mを50mlの調製を水100mlにトリカイン200mgの溶解し、トリス-HCl、1M液（pH 9）を用いてpHを7.0に調整することによってエタンスルホン酸塩（原液）。以上30日間、4℃で、この株式を保管してください。注意：トリカインは有毒である。適切な取り扱いのガイドラインに従って使用してください。
4. ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスを誘導する
   1. 一般的な酸化的ストレス誘導のための酸化剤溶液を調製する：H ₂ O ₂ストック溶液（過酸化水素;の100mM）を加えることにより、酸化剤溶液50mlを加え、魚の水。 2 mMおよび100μMの間の最終濃度のH ₂ O _2を使用してください。直前の使用前に、この溶液を調製する。酸化剤溶液は、全載ROS検出および単一細胞ROS検出方法の両方に適用することができる。このソリューションを保管しないでください。注意：H ₂ O _2は危険であり、吸入したり、飲み込むと有害。可燃性物質と接触すると火災の原因になります。ヒュームフードの下で処理し、適切な私信を着用onal保護具。
   2. ミトコンドリア由来の酸化的ストレス誘導のための酸化剤溶液を調製：ジメチルスルホキシド（DMSO）2mlにロテノン3.9mgの酸化剤を溶解することによってストック溶液（5ミリモル）を作る。暗所で室温でこの溶液を保管してください。
      1. 溶液を用いることができるようにするまでに、魚の水10ミリリットルにロテノン原液を溶解。 5〜50μMの濃度でロテノンを使用してください。 100μMのより高い濃度でロテノンを使用しないでください。適切な濃度で、この酸化剤溶液は、全載ROS検出および単一細胞ROS検出方法の両方に適用することができる。注意：ロテノンは有毒、有害である。適切な注意書きに従って処理します。
   3. ノックダウン遺伝子によって酸化ストレスを誘発：ゼブラフィッシュ胚におけるノックダウンnrf2a遺伝子発現モルホリノマイクロインジェクションによって以前にTimme-Laragy A. らによって報告され、2012年^38。
   4. OXIDを誘導組織損傷後のストレスをative：以前ニートハンマーら 、2009年³⁹に記載されているように72 HPFのゼブラフィッシュ胚のテールフィンで巻きマージンを生成します。
5. 単一セルのROS検出方法のため、ROS検出溶液の5ミリリットルを準備します。
   1. 一般的なROS検出のためのソリューション：作業溶液（：2.5-10μM濃度範囲）を作製するために、HBSS（ハンクス平衡塩溶液）の汎用のROSに敏感な分子プローブを溶かす。このソリューションは、使用直前に準備する必要があります。
   2. ミトコンドリアによって誘導された特異的な検出のROSのためのソリューション：使用直前にDMSOを5 mMの原液を作ると、ミトコンドリアのROS感受性プローブ​​を溶かす。ワーキング溶液（：2.5-10μM濃度範囲）を調製するために、HBSS中のストック溶液に溶解する。
      注：ROS検出ワーキングソリューションとそれぞれのストック溶液の光と酸素曝露を避ける。使用して光からチューブを守るアルミホイル。格納またはHBSSに溶解し再利用プローブしないでください。月の-20℃で保存溶液を保管してください。
      注意：適切なガイドラインに従って、ヒュームフードの下で分子プローブ及びDMSOを処理します。
6. ホールマウント、ROSの検出方法のため、ROS検出溶液の5ミリリットルを準備作業溶液（：2.5-5μM濃度範囲）を作製するために、HBSS中（DMSOに安定化された）の一般的なROS感受性プローブ​​原液を溶解する。光や酸素暴露を避ける。光からチューブを保護します。使用前に、この溶液を調製する。このソリューションを保存したり、再使用しないでください。注意：適切なガイドラインに従って、ヒュームフードの下に分子プローブを処理します。
7. PBS 1Xの15ミリリットルにウシ胎児血清10ミリリットルを追加することにより、停止溶液25ミリリットルを加えます。滅菌溶液を保管してください。 4℃で、このソリューションを保存するROS検出法 - このソリューションは、単一のセルに必要とされる。
8. 28 AT＆ゼブラフィッシュ空気インキュベーターを設定＃176;で
9. 単一セルのROS検出法、4℃で遠心分離器を設定します。

