妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用

サマリー

妊娠は、母体組織の脂肪酸組成に有意な変化をもたらす。脂質プロフィールは、ラットの間で個々の脂質クラス内の脂肪酸の同定および定量は、妊娠中の種々の高および低脂肪食を給餌できるように、ガスクロマトグラフィーを介して得ることができる。

要約

ガスクロマトグラフィー（GC）を高精度かつ再現性の高い結果が得られ、組織、細胞、血漿/血清から脂質の脂肪酸含量を同定および定量するために使用される高感度な方法である。代謝および栄養の研究においてGCは、脂肪酸濃度の変化の評価は、介入の後、または妊娠などの生理的状態の変化の間に可能にする。アミノプロピルシリカカートリッジを使用して固相抽出（SPE）は、トリアシルグリセロール、様々なリン脂質、およびコレステリルエステル（CE）を含む主要な脂質クラスの分離を可能にする。 SPEと組み合わさGCは、種々の高および低脂肪食を給餌されたバージン及び妊娠ラットの肝臓におけるCE画分の脂肪酸組成の変化を分析するために使用した。肝臓CEのω-3およびω-6脂肪酸含有量に大きなダイエット/妊娠相互作用効果は、妊娠中の女性が食物manipulatに対して異なる応答を有することを示してありよりイオンは処女雌の間で見られます。

概要

ガスクロマトグラフィー（GC）は、肥満症（および糖尿病などの関連疾患）、または妊娠³などの補充または生理学的状態の間脂質プールおよび細胞膜^1,2への脂肪酸の取り込みを同定および定量するために使用される十分に確立された技術である^{- 5。}それはまた、食品中の脂肪のタイプおよび量を分析するのに適している。実験食を特徴付けるだけでなく、食品業界は、規制に準拠していることを確実にする場合に便利です。例えば、GC、その標識が正しく、規制が^6,7に接着されるように、このような栄養補助食品のような製品内のアイデンティティおよび脂肪酸の量を確認するために使用することができる。脂肪酸の分析では、健康と病気、食事変更の影響、および生理的状態⁸の変化の影響での脂質代謝への貴重な洞察を提供することができます。妊娠中にサンプルを研究するため、GCの使用が重要に提供してきました脂肪酸と複合脂質の恒常³の変化についての情報。

クロマトグラフィー分離の前に、脂質は、典型的には、クロロホルムとメタノールの溶媒混合物中の脂質の溶解度を用いてサンプルから抽出される。塩化ナトリウム相^9,10を含有する水性および有機脂質への混合物の分離を容易にするために添加される。関心対象の複合脂質クラスは、固相抽出（SPE）によって総脂質抽出物から分離することができる。この分離技術は、それらの極性または結合親和性に基づいた脂質クラスを溶出する。 Triacyglycerols（TAG）およびコレステリルエステル（CE）を合わせた画分、さらにクラス、ホスファチジルコリン（PC）として最初に溶出され、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、および非エステル化脂肪酸（NEFA）は、溶出溶媒の極性を増加させることによって溶出される。 CEからのタグの分離は、新鮮なのSPE cartri、タグの結合を利用DGE、CEが溶出することができるようにする。 TAGは、次いで溶出溶媒^9,10の極性を増加させることによって溶出させることができる。この方法は、複数のサンプルが比較的小さいサイズのサンプル（ 例えば、<100μlの血漿または血清、<100 mgの組織）は^11,12分析することができることを意味する薄層クロマトグラフィーを用いて達成されるよりも高い収率で同時に分離することができる。

GCは、最初、1950に記載された十分に確立された技術であり、これは、次いで、液 - 液系における移動相は蒸気で置き換えることができることが示唆された。当初は石油分析のために使用されるが、そのような急速に主要な関心が依然としてあるアミノ酸分析および脂質生化学などの他の分野に拡大した。以前に使用した充填カラムからこのようなキャピラリカラムの開発など、GC機器や技術の進歩により、脂肪酸があることができるかが私たちの現在の技術につながっているGCは、日常的な調査¹³の広い範囲で脂肪酸を同定および定量するために使用され、その結果、より低い温度でより効率的に分離する。

