ここでは、生きているゼブラフィッシュの胚の酸化ストレスを測定するためのプロトコルを報告します。この手順により、全胚組織と単一細胞集団の両方で活性酸素種(ROS)を検出できます。このプロトコルは、定性的分析と定量的分析の両方を実現します。
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この記事について
サマリー
要約
活性酸素種（ROS）高レベルの酸化ストレス状態に向かって細胞の酸化還元状態の変化を引き起こすことがある。この状況は、分子（脂質、DNA、蛋白質）の酸化を引き起こし、細胞死に至る。酸化ストレスにも影響、糖尿病、網膜症、神経変性、および癌などのいくつかの病理学的状態の進行。これにより、単一細胞のレベルではなく、生物全体との関連においてのみならず、酸化ストレス状態を調査するためのツールを定義することが重要である。ここでは、そのような研究を行い、in vivoでの酸化ストレスを測定するためのプロトコルを提供するように、インビボ系において有用であるとゼブラフィッシュ胚を考える。 "i）の酸化ストレスの定性的測定のための「全胚ROS検出法」およびii）A：蛍光ROSプローブ及びゼブラフィッシュトランスジェニック蛍光線を利用して、我々は、 生体内で酸化ストレスを測定するための2つの異なる方法を開発単一細胞ROS酸化ストレスの定量的測定のための検出方法 "。ここで、我々は、酸化剤および生理学的または遺伝的方法によって、組織における酸化ストレスを増加させることによって、これらの手順の有効性を実証する。このプロトコルは、フォワード遺伝子スクリーニングのために適している、それはそのような神経疾患や癌などの酸化ストレスに関連する病状の動物モデルにおけるROSのアドレス因果関係を支援します。
概要
酸化ストレスは、特にアンバランス細胞のレドックス状態から生じる状態と定義される。日常の内側の細胞を発生する複雑な酸化還元反応は、細胞の酸化還元状態を決定する。酸化還元反応は、分子の還元および酸化を生産する生物学的分子の原子間の電子の移動で構成され、全ての化学反応（ すなわち酸化還元反応）で構成されています。これらの反応は極端な構造的な不安定性や近隣の生体分子と交換するアンバランスな電子の自然活性化を特徴としている電子的に活性種（ すなわち酸化促進種）によって触媒される。これらの不規則な反応は、DNA損傷、タンパク質カルボキシル化、および脂質酸化にもたらし、最終的に細胞死をもたらす1。酸化ストレスのレベルの増加は、加齢と異なる病態2の進行と関連している。酸化ストレスはあります糖尿病や心血管疾患3,4の血管の変化の原因であることが報告されて。それはまた、アルツハイマー病における神経変性に重要な役割を果たしており、パーキンソン病5。さらに、酸化ストレスは、癌の進行および転移性事象6,7を支配する重要な要因として実証されている。加えて、炎症および免疫応答を惹起し、さらに酸化ストレス8をサポートすることができる。
または窒素（RNS、反応性窒素種）、生きた細胞において、酸化促進種は、酸素（活性酸素種ROS）に由来する。 ....
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プロトコル
1。楽器の準備と作業溶液
- 魚の水溶液を調製する。蒸留水50ml中の海塩「インスタントオーシャン」の2グラムを溶解することにより保存溶液を作る。 （最終濃度60μg/ mlの海の塩）魚の水を使用する準備ができて準備する1リットルの蒸留水に株式魚の水の1.5ミリリットルを追加します。使用法の前に魚の水を使用する準備ができてオートクレーブ。この溶液を、ゼブラフィッシュ胚培地として使用される。
- 胚マウント用メチルセルロースを準備します。滅菌魚の水50ml中に1.5gのメチルセルロースを溶解する。撹拌プレート上の磁石を使用して、溶解を容易にする。粉末が完全に溶解し、数時間が必要な場合があります。小さなチューブに透明度と分量のためのソリューションをご確認ください。ヶ月間-20℃で保存し、使用時に一定分量を解凍する。使用する前に、5分間950×gでメチルセルロースを遠心分離する。一定分量の凍結融解は避けてください。
- トリカイン/エチル3 - アミノ安息香mを50mlの調製を水100mlにトリカイン200mgの溶解し、トリス-HCl、1M液（pH 9）を用いてpHを7.0に調整することによってエタンスルホン酸塩（原液）。以上30日間、4℃で、この株式を保管してください。注意：トリカインは有毒である。適切な取り扱いのガイドラインに従って使用してください。
- ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスを誘導する
- 一般的な酸化的ストレス誘導のための酸化剤溶液を調製する：....
