遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

伝統的に、ウイルス発現は、分子生物学技術（ 例えばノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、マイクロアレイハイブリダイゼーション、 等 ^）1を用いて研究されている。これらの方法は個々のmRNAまたはタンパク質の発現の変化を分類に関する詳細な情報を提供することができるが、これらは典型的には、リアルタイムのハイスループットプロセスに適していない。ポックスウイルスを扱うとき蛍光ベースのレポーターを使用して別のアプローチは、以前適用されている。しかし、その開発と使用法は様々な目的が動機とされています。いくつかのそのような方法は、組換えウイルス^の2,3の選択のために設計した。これらの技術は、適切な取り込みおよび組換えワクシニアクローンからの外因性DNAの発現の際に、EGFPを発現する。同様に、いくつかのワク株は、安定的に、可溶性EGFPを発現しているか、ネイティブのワクシニアプロモーター下で発現GFPタグタンパク質は、広く使用されてきた。これらは代表値であるICALLYは、ウイルス侵入および複製抗体ベースの中和アッセイ中に、化学阻害、または抗ウイルス効果^4-6との比較を定量化するために使用される。これらのウイルスは有用であることが証明されてきたが、これらは曖昧なため、単一の初期/後期ウイルスプロモーターのそれらの使用に阻害の点についての詳細な情報を提供する能力が制限されている。以前の方法はまた、次善の信号対雑音特性を有するEGFPタンパク質の使用を行った。

によるポックスウイルスの複製およびウイルス遺伝子発現のリアルタイムの変化をアッセイするために利用できる既存のツールの欠如が複雑であるため、我々は、単一および複数段レポーターウイルス^7,8一式を開発した。以前の刊行物に記載されるように、これらのウイルスは、感染の初期、中間、または後期段階の間に一つ、二つ、または天然のワクシニアプロモーターから三スペクトル的に異なる蛍光タンパク質を発現する。これらのウイルスは、私たちすることができます蛍光顕微鏡を用いてウイルス複製の進行の指標としてオピニオン、それらは、ハイスループットプレート·アンド·リーダーベースのアッセイのために等しく良好に適している。これらのウイルスは、同等の力価が⁷に^到達するために同様の速度論で成長し、野生型ウイルスの代わりに使いやすい。これらのウイルスの計画と作成中に、多くの注意が発現の変化（金星、mCherryとTagBFP）への迅速なフィードバックと信頼性の定量化を容易にするために、優れたフォールディング効率の高い信号対バックグラウンド特性を持つ蛍光プローブを選択する際に撮影された。さらに、ウイルスプロモーターの組み合わせがあいまいとは対照的に、高忠実度、明確な段階特異的発現、早期（C11Rプロモーター）のすべての範囲についての情報を提供して、中間体（G8Rプロモーター）と後期（F17Rプロモーター）の遺伝子発現を生成するものを選択し、初期/後期プロモーター。

これらのウイルスはINVEためのツールと​​して使用することができる原型ポックスウイルス、ワクシニアウイルスのライフサイクルをstigating。多くはまだ研究の長い歴史にもかかわらず、宿主 - ウイルス相互作用に関する知られていない。ワクは免疫調節され、拮抗ホストその多くは200以上のユニークなタンパク質を産生する、複雑です。感染時に、ワクシニアウイルスは、直ちに初期のmRNA転写を開始する。これはビリオン中にパッケージングウイルスゲノム上にロードされ、その後の感染れるまで一時停止状態に保持されたRNAポリメラーゼおよび転写因子によって促進される。この初期の発現は、主に宿主の免疫系（のmRNA脱キャップは、dsRNAの隔離、およびデコイ受容体タンパク質だけでなく、アポトーシスの阻害剤、ストレス応答、およびToll、イリノイ、およびNF-κBシグナル伝達）とゲノム複製の抑制に必要なタンパク質を生成します。初期発現はまた、中間体発現に必要な転写因子を生成する。中間表現は、​​後期転写因子の発現を含む。この発現カスケードは、成熟したワクシニアウイルス粒子の完全なアセンブリのために必要な感染症の後期段階の間の構造的および酵素的ウイルスタンパク質の産生をもたらす。