GCは、それらが熱分解することなく、妥当な温度で溶出するのに十分に揮発性になることができるようにするために誘導体化される脂肪酸を必要とする。これは、通常、分析のためにエステル、チオエステル、またはアミドを形成するために水素を含む官能基の置換を含む。メチルエステルは一般的にメチル化によって製造される誘導体を、研究されている。この方法では、複合脂質中のエステル結合が脂肪酸メチルエステル（FAME）を形成するtransmethylatedされている遊離脂肪酸を放出するために加水分解される。 GCにより決定FAMEの結果として生じるプロファイルは、脂肪酸組成物と呼ばれ、簡単に異なる実験群^9,10の間で比較することができる。技術は個々を、両方の割合ができますUALの脂肪酸およびそれらの濃度を測定する。

栄養学研究において、食品業界内の脂肪酸を分析するためのGCの使用に加えて、この技術は、分析の幅広い分野で使用できる。例えば、GCを用いて、環境分析は殺虫剤および土壌水の汚染を測定することが含まクロロベンゼン含有量を測定解析する。毒物学では、GCはまた、尿、個人の血液試料中の違法な物質を同定するために使用されている等のスポーツパフォーマンスエンハンサー¹²及び炭化水素の複雑な混合物を分離する能力は、石油化学分析¹²のための石油産業におけるこの技術が人気となる。

妊娠は、多価不飽和脂肪酸アシ有意な母体組織の脂肪酸組成の変化、具体的にはω-3の含有量が第（n-3）およびω-6（n-6）系に関連付けられている^{DS（PUFA）3。}現在の研究では、異なる油供給源と低および高脂肪食を与えた処女と妊娠ラットから採取した肝臓組織の脂肪酸組成の分析においてその使用を記述することにより脂肪酸の測定におけるGCの使用を例示する。ここで提供される実験食は低脂肪大豆油ベースの食、高脂肪大豆油ベースの食事療法（130.9グラム総脂肪/ kgの総脂肪）または高脂肪亜麻仁油ベースの食事療法（130.9グラム総脂肪/ kgであった20日間のために提供食）、。これらの食事の完全な栄養素と脂肪酸組成は、以前に¹⁴に記載されている。大豆油食はリノール酸（18:2 n-6系）に富み、亜麻仁油食は、α-リノレン酸が豊富に含まれている間、いくつかのα-リノレン酸（18:3 n-3系）が含まれている。これらの高脂肪食は、リノールα-リノレン酸にする（それぞれ8:1 1:1の配給）の異なる飼料を表しています。個々の脂質クラスの分離とGCによる分析のための方法は、我々であるLL設立され、検証され、以前に¹⁰ではなく、ここに見つかった詳細な技術的説明なしに公開されています。

プロトコル

1。動物手続き

1. 全ての動物研究は、内務省動物（科学的処置）法（1986）に従って行われるべきである。
2. 一夫一婦制の繁殖による古い10週齢のWistarラットを交尾し、膣栓の出現によって妊娠を確認します。妊娠1日目としてこれを記録し、実験食を開始。処女雌については、個別にそれぞれのラットを収容し、実験食を開始。
3. 20日間の実験飼料を供給した後、頸椎脱臼に続いてCO ₂窒息によりラットは安楽死させる。
4. 腹腔を露出させ、腹部、胃と十二指腸の前壁を振動板に肝臓をつなぐ靭帯を切断することにより、肝臓を切除する解剖鉗子やハサミを使用してください。 -80℃で保存する前に、PBS中で肝臓を洗浄し、液体窒素中で凍結