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結果
ここに記載された方法を適用することによって、我々は簡単にゼブラフィッシュ胚組織における酸化ストレス（ROS及びレベル）を測定し、検出することができる。大人のゼブラフィッシュを横断した後、卵を回収し、72時間後に受精（HPF）に28℃で開発することが許可されています。強い酸化促進試薬との胚の1）の処置または2）組織損傷後のROS形成を促進する酸化的ストレスを誘導するために、我々は2つの異なるアプローチを提案する。
過酸化水素（H 2 O 2）、一般的な細胞性ROS形成剤として、およびロテノン、特定のミトコンドリアのROSドライバとして得た：最初のアプローチでは、特定のニーズに応じて二つの異なる試薬を用いる。ロテノンは規制緩和が酸化ストレス41の原因であるETCの複合体Iの阻害剤である。
第二のアプローチにおいて、我々は、ゼブラフィッシュ胚のテールフィンで創傷を作成することにより、ROSの蓄積を誘導し39。また、酸化ストレス条件がモルホリノ.......
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ディスカッション
重要なステップ
本明細書に記載されるゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスを検出するための手順は、2つの異なる方法を含む。単一細胞ROS検出方法（ 図1）のより具体的な定量的測定を可能にしながら、ホールマウントROS検出方法は、主にROS検出のための定性的なアッセイである。どちらの方法も、ゼブラフィッシュ胚に、生体内のROS検出を評価するための迅速かつ簡単な方法を提供します。しかし、どちらも、いくつかの重要なステップを紹介します。
方法Iに関連する重要なステップ
ホールマウントROS検出するための第1の方法は容易に生きた胚（ 図2）の全ての組織における酸化ストレスを検出するために大きな利点を有する。胚組織に対するプローブの1）の透過性、2）プローブ毒性および3）番目：しかし考慮されなければならないとアッセイの結果に影響を与える可能性があります3の重要な重要な側面があります低ROS濃度に電子プローブ感度.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
マッシモ・サントロ研究室での
サポートは、HFSP、Marie Curie Action、Telethon、AIRCから来ています。原稿を批判的に読んでくださったDafne Gays氏とEmiliano Panieri氏に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 過酸化水素溶液 | SIGMA | 516813 | DO NOT STORE DILUITIONS |
| ハンクの平衡塩溶液 1x | GIBCO | 14025 | |
| メチルセルロース | SIGMA | M0387 | |
| インスタントオーシャンアクアリウム 海塩混合物 | INSTANT OCEAN | SS15-10 | |
| Tricaine | SIGMA | A5040 | |
| 汎用 ROS 感受性プローブ: CellROX Deep Red Reagent | INVITROGEN | C10422 | |
| ミトコンドリア特異的 ROS 感受性プローブ: MitoSOX | INVITROGEN | M36008 | 、1 つのバイアルを 13 μl DMSO |
| ヒドロエチジン | INVITROGEN | D23107 | |
| ロテノン | SIGMA | R8875 | DMSO に 5 mM ストック溶液を調製します。 |
| ジメチルスルホキシ | ドSIGMA | D2650 | |
| VAS2870; 3-ベンジル-7-(2-ベンゾオキサゾリル)チオ-1,2,3-トリアゾロ(4,5-d)ピリミジン | エンツォライフサイエンス | BML-EI395 | 粉末をDMSOに溶解します;魚水中の希釈石 |
| ヨウ化プロピジウム | Molecular probes (Life Technologies) | P3566 | |
| 7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD) | Molecular probes (Life Technologies) | A1310 | |
| Nrf2a Morpholino | GeneTools | 5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref | : Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413);小林et al.;2002 (PMID:12167159) |
| コラゲナーゼ P | ROCHE | 11213857001 | 粉末を100 mg/mlで滅菌HBSSに溶解します。アリコートを-20°Cで保管します。C |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | GIBCO | 10010-056 | |
| ウシ胎児血清 | GIBCO | 10082-147 | |
| 完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠 | ROCHE | 1錠を1mlの水に溶かします | |
| 0.5% トリプシン-EDTA (10x)、フェノールレッドなし | GIBCO | 15400-054 | 使用前に1x作業溶液を準備し |
| 複合顕微鏡 | ZEISS | ||
| 実体顕微鏡 | Nikon | AZ100 | |
| カメラ | ZEISS | AxioCamMRm | |
| ソフトウェア | ZEISS | ZEN 2011 | |
| 蛍光活性化セルソーター | BD FACSCalibur | ||
| Centrifuge | エッペンドルフ | 5417R | |
| FACSチューブ | BD | 342065 | |
| マルチウェルプレート | BD Falcon | 353047 | |
| 滅菌済み、未処理のペトリ皿 90 mm | VWR | 391-1915 | |
| 共焦点顕微鏡 | ライカ | SP5 |
参考文献
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
- Chen, A. F., et al.
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再版と許可