2。成人魚の交配やゼブラフィッシュ胚の選択

1. セットアップ大人のゼブラフィッシュのペアは、標準的なプロトコル⁴⁰によると交差する。具体的な実験のニーズに応じた適切なトランスジェニック系統を選択します。
2. 卵を収集し、魚の水/胚培地で90-mmディッシュに入れます。胚が開発し、目的の発達段階に成長するまで、28℃で卵を保つ（ 例えば 、48 HPF、72 HPF、HPF：時間後に受精）。
3. 胚を開発するための画面が表示されます。すべての未受精卵または未発達の胚を除外します。
4. 50ミリリットル魚の水にトリカインの1ミリリットル（ストック溶液）を添加することにより胚を麻酔。
5. 実体顕微鏡下でのTg蛍光胚を選択します。

酸化剤エージェントと胚の3。治療

1. 48時間の間に少なくとも30の胚を使うPFと異なる条件ごとに72 HPF。トリカインを除去するために、新鮮な魚の水で2回、胚を洗浄します。
2. 3皿に蛍光胚を分割します。これ以上の30以上の胚/皿を置く。
3. 洗浄溶液を除去し、対照溶液等の酸化剤溶液10ml又は魚10mlの水を加える。
4. 28℃で1時間に10分間胚をインキュベートインキュベーション期間は、特定の組織において誘導される酸化的ストレスのレベルによって左右される。酸化ストレスの影響を受けた細胞が徐々に細胞死を受けるように短い期間は最高です。
5. HBSSを含む新しい皿に胚を移し、回転させることによって胚を洗う。 28℃でのプレ暖かいHBSS

4。ホールマウントROS検出手法

1. 酸化剤処理後の胚を収集し、小さな管には10以上の胚を置く。可能な限りHBSSで洗浄します。アルミ箔を使用した光からチューブを保護します。
2. のため、ROS検出溶液の1ミリリットルを追加各チューブ。
3. 光の露出を避けるために、28℃で15分間、暗所で胚を培養する。
4. インキュベーション時間の間、全胚分析用のガラススライドを準備します。 「うつ病」スライドガラス上にメチルセルロースを300μlを入れ、ピペットチップでガラス面の上に敷い。メチルセルロースを放出しながら泡を避けてください。
5. インキュベーション時間の終了時に、直ちにROS検出溶液を除去し、HBSS 2mlで二回洗浄する。チューブを数回転倒胚を洗浄します。ピペットまたはボルテックスしないでください。
6. ガラスパスツールピペットに吸引胚まで。ピペットの開口部に近​​い、静かに位置胚をメチルセルロースにそれらを取り出す。細いナイロンラインと適切に胚を配向。
7. 治療の胚と対照胚の蛍光を比較してください。すべての胚が同じものを使用して画像化されるように、別の方法として、蛍光実体顕微鏡や共焦点顕微鏡のパラメータを修正イメージングの設定。

5。単一細胞のROS-検出法

1. 3.5：ステップから始める。各条件について、少なくとも35の胚を持っていることを確認します。
2. 新しい皿に胚を移す。可能な限り魚の水を除去する。氷冷PBS 1Xの10ミリリットルを加え、プロテアーゼ阻害剤カクテル400μlの。手動鉗子で胚をdechorionate、細かい針で卵黄袋を取り外します。注意：卵黄袋を削除すると、次のFACS分析のためにクリーンなサンプルを保証します。このステップは、FACS装置によれば回避することができる。
3. 転送デyolked 24穴マルチウェルプレートに胚（15胚/ウェル）は、すべての魚の水を除去する。
4. 各ウェル中のHBSS300μL、30μlのコラゲナーゼP、50μlのトリプシン-EDTAを追加します。
5. 優しく厳しいピペットチップ（1,000μL）を上下にピペッティングして胚を均質化する。
6. 20分間28℃でインキュベートし、5分毎にピペッティングすることにより、サンプルを均質化する。
7. 組織DISRを確認してください複合顕微鏡でのホモジネートのアリコートを観察することによってuption。ピペッティングにより単一細胞懸濁液を容易にする。 30分以上のための胚をインキュベートしないでください。
8. 停止溶液200μlを添加して反応を停止させます。静かにピペッティングして混合します。
9. タイトなボトムであらかじめ冷却チューブに細胞懸濁液を転送します。チューブを氷上に維持し、光の露出を避けてください。
10. 4℃で250×gで5分間遠心
11. 優しくピペッティングして氷冷HBSSで上相と再懸濁細胞を除去。
12. 細胞をカウントして、あなたのすべてのサンプル中の細胞の数が同じであることを確認してください。未満2×10 ^6個の細胞を使用しないでください。
13. 4℃で250×gで5分間遠心細胞
14. 上清を除去し、ROS感受性プローブ​​を含む氷で冷やしたHBSS 1mlでペレットを中断。
15. 暗闇の中で3分間室温で静置する。酸化ストレスのレベルに応じて、インキュベーション時間を変化させ、tに彼プローブの感度は。
16. FACSチューブに細胞を移す。氷上でチューブを保持し、FACS分析の前に光の露出を避けてください。
17. 蛍光活性化セルソーター（FACS）を用いて細胞をソートする。 Tgが組織蛍光（ 例えば 、GFP）及びROSの検出（ 例えば 、特定のミトコンドリアのROSに敏感なプローブ、一般的なROS敏感なプローブ）のために使用される分子プローブの励起/発光スペクトルに応じて設定波長。
18. 各条件について、同じFACS設定を適用することによって、同じ実験セッション内のすべてのサンプルを測定します。異なる生物学的反復の平均値としての蛍光細胞の割合を計算します。各条件のための少なくとも2つの複製を分析する。