2。総脂質の製造は^、9を抽出します

1. moleculを追加ARキュラー'ドライ'溶剤を作成するためにすべての溶媒に（溶剤容器の1月10日を記入します。）。 ヒュームフード内のすべての溶剤作業を実施 。
2. 約100ミリグラムを凍結した肝臓を切り取り、重量を量る。アイスバケットにチューブに組織を配置し、0.8ミリリットルの氷冷0.9％のNaClを追加します。組織を均質化する。
3. 乾燥クロロホルムを1ml / mgの中に溶解し、内部標準を追加：メタノール（2:1、v / v）のブチル化ヒドロキシトルエン（BHT;を50mg / l）を含有する抗酸化剤。ラットの肝臓の100 mgのためのCE規格（コレステヘプタデカン午後05時）の100μgのを追加します。 注意 ：クロロホルムおよびBHTは危険です。
4. 5.0ミリリットルの乾燥クロロホルムを追加：メタノール（2:1、v / v）のBHTた（50mg / L）を含有する。
5. 混合物が均一に見えるまで、ボルテックスで十分に混和、1.0ミリリットル1MのNaClを追加します。サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
6. 10分、室温で低ブレーキ1,000×gで遠心分離する。
7. lower収集ガラスパスツールピペットを用いて相は、40℃の窒素下に新しいスクリューキャップガラスチューブに移し、ドライサンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。

3。固相抽出^（SPE）10による脂質クラスの分離

1. 真空ポンプにSPEタンクを接続し、タンクにアミノプロピルシリカSPEカートリッジを配置します。
2. 第一の画分を収集するために列の下のタンクラック内のタグおよびCEというラベルの新しいスクリューキャップのガラス管を配置します。
3. 1.0ミリリットルの乾燥クロロホルムや渦の総脂質抽出物を溶解する。
4. ガラスパスツールピペットを用いてカラムにサンプルを適用し、重力下でスクリューキャップチューブに通って滴下することができます。これ以上のドリップが落ちない場合は、真空によって残った液体を除去。
5. 真空下でTAGおよびCEの分画を溶出、乾燥クロロホルム2×1.0 mLの洗浄でカラムを洗浄。
6. 全ての液体が除去されると、TAGおよびCE fractioを乾燥40℃で窒素下、Nサンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
7. 列の下のタンクトレイに新しいスクリューキャップのガラス管ラベルのPCを配置します。
8. 2×1.0ミリリットルを加え乾燥クロロホルムを真空下でのPCの割合を溶出：メタノール（60:40、v / v）で、すべての液体がカラムから除去されるまで。
9. 40℃で窒素下でのPCの画分を除去し、乾燥サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
10. タンクトレイに、PEという新しいスクリューキャップのガラス管を配置し、1.0ミリリットルを加え、真空下で乾燥メタノールでのPE分を溶出。
11. 40℃で窒素下でのPE画分を除去し、乾燥サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
12. タンクトレイにNEFAという新しいスクリューキャップのガラス管を置き、乾燥クロロホルム2×1.0ミリリットルの洗浄を添加することにより、真空下でNEFA分を溶出：メタノール：氷酢酸（100:2:2、v / v / v）を注意 ：氷酢酸危険である。
13. 40℃の窒素下で収集NEFA画分と乾燥を削除サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
14. SPEタンクに新しいアミノプロピルシリカSPEカートリッジを配置し、廃棄物を収集するためのカートリッジの下にタンクトレイにスクリューキャップのガラス管を配置します。
15. 3真空下で乾燥ヘキサン洗浄および重力下で、最終的な1.0ミリリットルの洗浄でカラムを洗浄します。 。カートリッジ（ヘキサンレベルはカートリッジ行列に近い場合に閉位置にカートリッジカラム·チャネルをオンに） 注意ドライになることを許可していない：ヘキサンは危険です。
16. 新しいスクリューキャップガラス管ラベルのCEと廃液チューブを交換してください。
17. 乾燥ヘキサンと渦の1.0ミリリットル中に（ステップ3.6で製造）乾燥し、タグおよびCE分を溶解する。ガラスパスツールピペットを使用して列にこれを適用するとgの下を滴らすることができますravity。
18. これ以上のドリップが落ちないときは、真空下で残りの液体を除去。
19. 真空下、40℃で窒素下、CEおよび乾燥回収した画を溶出する乾燥ヘキサン2×1.0 mLの洗浄でカラムを洗浄サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
20. タンクトレイに新しいスクリューキャップのガラス管にラベルされたタグを配置し、乾燥ヘキサン2×1.0ミリリットルの洗浄を追加してタグを溶出：メタノール：酢酸エチル（100:5:5）を真空下。
21. 40℃の窒素下で乾燥回収した画。サンプルは週までの注意のために蓋をし ​​て、この段階で-20℃で保存することができます：酢酸エチルは危険です。