蛍光レポーターウイルスの私達のセットはポックスウイルス生物学の理解でなされるべき急速な進歩を可能にします。ウイルス学の分野で最も一般的で時間のかかる方法の一つは、増殖アッセイである。これは、典型的には、細胞に感染する感染細胞を溶解することによって治療、収穫ウイルスの系列を制定し、プラークアッセイにより得られたウイルス力価を定量することを含む。ここに記載のレポーターウイルスを使用して、容易にアッセイと並行して行う多数の処置の間で比較することができるウイルス増殖のリアルタイム測定を可能にする。我々は、試薬のセットは、薬物治療、RNAiをkに応じて、ウイルス遺伝子発現の変化を同定するための様々なプロトコルで使用される予見nockdown、又は宿主範囲制限。

また、この方法は、関心のある、具体的に定義されたターゲットのステージのためのハイスループット抗ウイルス薬物スクリーニングを可能にこれまで利用可能なより大きなスケールでの高内容分析を可能にします。ポックスウイルス感染症と戦うために、多数の潜在的な治療は同定されているが、唯一のFDAは、ポックスウイルス感染を治療するための有効な療法を承認した非環状ヌクレオシドホスホネート、シドフォビル、およびワク免疫グロブリン^9,10での処理である。 1977 ¹¹における天然痘の撲滅にもかかわらず、ポックスウイルスは、人間の健康¹²に重大な脅威のまま。天然痘ウイルスに対する広範なワクチン接種の中止は、他のポックスウイルス¹³に対する感受性の増加につながっている。たとえば、以前にワクチン接種により保護されて中央アフリカの領域はサル痘ウイルス感染¹⁴の急増を経験している。重大な懸念もされている天然痘ウイルスの意図的なリリースに潜在感受性に関して提起。により現在利用可能な限られた治療に対する、新規な治療法の開発が急務とされている。これらのレポーターウイルスは、ウイルス複製の特定の段階を阻害するための迅速かつハイスループットな小分子阻害剤のスクリーニングを可能にする。阻害のない現在標的ウイルス発現段階を標的阻害剤の同定は、効力の増加との併用療法の開発を容易にする。

多くの各段の遺伝子発現の変化を観察することによってワクシニア細胞生物学について収集することができる。化学的または感染宿主細胞の遺伝子操作による減衰は、典型的には減少し、ウイルス力価で表現される。しかし、ウイルス発現カスケードの各段階の変化を比較することによって、人は、ウイルス適応度がどのようにインパクトのより完全な理解を得ることができる特定の治療によって編これらのデータは、従来のウイルス力価の出力とよく相関するが、より詳細な機構的情報だけでなく、高いスループット能力^7を提供することが示されている。

1。プレート細胞

1. プレートからHeLa細胞を解離し、約2.0×10 ⁵細胞/ mlに増殖培地（DMEM、2mMのL-過剰、10％FBS）中に希釈する。黒壁、透明な平底96ウェルプレート（20,000細胞/ウェル）に100μl/ウェルを分注する。
2. +5％のCO _2、37℃のインキュベーターでコンフルエントになるまで24時間細胞をインキュベートします。