ここに記載された方法を適用することによって、我々は簡単にゼブラフィッシュ胚組織における酸化ストレス（ROS及びレベル）を測定し、検出することができる。大人のゼブラフィッシュを横断した後、卵を回収し、72時間後に受精（HPF）に28℃で開発することが許可されています。強い酸化促進試薬との胚の1）の処置または2）組織損傷後のROS形成を促進する酸化的ストレスを誘導するために、我々は2つ​​の異なるアプローチを提案する。

過酸化水素（H 2 O 2）、一般的な細胞性ROS形成剤として、およびロテノン、特定のミトコンドリアのROSドライバとして得た：最初のアプローチでは、特定のニーズに応じて二つの異なる試薬を用いる。ロテノンは規制緩和が酸化ストレス41の原因であるETCの複合体Iの阻害剤である。

第二のアプローチにおいて、我々は、ゼブラフィッシュ胚のテールフィンで創傷を作成することにより、ROSの蓄積を誘導し39。また、酸化ストレス条件がモルホリノ注入と酸化ストレス38の細胞毒性効果に対する一次細胞の防御であるNrf2の抗酸化応答経路をノックダウンすることにより、ゼブラフィッシュの組織において促進することができる。

酸化ストレスは、ゼブラフィッシュ胚において誘導されると、活性酸素種（ROS）の蓄積は、蛍光活性化時（ すなわち酸化）になるジェネリックまたはミトコンドリアROS特異的に敏感なプローブを用いて測定することができる。

処理された胚は、ホールマウントROS検出法を用いて、または図1にまとめたように単一細胞-ROS検出方法を適用することによって分析することができる。方法の間の選択は、酸化ストレスの定性的又は定量的測定を実行する必要性に依存している。両方の方法の代表的な結果を図2に表されている図3。

ホールマウント、ROSの検出方法

図2は、酸化ストレスのin vivoイメージングのためのホールマウントROS検出方法の適用を示す。特に、この方法は、外因性のプロオキシダントの処置ならびに創傷傷害または遺伝子欠失などのより生理的条件により生成された「低」酸化ストレスによって生成された「強い」酸化ストレスの両方に追従するために適用されている。

酸化種の生理的レベルは72 HPFでのライブゼブラフィッシュ胚のテールフィンのマイクロ傷害またはワイド傷を発生させることによって誘導される。これは、損傷後、H 2 O 2は創傷後の39創縁20分で蓄積することが実証されている。創縁における酸化ストレスの蓄積を可視化するために、胚は、汎用と共にインキュベートしたROS感受性プローブと39が負傷した後20分で画像化した。負傷した尾で無傷尾翼を比較することにより、創傷の縁（ 図2A）で蛍光プローブの蓄 ​​積を区別することが可能である。非特異的な弱い蛍光信号が、すべての両方の条件でテールフィンの周囲の組織が検出される。

創傷マージンで、ROS感受性プローブの特異的蓄積を検証するために、傷のH 2 O 2濃度は、薬理学的なアプローチによって下げられている。それは創傷マージンH 2 O 2を蓄積DUOX -阻害剤VAS2870 39に非常に敏感であることが実証されているため、胚は創傷前に、この阻害剤で前処理した。 ROS感受性プローブの蛍光と比較し、VAS前処理された胚およびそれぞれの対照から、信号はROSの蓄積（ すなわち、H 2 O 2に依存することを示す）（ 図2B）。