4。 CEの¹⁰からFAMEの調製

1. 。分離のCE分（ステップ3.19で収集）し、ボルテックス注意を乾燥トルエン0.5ミリリットルを追加します。トルエンは危険です。
2. 2％（vでメチル化試薬を調製（乾燥メタノール/体積）は1.0 mlのサンプル当たり要求されるH ₂ SO _4）。ガラスや蓋付きの適切なプラスチック容器に乾燥メタノールの量を分配し、H ₂の必要量を追加し、SO ₄滴下し、転倒混和注意 ：濃硫酸は危険です。
3. 乾燥トルエンに溶解したサンプルをメチル化試薬の1.0ミリリットルを加え、しっかりとチューブにキャップをし、穏やかに混合。
4. 50℃で2時間、試料を加熱する
5. 2時間後に火からチューブを取り外します。一度クール（0.25M KHCO ₃ 0.5MK ₂ CO _3）水溶液を中和する1.0ミリリットルを追加注意 ：重炭酸カリウムおよび炭酸カリウムは危険です。
6. 1.0ミリリットル乾燥ヘキサンと渦を追加します。
7. 2分、室温で低ブレーキ用250×gで遠心分離する。
8. 名声を含んでいる上相を収集し、新しい非スクリューキャップ使い捨てガラス管に移す。
9. 下で収集名声を乾かし40℃の窒素サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。

5。 CE FAME ¹⁴から遊離コレステロール汚染の除去

（遊離コレステロールは、サンプルを汚染することができます。無料のコレステロール除去をしてなくても例えば、クロマトグラフトレースの図1を参照）。

1. SPEタンクに廃液チューブを配置し、タンクの上にシリカゲルSPEカートリッジを配置します。
2. 真空下での乾燥ヘキサンで3回1ミリリットルの洗浄と重力の下、1×1ミリリットルでカラムを洗浄します。
3. 廃棄物の洗浄を取り外し、タンクに新しい廃液チューブを追加します。
4. 1ミリリットル乾燥ヘキサン、渦のCE名声を溶かす。
5. ガラスパスツールピペットを用いてカラムに適用され、重力の下を滴下することができます。
6. 真空下でのヘキサンで3回1ミリリットルの洗浄でカラムを洗浄します。
7. 廃棄物の洗浄を外し、タンクラベルCEの名声に新しい非スクリューキャップチューブを配置します。
8. 溶出2×1ミリリットル乾燥ヘキサンでのCE FAME：ジエチルエーテル（95:5 v / v）で洗浄する。
9. 40℃の窒素下で乾燥する。サンプルは週までの注意のために蓋をし ​​て、この段階で-20℃で保存することができます：ジエチルエーテルは危険です。

6。 GCオートサンプラーバイアルにFAMEの転送

1. 、渦をサンプリングして、GCのオートサンプルバイアルに転送する75μlの乾燥ヘキサンを追加します。
2. 、サンプル渦と同じGCオートサンプルバイアルに転送し、さらに75μlの乾燥ヘキサンを追加します。サンプルは、月までのために蓋をして、この段階で-20℃で保存することができます。

7。ガスクロマトグラフ^14を用いた分析

1. ガスクロマトグラフ上で名声を分析します。の例では、最大セット：30 MX X 0.25ミリメートル0.25ミクロンBPX-70温度プロトコル溶融シリカキャピラリカラム：
   初期温度115℃、245℃、Hに18.5分、傾斜60℃/分を保持し、200℃まで2分、勾配10℃/分を保持旧4分。
   コラム：ヘリウムガス、流量1.0、圧力14.6と速度29。
   インジェクタ：温度= 300℃、
   検出器：水素流量40.0、空気の流れ184.0、ガスヘリウムを構成している、45.0を流量、温度= 300℃、
2. （CEの名声分析用など 25:1）に応じて分割比を設定します。
3. 適切なソフトウェアを使用して、各ピーク下の面積を決定し、標準と比較することによって名声を識別します。例えば、クロマトグラムについては、図2を参照してください。
4. 総脂肪酸の割合として、個々の脂肪酸の寄与を計算するために、ピークデータ下の面積を使用する。
5. 添加量は、内部標準の面積で割ることにより脂肪酸の絶対濃度を計算する。用いる組織量内の各脂肪酸の絶対濃度を得るために、この結果により、各脂肪酸の領域を分割する。

