スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

Summary

サポートされている脂質二重層と天然膜粒子は、細胞膜の特性を近似することができると分析種々の戦略に組み込むことが好都合システムである。ここでは、サポートされている脂質二分子膜でコーティングされたSiO ₂ビーズ、リン脂質小胞または天然の膜粒子からなるマイクロアレイを調製するための方法を実証する。

Abstract

脂質二分子膜は、細胞の原形質膜を形成し、細胞内オルガネラの境界を画定する。自然界では、これらの膜は、脂質の多くの種類の不均質混合物である膜結合タンパク質を含んでおり、糖質が飾られています。いくつかの実験では、天然のものから、膜の脂質二重層の生物物理学的又は生化学的特性を分離することが望ましい。そのような場合には、このような巨大ベシクル、リポソームまたはサポートされている脂質二重層（のSLB）などのモデルシステムの使用を求める。のSLBのアレイは、アプリケーションを検出し、細胞 - 細胞相互作用を模倣するために特に魅力的である。ここでは、SLBアレイを形成するための新たな方法を説明します。サブミクロン径のSiO ₂ビーズが第1の球面のSLB（SSLBs）を形成する脂質二重層で被覆されている。次いで、ビーズを微細加工サブミクロン径のマイクロウェルのアレイに堆積される。別れるながら調製技術は、基板表面を洗浄するために「スキージ」を使用しマイクロウェルに落ち着いてきSSLBsの後ろグラム。この方法は、マイクロウェル基板のない化学修飾、またSSLB上の任意の特定の標的化リガンドを必要としません。ウェルの直径は、ビーズの直径よりもわずか大きくなるようにチューニングされているので、マイクロウェルは単一のビーズによって占有されている。残りは空のままで一般的には、井戸のより多くの75％は、占有されている。緩衝液中でSSLBアレイは、より大きな一週間の長期安定性を示す。我々は、ガングリオシドGM1とコレラ毒素の相互作用を特徴付けることによって実証する、SSLBs複数種類のシリアル堆積によって単一のアレイに配置することができ、およびアレイは、感知のために使用することができる。我々はまた、細胞源からビーズ支持体と生体膜なしのリン脂質小胞は、同じ方法で配列することができ、細胞特異的膜脂質を同定することができることを示している。

Introduction

脂質二重膜は、本質的に必須の構造である。携帯形質膜や細胞小器官の膜は、生活のために必要である分子の数を組み込んだ脂質二重層で構成されています。多くの生命維持プロセスは、細胞の表面に発生するか、脂質二重膜と結合する分子によって媒介される。実際には、多くの医薬品対象プロセスまたは分子は^、1,2または膜上に見出される。これは、分析的に、膜表面で起こる化学反応または非共有結合事象のようなプロセスを調査することが必要である。天然の膜は、単離することが困難および/またはセンサとのインタフェースとすることができるので、多くの研究者が分析研究を実施するために簡略化されたモデル膜を用いる。モデル膜システムの数は、数十ナノスケール寸法を有するリポソーム^3,4に直径数百ミクロンにすることができる巨大な小胞に至るまで、文献に記載されている。 ALTERNatively、固体支持体上に堆積された平面脂質二重層は、 すなわち 、異なる表面の数に形成することができ、広く、生物物理学的、生化学的、および分析アプリケーション⁵で使用されているが、脂質二重層（のSLB）を支持した。電気的または光学材料でのSLBとを連結すると、さまざまな分析技術を利用して膜生化学および生物物理学の研究を可能にします。蛍光顕微鏡^6、7電気化学、光学分光^8、走査型プローブ顕微鏡法^9、表面プラズモン共鳴^10、および質量分析^11は、すべてのSLBの構造と特性を研究するために使用されてきた。