2。細胞に感染

1. ウイルスを希釈し、細胞に感染する。
   1. 解凍TRPV（トリプルウイルス;早期金星、中間mCherry、後期TagBFP）とPLV（プロモーターのない金星）は、蛍光ウイルス、5分間超音波処理を使用して脱凝集。あるいは、粗ウイルスストックの感染培地中0.25 mg / mlのトリプシンと1:1で混合し、30分間37℃でインキュベートすることができる。
   2. 37℃の感染培地（DMEM、2mMのL-GLUT、2％FBS）中の粗ウイルスストックを希釈する。高MOI感染症（10 PFU /細胞）の場合は、ミリリットル5×10 ⁴と仮定^すると、1.0×10 ⁷ PFU /にウイルスストックを希釈細胞/ウェルおよび50μlの接種量。 TRPVおよび各治療に固有のバックグラウンド蛍光を考慮してPLVと同じ治療のための別の3複製ウェルに各処理について3反復ウェルに感染する計画。
   3. 感染培地に50μl/ウェルに希釈したウイルスを加えることによってウェルに感染。これは、時間= 0時間後に感染（0 HPI）として定義されています。
2. 感染培地に所望の治療化合物を希釈する。すべての処置のための単一2Xマスターミックスの希釈液を作り、井戸を複製するために適用されるべきである（ 例えば 50μlのそれぞれに6 96ウェル350μlの総量）。
   1. 感染培地に実験化合物を希釈する。
   2. 車両制御溶媒（ 例えば 、PBS、DMSO）は、感染培地に希釈します。注：実験化合物に適用されるように、車両制御用溶媒の同様の最終濃度を使用すべきである（ 例えば、あなたのIBTストックはDMSOで製造し、最終concentratioで使用される場合1μLのNSは/ mlの場合、車両制御などの1μL/ ml）を単独で、DMSOを使用しています。
   3. 感染培地に制御する化合物を希釈する。推奨制御化合物としては、β-セミカルバゾン（IBT）イサチン3.6μM（1μg/ ml）を1-β-D-アラビノフラノシルシトシン（AraCの）、50μMの（11.7μg/ ml）を、60μM（50μg/ ml）をリファンピシンを、または5μM（1.9μg/ ml）を、ST-246 ^8,15,16。期待される効果のための代表的な結果を参照してください。注意：これはよく、すでにボリュームに1:1の比率で添加されるので、2倍（2倍）所望の最終濃度この希釈を作る。
3. すぐにウイルスを添加した後に、ステップ2.2に希釈したように、所望の治療とコントロールを含む50μlの感染培地を追加します。注意：初期段階の式の前に阻害についてアッセイするために、化合物は、いずれの希釈ウイルス接種（ステップ2.1.2）に直接追加することができますか（ステップ2.1.3の前に）感染する前に宿主細胞。
4. 37＆＃で6月24日時間インキュベートする176;インキュベーター+ C、5％CO _2。

3。細胞を固定

1. 各ウェルに、既に感染培地に100μlの8％パラホルムアルデヒドを添加することにより、細胞を固定。光から保護して室温で15分間インキュベートする。注意：これは、高力価のメディアが固定前に直接廃棄物皿に反転している場合に発生する可能性の感染性ワクのエアロゾル化を防ぐために、感染のメディアに直接2X PFA（8％）を追加することをお勧めします。
2. 廃棄物の皿にプレートを反転させて固定液を除去します。
3. 室温100μlのPBSを追加。
4. 光学的に透明な接着フィルムでプレートを密封する。注：すぐに読み出されていない場合、プレートを4℃で保存することができる。分光光度計の測定値を歪ま結露を防ぐために、読む前に室温にシールしたプレートを返すようにしてください。

4。ウイルスの増殖を定量化

1. 、金星のために515:53​​0でmCherryため587:610をエンドポイント蛍光を測定し、415:457 FまたはTagBFP（励起：NM発光波長）。 4つの測定は、各チャネルの最適化された利得設定を用いて、ウェル当たり平均化されるべきである。注：適切な発光波長は、プレートリーダーの特定のモデル、フィルタ特性に応じて異なっていてもよい。これは、各チャネルのTRPVおよびPLV間の最大差がある点を決定するために、発光波長スキャンを実行することによって経験的に決定することができる。
2. 実験間の比較を容易にするために生データを正規化する。
   1. 各チャンネル毎に、複製TRPVおよびPLVウェルの平均を決定する。
   2. それぞれの治療のための平均TRPV感染実験測定からの平均PLV感染背景測定値を減算します。
   3. よく車専用の値によって各バックグラウンドを差し引いた値で割って、データを正規化します。
   4. 実験は複数回、一元配置分散分析（一元配置ANOVA）試験および複数cと繰り返された後omparisonポストテストは、治療のいずれかが各チャネルのビヒクルのみの治療統計学的に有意な差を反映しているかどうかを決定するために行うことができる。