結果

この方法の成功は、正確かつクロマトグラムにも表示される可能性が「ノイズ」と汚染を低減するために、きれいな溶媒および試薬を使用しているプロトコルを以下に依存します。汚染されたサンプルは、曲線下面積の計算の精度を低下させること、分析することがより困難である。プロトコルが明確な左右対称、明確に定義されたピークとし、最小限のバックグラウンドノイズで正常にクロマトグラムを続いている場合は、図3に示すように得られるべきである。汚染が発生した場合のクロマトグラムは、追加のピークが表示され、 図4に示すように非対称（スキュー）ピークを示す。 CE（コレステロールが削除されない限り、 図1を参照してください（プロトコル5を参照）から派生した名声を実行する際に遊離コレステロールからの汚染が発生します。

調製されたキャリブレーション混合物の使用は、目におけるFAMEの同定を可能Eサンプル。クロマトグラムを図2に示すように、それらの保持時間に基づいて、試料と正しく同定され...

ディスカッション

ガスクロマトグラフィーは脂肪酸分析のために使用する正確な技術であり、その高い再現性が臨床分析に適したこの技術を認める。適切なGCカラムは、使用可能なカラムは、固定相、カラムの長さと内径の極性の変化を有する、関心対象の脂肪酸の同定を可能にするために使用されなければならない。この分析方法では、溶融シリカキャピラリーカラムの使用は、良好な熱安定性およびその高い表面不活性及び良好な分解能⁸による保持時間の再現性を提供する。

このプロトコルの中の重要なステップは、下限と上限位相収集ステップを（プロトコル2.7と4.8ステップ）が含まれる。それは、正しい位相の限りが不要な相のいずれかとの汚染なしに可能な限り収集することが重要である。サンプル中の汚染物質の存在は望ましくないクロマトグラフの出力になります図2に示すように、 SPE間にCEを収集する際には、カートリッジカラムは、サンプルは、タグからのCEの成功分離を可能にする列を貫通することを確認し、ヘキサンで洗浄後、溶媒（ステップ3.1...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
メタノール	フィッシャー サイエンティフィ	M/4056/17	「コーション」ヒューム - HPLCグレード
クロロホルム	フィッシャーサイエンティフィック	C/4966/17	「コーション」ヒューム - HPLCグレード
BHT	Sigma- アルドリッチ	W218405	「コーション」 ダストヒューム - 無水
NaCl	Sigma- アルドリッチ	S9888	無水
ヘキサン	フィッシャーサイエンティフィック	H/0406/17	「コーション」ヒュームズ - HPLCグレード
氷酢酸	シグマ- アルドリッチ		695084「コーション」 バーンズ - 99.85%
硫酸	シグマ- アルドリッチ	339741	「コーション」 バーンズ - 99.999%
炭酸カリウム	シグマ- アルドリッチ	209619	99% ACS試薬グレード
重炭酸カリウム	シグマ-Aldrich	237205	99.7% ACS Reasgent グレード
エチルアセテート	フィッシャー・サイエンティフィック		10204340'CAUTION' ヒュームズ - 99+% GLC SpeciFied
トルエン	フィッシャー・サイエンティフィック	T/2300/15'CAUTION	' ヒュームズ
ジエチルエーテル	Σ- Aldrich		309966'CAUTION' ヒューム
窒素 (酸素フリー) シリンダー	BOC	44-w	「注意」 圧縮ガス - 爆発の危険性
アミノプロピルシリカ SPE カートリッジ	アジレント	12102014	カートリッジ - ビーズ質量 100 mg
シリカゲル SPE カートリッジ	アジレント	14102010	カートリッジ - ビーズ質量 100 mg
分子 seives	Sigma- Aldrich	334324	ペレット、AW-300、1.6 mm
ガラス パスツールピペット	フィッシャー サイエンティフィ	ック FB50251