SLBアレイは多重アッセイ^12,13のためのセンサーの設計に追加の汎用性を提供します。他のアプリケーションは、免疫細胞¹⁴の間に形成される接合を模倣するために、SLBアレイを使用しています。 SLBアレイの製造方法は、microfluから変化しているIDICは、隣接のSLBパッチ間の物理的な障壁を用いるものと¹⁵に^{近づく。16}他のグループが印刷方法^17を使用していた、光化学パターニング¹⁸と、様々なナノエンジニアリングは、SLBアレイを作成するために¹⁹に^近づく 。

本論文では、添付のビデオでは、マイクロウェル²⁰の順序付き配列にSLBでコーティングされたSiO ₂ビーズを堆積させることにより、SLBアレイを形成する方法を示しています。私たちは、球状の支持された脂質二重層（SSLBs）などのSLBでコーティングされたSiO ₂ビーズを参照してください。この技術は、我々はまた、例の結果を示し、そこから自然発生源²¹に由来リン脂質小胞と生体膜の配列を作成した初期の研究の延長である。生体粒子または小胞を配列するための他の方法は、小胞の表面上に含まれる相補的なリガンドと会合する表面上の特定の標的化リガンドのパターンに頼ってきた。例としては、ビオチンを含んでアビジン会合^22,23及びDNAハイブリダイゼーションスキーム^24。我々のアプローチは、必要のない標的化または認識部分を有するマイクロウェルアレイを必要とします。 SSLBsのサイズは、低多分散性を持ったSiO ₂ビーズ支持体の直径によって定義されます。 SSLBの直径よりも大きいだけに、マイクロウェルの直径を調整することによって、単一SSLBは、各マイクロウェルに落ち着く。ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）スキージはその後、表面からマイクロウェル中に固定化されていないすべてのSSLBsが削除されます。得られたSSLBマイクロウェルアレイは、3μmの中心間間隔および六角形の周期性を有する高密度（〜10 ⁵ SSLBs個/ mm ^2）を有する。直列異なる脂質組成物でSSLBsを堆積させることによって、それがランダムに配置SSLBsを有する多成分アレイを作成することができる。 SSLBアレイの感知能力を実証するために、我々はSSLBsに組み込まガングリオシド（GM1）でコレラ毒素（CTX）の相互作用を用いる。ととも​​に天然の膜粒子は、我々は2つ​​の異なる種類の細胞からの膜材料を含む多成分アレイにおいて、細胞特異的脂質を検出することができた。

Protocol

マイクロウェルアレイ基板の1。微細加工

1. 熱成長酸化物を100nmで4インチシリコンウエハで始まる。
2. 30秒間、4,000 rpmで、ウェハ上に、SPR-955 0.7フォトレジストをスピン。
3. 90秒間115℃のホットプレート上で焼く。
4. フォトレジストを露光。
   1. アレイが2ミリメートル×2ミリメートルの領域をカバーして3ミクロン周期の六角形のアレイ状に配置された1ミクロンの穴が作成されたマスクを使用してください。
   2. 6mmのステップサイズは200ミリジュール/ cm ²の露光を用いて、i線ステッパーでウエハを露光する。
5. 90秒間115℃のホットプレート上で焼く。
6. 90秒の総開発時間のために、ウェーハ上のCD-26の2水たまりを堆積させるためにスピンデベロッパを使用して開発しています。
7. 超純DI水で十分に洗い流し、N ₂で乾燥させます。
8. Arを50 SCCM、CF ₄の25 SCCM、及びCHF ₃ FLOの50 SCCMで6分間反応性イオンエッチング装置、酸化物をエッチングする75トルの圧力で翼。
9. C ₄ F _{8、SF 6、Ar}を40 SCCM、および14トルの圧力で流れるO ₂の10 SCCMの27 SCCMの63 SCCMで2分間のICPディープトレンチ反応性イオンエッチング装置でシリコンをエッチング。
10. レジストを除去するためにアセトン、メタノール、およびイソプロパノールですすぐ。
11. H ₂の浴の代わりSO _4：表面を洗浄するための10分間のH ₂ O ₂ 1:1である。
12. 超純DI水で十分に洗い流し、N ₂で乾燥させます。
13. 250℃での原子層堆積によって堆積物_の Al ₂ O ₃の1080オングストローム