加えて、我々はゼブラフィッシュ胚ロテノンで処理することにより、ゼブラフィッシュ組織における酸化種の高いレベルを生成した。ロテノンで処理した胚およびコントロールは特にROS種を検出する一般的なROS感受性プローブ​​と共にインキュベートした。その後、プローブを洗浄除去した胚は、蛍光実体顕微鏡下で画像化した。酸化ストレスは、胚（ 図2C）の全身で検出された。高倍率画像は、プローブが正常に代謝される解剖学的領域（ 図2D）を示す。蛍光画像（下のパネル）はROS陽性細胞を示し、一方、明視野像（上のパネル）は、解剖学的構造を区別する。蛍光画像により示されるような結果は、主に、処理された胚での制御とを比較することによって達成される酸化ストレスの検出、の定性的報告されている。

単細胞-ROS検出方法

単一細胞ROS検出方法を適用することにより、図3のレポートの代表的FACSプロットおよび酸化ストレスの定量化。この方法では、図の説明において、詳細なプロトコルの報告のように酸化促進条件に供されたゼブラフィッシュ細胞中の酸化ストレスレベルを測定するように適合されている。上述したように、酸化ストレスは、ROS敏感な分子プローブを有する単一の細胞に解離ゼブラフィッシュ組織をインキュベートすることによって測定された。解離手順およびFACS自体が細胞の損傷を引き起こす可能性があるので、試料の分析は、「生細胞」は、酸化ストレスの定量のために考慮されることを必要とする。したがって、解離した細胞を「生細胞」は、物理的パラメータ（ 図3A）を示す細胞の画分を選択することにより、および（ 図3B）死細胞を除外することによって分析される。従って、サンプルは定量するために酸化的ストレスレベルROS感受性プローブの蛍光に従って、そのようなGFP（ 図3C）が陽性などの内因性蛍光を示す。 ROS感受性プローブの陰性対照試料は、取り扱いおよび技術手順によって誘発される酸化ストレスを評価するために含まれるべきである（ 図3Cと 、パネル：コントロール- ）。相対的なFACSプロットの定量化は、さまざまな生物学的複製（ 図3D-E）の測定結果を示すヒストグラムで実証。

過酸化水素処理時の酸化ストレスレベルの定量化に加えて、この方法は、nrf2aのモルファントとそれぞれの対照（ 図3F）中のボランティアは、生理学的条件内の酸化ストレスレベルを定量するために適用されている。

さらに、ミトコンドリアのような特定の問い合わせRO-ROS感受性プローブ​​を用いて単一細胞ROS検出方法を組み合わせることによりS-感受性プローブは、特定のミトコンドリア標的化酸化促進処理（ 図3G）の文脈における酸化ストレスを測定することも可能である。

図1。ゼブラフィッシュ胚におけるROSレベルを測定するための方法の概略図。ゼブラ大人は、適切な飼育槽に交差している。受精卵は、その後、胚が完全に開発できるように皿に採取し、28℃で保存する。酸化ストレスの誘導は、薬学的処置により、または遺伝的または物理的な傷害のいずれかによって、異なる方法で達成することができる。あるいは、遺伝的変異体を解析する場合には、このインキュベーションをスキップして前進することができる。この時点で、2つの異なる方法に従って進めることができる。「全メートルによるount ROS検出」方法は、（左）、ゼブラフィッシュ胚を直ちに蛍光ROS感受性プローブ​​（1）、次いで、蛍光または共焦点顕微鏡（2）で分析と共にインキュベートする。 「単セルROS検出」法（右）において、ゼブラフィッシュ胚は、（1）、蛍光ROS感受性プローブ​​（2）と共にインキュベートし、蛍光検出および定量（3）のためにFACSによって分析し、単一細胞に解離される。 「ホールマウント-ROS検出」メソッドは、主に定性分析、定性および酸化的ストレスレベルの定量的測定の両方「単一セルベース」方式の助成金として生きている胚における酸化ストレスの検出を可能にする一方。