5代替プロトコル：キネティックプレートアッセイ

1. 処理（ステップ2.3）を添加して、すべての手順を実行します。
2. 37℃に平衡化プレートリーダーチャンバ内の接着フィルムと場所とシールプレート注：特別な注意は、過度の細胞ストレスおよび結露を防ぐために、一貫して37℃でプレートを維持するために注意する必要があります。動的アッセイのために、5％のCO ₂を添加せずに適切なpHを維持する緩衝培地（炭酸水素ナトリウムおよびHEPES）を使用することが特に重要である。
3. 後の時点での飽和を防ぐために、手動でプレートリーダーゲインを設定する。注：正確な利得の最適化は、同様の条件下で、エンドポイントアッセイを行うことによって得ることができる。
4. 8月24日HPI 1時間ごとの測定値を取得し、シミを使用して正規化エンドポイントアッセイ（ステップ4.2）のように、LARの手順。
5. 個々の時点は、前述の終点アッセイと同様の方法を用いて統計的有意性について分析することができる。

これらのウイルスの典型的な使用法の一例として、三重蛍光レポーターウイルスは、いくつかの明確に定義されたポックスウイルス阻害剤の阻害の点を比較した。

HeLa細胞を、黒色壁透明平底96ウェルプレートを処理し、一晩培養し、組織培養にプレーティングした。プレートマップ（ 図1）に詳述されるように、またはプロモーターのないビーナス（PLV）、コンフルエントな単層を三重レポーターウイルス（ 表1 TRPV）のいずれかを用いて、10の感染多重度（MOI）で感染させた。治療を含む感染培地を0.1％DMSOの最終濃度を得るために添加し、3.6μM（1μg/ ml）をのAra​​C、50μM（11.7μg/ ml）をIBT、5μM（1.9μg/ ml）を、ST-246、または60μM三重で（50μg/ ml）をリファンピシン。全てのストックをDMSO中1μlの/ mlで使用した阻害するので、0.1％DMSOをビヒクル対照として使用した。プレートは37℃incubatoに戻したR 18 HPI時まで。細胞をすべてのウェルに100μlの8％PFAを添加することによって15分間固定し、PBS中に保存したプレートリーダーで読むまで、光から保護した。 515:53​​0の発光波長、587:610、金星のため415:457程度：蛍光読み取りは、励起にウェル当たりボトム読ん4ポイントテカンインフィニットM1000プレートリーダーとI-制御ソフトウェア（v1.5.14.0）を用いて実施したそれぞれ、mCherry、およびTagBFPフルオロフォア、。最終的な測定の前に、ゲイン（利得はそれぞれ、通常は赤、緑、青の測定のための235、255、235だった）センサーが飽和することなく最大限の信号を可能にするために最適化された。

図1の96ウェルプレート上の感染および薬物治療の代表的なレイアウト。96ウェルプレート感染およびcrのに使用される小分子添加スキームのダイアグラム代表的な結果を食べる。トリプル蛍光ウイルス（TRPV、明るいグレー）初期の金星、中間mCherry、後半TagBFPまたはプロモーターのない金星（PLV、濃い灰色）を発現する三重の列で使用されています。 1-β-D-アラビノフラノシルシトシン（AraCの）、β-セミカルバゾン（IBT）イサチン、リファンピシン、ST-246とDMSO車両制御試験した濃度で右に示されています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