2ポリの製造（ジメチルシロキサン）スキージ

1. 可能な場合は、クリーンルームで働いています。そうでなければ可能な最もクリーンな環境で動作します。
2. ≥13ミリメートルの両側にプラスチック製のペトリ皿（またはその他のクリーン使い捨て容器）を取得します。
3. その皿の中で、50グラムのPDMSのBASが続き、5グラムのPDMS硬化剤を注ぐEエージェント（またはほとんどペトリ皿を記入します1:10の比で何か）。使い捨てのプラスチックピペットや棒でよく混ぜる。
4. 気泡が混合物（約30分）から出てくるまで、真空を適用し、真空ラインでチャンバ内で混合さPDMSを配置することにより気泡を除去。
5. ペトリ皿に既にされていない場合、気泡の生成を回避し、ペトリ皿中のPDMSを注ぐ。
6. 50℃（短い時間のために高い熱も動作します）>ホットプレート上で一晩硬化する。
7. 新しい/クリーンかみそりの刃で、慎重に、可能な限りクリーンな上面を保ち、矩形片約2.5×2.5センチカット。清潔なピンセットを用いてはがします。 （これはスキージ工程で使用されるエッジになります）できるだけ鋭い上端を作るために、一つの動きにカミソリの刃を押し下げて、1辺（1.5センチダウン）を切り落とす。
8. 次いで、アセトン、メタノール、イソプロピルアルコール、超純DI水できれいにし、クリーンな窒素ガスでブロー乾燥した。きれいなペトリ皿に保管してください。

小胞の3。準備

1. 25 mg / mlの卵ホスファチジルコリン（PC）の脂質ストック溶液を収集し、1 mg / mlの1,2 -ジパルミトイル-sn-グリセロ-3 -ホスホエタノールアミン-N - （リサミンローダミンBスルホニル）アンモニウム塩（Rho-イソDPPE）をクロロホルムクロロホルム/メタノール中のモノシアロ​​ガングリオシドGM1の0.5 mg / mlのストック溶液（2:1 v / v）であった。
2. 小さなガラスバイアル中の25 mg / mlのPCの18.9μlの、0.5ミリグラムの39.6μlの/ mlのGM1との7.9μLを添加することによって97モル％のPCに、2モル％GM1及び1モル％のRho-DPPE結果混合物を作る1ミリグラム/ガラスシリンジを使用してミリリットルのRho-DPPE。
3. 注：Nairさんら ²⁵の補足材料は、任意の所望の組成のベシクルを作成するために必要な脂質の量を算出するための優れたカスタマイズ可能なExcelスプレッドシートが含まれています。
4. 真空デシケーター中でバイアルを置き、6時間真空下でバイアルを残すことによって溶媒を除去する。
5. 0.1の水溶液を作るのNaCl。乾燥した脂質フィルムを含むバイアルに、0.1M NaCl溶液0.5ミリリットルを追加します。
6. 水性の脂質混合物を一晩休ませることができます。
7. 室温でのバスソニケーターで20分間超音波処理して、小胞体分散液を作成するために簡単に説明すると渦ミックス。
8. 100 nmの細孔サイズを有するポリカーボネート膜を介して小胞懸濁液を押し出す。フィルタ17Xによってベシクル懸濁液を渡します。
9. 4℃でガラスバイアル中で押し出された小胞を保存