72ゼブラで図2ホールマウント-ROS検出方法の代表的な結果。A）ゼブラフィッシュ胚を供した以前らニートハンマーに記載されているように負傷した。、2009年39代表の共焦点画像が負傷尾びれの傷の縁に酸化促進種（ROS）の蓄積（矢印）を示している。酸化種は、一般的なROSプローブで検出されている（CellROX; 2.5μM）を20分後に創傷がなされている。スケールバーは20μm。B）72 HPFでゼブラフィッシュ胚の創傷の縁を示す代表的な共焦点画像。創傷がなされた前胚を90分間VAS2870（20μM）またはDMSOで前処理した。傷後20分、ROSは、一般的なROS感受性プローブ​​（2.5μMCellROX）で検出されている。ゼブラフィッシュ胚でロテノン誘発される酸化ストレスを示すスケールバーは20μm。C）全身像。パネルDに示すように酸化ストレスが強く）胚の尾部領域で検出される。ロテノンは、主にskelディレクトリに影響するミトコンドリアETCの強力な阻害剤であるゼブラフィッシュにおけるETAL筋細胞。スケールバー、180程度である。

図3単一細胞ROS検出方法の代表的な結果。A）ゼブラフィッシュ胚の典型的なサンプルを示す代表的なFACSプロットは、単一細胞に解離。生細胞は、FSC-HおよびSSC-Hパラメータで応じ、R1領域でゲートされています。 SSC-H：539（電圧）、1.0（AMPGAIN）、モード：リニア; FSC-H：ゼブラフィッシュ胚の典型的なサンプルを示すE00（電圧）、2.1（AMPGAIN）B）の代表的なFACSプロットは、単一細胞に解離。 5分間、FACS分析の前に、サンプルは、ヨウ化プロピジウム（1μg/ mlのPI）と共にインキュベートされた。死んだ細胞は、PI蛍光（FL2-Hチャネル）と応じ、R2領域上にゲートされています。 FSC-H：E00（電圧）、2.1（AMPGAIN）、モード：リニア、SSC-H：539（電圧）、1.0（AMPGAIN）、モード：李近く。電圧チャネル：FL-2：613ログC）を示す代表的なFACSプロットは、酸化促進剤処理（H 2 O 2）にかけゼブラフィッシュ胚およびそれぞれのコントロールが解離し。内皮細胞は、GFPチャネルによって可視化される。 FACSプロットは、ULおよびURに酸化ストレス（ROS）によって影響を受けるすべてのセルを表します。陰性細胞が低い象限（LLおよびLR）上にプロットされる。 Tgは（Kdrl：GFP）48hpfにおけるS843ゼブラフィッシュ胚を、10分間の対照としてH 2 O 2（2 ​​mM）を又はH 2 Oと一緒にインキュベートした。プロトコールに記載のようにFACS分析の前に、胚は処理される。酸化ストレスによって影響を受けた細胞は、一般的なROS感受性蛍光プローブ（; 2.5μMCellROX）を用いて検出される。 ROS感受性プローブ​​とともにインキュベートしていない試料は、陰性対照として含まれている。それぞれのコントロールに酸化促進処理を行った試料を比較すると、上部の四分円（UL + UR）にプロット細胞の数が高くなる。 FACSのアキ次のようにitionの設定であった：電圧チャネル：FL-1：582ログイン; FL-4：H 2 O 2処理した胚および各制御における酸化ストレスの影響を受けて410細胞の割合を示すログD）ヒストグラム（UL + UR）。測定は、（c）に示すサンプルに関連しています。酸化ストレスによって影響を受けた細胞は、一般的なROS感受性蛍光プローブ（; 2.5μMCellROX）を用いて検出される。結果は、H 2 O 2処理した胚および各制御における酸化ストレス（ROS +）の影響を受けた内皮細胞のパーセンテージ（GFP +）を示すSD。E）ヒストグラム±n = 2の異なる生物学的複製の平均である。測定は、（c）に示すサンプルに関連しています。 nrf2aのモルファント（nrf2a MO）とそれぞれの対照の結果は、酸化ストレス（ROS +によって影響を受ける細胞の割合を示す値±SD、N = 2の異なる生物学的複製の平均である。 女）ヒストグラム）24 HPFで（CTRL MO）。 72 HPFでDMSO）;10μM）と、それぞれのコントロール（Ctrlキー、結果は平均±SD、N = 2の異なる生物学的複製の平均治療胚におけるミトコンドリアの酸化ストレス（ロテノンの影響を受けた細胞の割合を示すG）のヒストグラムである。単一細胞に胚の解離した後、ミトコンドリアの酸化ストレス（ミトコンドリアROS +）は、ミトコンドリア特異的プローブ（;5μMのMitoSOX）を用いて測定した。結果は平均±SD、N = 3の異なる生物学的複製の平均である。

著者らは開示するものは何もない。