球面支持された脂質二重層から4。の形成

1. 700 nmの直径のSiO ₂ビーズを収集します。ビーズは、1.4×10 ¹¹ビーズ/ mlのストック濃度で蒸留水に供給される。
2. 1.5mlのエッペンドルフチューブ中の0.1 M NaClを893μlのビーズストック溶液の107μLを添加することによって^1.5×10 10個のビーズ/ mlの濃度の1mlのビーズ懸濁液を調製する。
3. それがよくマイルであることを保証するために、サスペンションをボルテックスXED。
4. 遠心分離器20分間1700×gで懸濁液を次いで、上清を捨てる。 0.1 MのNaCl 1ml中にビーズを再懸濁する。徹底的にビーズを洗浄するためにさらに2回、この手順を繰り返します。
5. SSLBsを形成するために、1.5mlのエッペンドルフチューブに1 mg / mlの小胞懸濁液200μlをSiO ₂ビーズ懸濁液25μlを加える。ボルテックス混合し、室温で1時間放置してみましょう。この段階でSSLB濃度が1.7×10 ⁹ SSLBs / mlである必要があります。
6. SSLBsをペレット20分間1700×gで遠心します。ペレットは、ビーズ上のRho-DPPEとの小胞の破裂をピンク色に表示されます。
7. 225μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH値= 7.4での上清と再懸濁を捨てる。繰り返しますSSLB懸濁液から任意の未破裂小胞を除去するために4.6から4.7をさらに2回繰り返します。

5。総会SSLBの配列

1. 4-6 MICとの長方形片に生じたマイクロウェルアレイのクリーブウエハ一枚あたりのローウェル·アレイ。
2. 渦がSSLBサスペンションを混ぜ、その後、各マイクロウェルアレイ上SSLB懸濁液10μlを置く。残りのないよう、1時間SSLBsを表面に安定するようにします。
3. 優しく浅い皿に用意し、PBS浴に沈めた後、洗浄瓶からPBSでマイクロウェルアレイチップを洗う。
4. 水没しながら、ゆっくりとマイクロウェルアレイチップのPDMスキージフラッシュを置き、ゆっくりとマイクロウェル中に固定化されていないSSLBsを削除するために、表面5Xに沿ってスライドさせます。
5. 余分SSLBsを削除するために、PBS浴にグリップピンセットでマイクロウェルアレイチップ、ゆっくり振る。
6. すぐにスキージ浴からチップを取り外し、さらに使用するまで新しいPBS浴に配置します。チップの上面がSSLBsを保存する濡れたままにしてください。

注：上述の組立方法は、天然の膜粒子のアレイを作成するために使用できる、ミエリンマウス脳から単離された粒子、またはフォーのようなSiO ₂のビーズがサポートなしでspholipid小胞。この作業は、ウィッテンら ²¹及び代表的な結果を以下に示すに詳細に記載されている。

6。コレラ毒素結合アッセイ

1. PBS中のウシ血清アルブミン（BSA）の2 mg / mlの溶液を調製する。
2. 2 mg / mlのBSAを含むPBS中でアレクサ488コンジュゲートコレラ毒素Bサブユニットの所望の濃度の溶液を調製する。
3. PBS浴からSSLBアレイチップを取り外し、拭いて、実験室を使用して、PBS溶液のほとんどを吸い取る。 SSLBアレイが水和し維持するために、チップ上だけで十分なのPBSを残す。
4. 非特異的結合を防ぐために、SSLBアレイチップに2 mg / mlのBSA溶液を200μlを加える。湿潤箱中で1時間休ませ。
5. マイクロピペットで、SSLBアレイチップの上部から溶液200μlを削除します。
6. SSLBアレイチップにコレラ毒素溶液200μlを加え、湿潤箱中で1時間の休憩をしましょう​​。
7. 優しく未結合のコレラ毒素を除去するための洗浄瓶からPBSでSSLBアレイチップを洗う。
8. 拭いて研究室を使用して過剰のPBSを吸い取る。 24ミリメートル×40ミリメートルのカバースリップでカバーチップを画像化する前に。
9. 関心対象のフルオロフォアのための適切なフィルターセットを用いて正立顕微鏡の画像アレイ。
10. ImageJソフトウェアの自動化された粒子解析関数を使用して、アレイ内の個々のSSLBsの蛍光強度を分析する。
11. 指定された配列で発見SSLBsの強度をまとめたヒストグラムに個別SSLBsからの平均蛍光強度をコンパイルします。

Results

SiO ₂のビーズは、リン脂質、蛍光脂質およびガングリオシドなどのような他の脂質からなる小胞の溶液と混合すると、図1aに模式的に示すように、小胞は、SSLBsを形成するためにSiO _2をビーズ表面上で破裂。 SSLBsを洗浄した後、SSLB溶液の滴をマイクロウェルアレイ上に配置し、ビーズを表面に沈降させる。 （ 図1B1）これは、 図1b2とに示されているリン脂質小胞または天然の膜粒子の懸濁液を用いても行うことができる。マイクロウェルアレイ基板に吸着したリン脂質小胞の蛍光画像を図1B3に示されている。その後のPDMSスキージは、任意のSSLBs（ 図1C1）、小胞や天然膜粒子マイクロウェルに沈降しなかった（ 図1C2）を除去するために表面をそっとスライドさせる。これは、各々にSSLB配列になりマイクロウェルは、ほとんど1 SSLB（ 図1D1）または複数の小...

Discussion

本研究では、支持された脂質二分子層で被覆された単分散SiO ₂のビーズは、脂質二重層または基板表面にリガンドを標的化するための必要なしにマイクロウェルアレイに配列することができ、アレイは、毒素-脂質相互作用を特徴づけるために使用することができることを示している。我々はCTx/GM1結合に計算された解離定数は冬らの以前の報告。、脂質でコーティングしたビーズのコロイドアセンブリは約の解離定数を計算するために使用したと、文学の中の値の広い格差を考えると、好意的に比較30 nMの。ヒルWaud結合モデルにデータを適合することにより、我々はCTx/GM1相互作用はこれまでの報告²⁸と一致している可能性が高い多価であることを決定した。のCTX B（ガングリオシド結合）サブユニットは、GM1分子^29を結合することができる5つのユニットのそれぞれと、五量体として存在する。従って、それは所与の差分、複数のサブユニットが結合されてもよいことは驚くべきことではないのSLB ³⁰におけるGM1のusiveモビリティ。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4インチシリコンウェーハ	大学ウェーハ	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 フォトレジスト	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 開発者	MicroChem	CD-26
i-line ステッパー	キヤノン	2500 i3ステッパー
ビジョン320 反応性イオンエッチング	アドバンスド真空	ビジョン320 RIE
深部トレンチ反応性イオンエッチング	プラズマサーム	SLR-770
原子層形成システム	ケンブリッジ ナノテック	サバンナ
ダウ コーニング シルガード 184 ポリ(ジメチルシロキサン)キット	エルスワース 接着剤	184 SIL エラストキット 0.5KG
卵 ホスファチジルコリン	アバンティ 極性脂質	840051C
1,2-ジパルミトイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-<>N-(リサミンローダミンBスルホニル)アンモニウム塩	アバンティ極性脂質	810158C
モノシアロガングリオシド GM1	アバンティ極性脂質	860065P
シリカビーズ	バングスラボラトリ	ーズ SS03N/4666	ビーズ容器のパッケージには、ビーズの直径が900nmと記載されています。しかし、光散乱と電子顕微鏡の結果、ビーズの直径は約700nmであることがわかりました。
コレラ毒素Bサブユニット、Alexa 488-コンジュゲート	分子プローブ	C-34775
、抗オリゴデントロサイト抗体IgM O4、NorthernLights 557コンジュゲート	R&D Systems	NL1326R
FM1-43	Molecular Probes	T-3136
Eppendorf MiniSpin 遠心分離機	Fisher Scientific	05-401-09