各反復の相対蛍光単位（RFU）は、各チャネルの正規化した。まず、PLVウェルの平均蛍光強度は、各薬物が寄与するバックグラウンド強度を考慮するために、各治療のためのTRPVウェルの平均強度から差し引いた。次に、この値は、DMSO処理したTRPVウェルの平均強度（野生型増殖）を減算し、バックグラウンドで割った。既知のPOで処理した後に得られた結果xvirus阻害剤は、以前に発表さ調査結果とそれらの作用機序を理解と一致していた。初期遺伝子の転写および中間体の遺伝子発現への移行の停止は、DNAの複製17を必要とすることが示されている。 0.4％（中間および後期発現の完全な欠如及びDMSO 0.3％を処理し、これと一致して、AraCは、DNA複製の阻害剤は、初期遺伝子発現（ 図2 DMSO処理された初期発現210％）の劇的な増加を示したそれぞれの中間と後期表現; 図2）。正確な作用機構はIBTで定義されていないけれども、dsRNAは、RNアーゼLおよびアポトーシス経路の活性化は18〜20の量の増加をもたらすリードスルー転写を促進すると考えられている。 IBTの治療を受けて徐々に深刻な表現型は、中期および後期式はDMSOのみ（24.7％よりも有意に少ないされた観察されたそれぞれの中間と後期発現治療のDMSO 2.9％; 図2）。一貫性のあるではなく、統計的に有意な減少、早期の蛍光も観察された。しかし、この可能性が高いため、この後の時点（18 HPIでDMSOの74.0パーセント）でIBT誘導性アポトーシスへ。のAraCとIBTとは対照的に、ポックスウイルス薬のST-246とリファンピシンの両方がビリオンアセンブリおよび成熟15,16の間の後期遺伝子発現の後に阻害する。またはリファンピシン（107.6パーセント、;細胞は、ST-246（ 図2はそれぞれ100.9パーセント、98.5パーセント、早期治療のDMSO 94.5％、中間及び後期式）のいずれかで処理した場合に遺伝子発現の変更は、すべての段階では見られなかったそれぞれ104.2パーセント、早期治療のDMSO 106.5パーセント、中期および後期式）。

。。代表的な結果のセクションで説明したようにオング>図2ポックスウイルス薬により生じる阻害のステージHeLa細胞を感染させ、処理したA）RFU（相対蛍光単位を示すチャート、背景はそれぞれの治療のためにPLVの成長に基づいて、各チャンネルを減算し、正規化された初期（緑TRPV + DMSO））に、中間体（赤）、後期（青）、ウイルス発現。細胞は、0〜18 HPIのため、示された化合物の存在下で増殖させた。標準偏差が平均は、それぞれが三連で行っ4の生物学的複製のために示されている。 18 HPIの各ウェル治療（*** P <0.0005を、* p <0.05）を1サンプルt検定は、各治療及びDMSOチャネルペアごとに実施し、統計的に有意な差はアスタリスクでマークされています。B）画像。すべての画像はツァイス200Mエピ蛍光顕微鏡と同様にスケールされたエクスポージャーに10倍の対物レンズで撮影した。スケールバー=100μmである。files/ftp_upload/51522/51522fig2highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

新しい小分子またはウイルス変異体の阻害効果を探索する際に、歴史的に、低いMOI（0.01〜0.1 PFU /細胞）および高MOIの組み合わせは、（5〜10 PFU /細胞）増殖アッセイが使用される。細胞のサブセットのみが最初に感染していることから、低MOIで、全体的な抑制効果は、多くの場合であっても軽微な阻害によって誇張されている。ウイルスが抑制される感染サイクルの間にポイントを定義しようとすると、すべてのセルがプライマリ接種物に感染しているように、高MOI感染は、おそらくより適切である。 図3に示される実験は、低級MOI = 1で感染させたウェルの組を加えて図2のように行った。転写後に機能阻害剤のように、ST-246は、遺伝子発現の任意の段階に影響を与えるべきではない;しかし、時の細胞のサブセットのみがinfecteであることが明らかであるD（ 図3、MOI = 1）の式のすべての段階（38.4％、48.9％、および100.9パーセント、98.5％、およびMOIのための94.5％と比較して、DMSOを52.9％の見かけの阻害がある= 1対MOI = 10それぞれ、初期の中間と後期式の感染レベル; 図3）。 ST-246による成熟ビリオン形成の100％阻害を仮定すると、これは10感染、および細胞のどこかで50〜70％が生産的にMOI = 1感染中に感染させたが= 100％の細胞をMOIに感染したことを意味する。

図3明らかなST-246の阻害に対する感染レベルの効果。ST-246で処理したハイ（MOI = 10）及び低（MOI = 1）TRPV両方と図2のように感染させたHeLa細胞。相対蛍光単位（RFU、背景は、各チャネルベースの​​Oを差し引いN PLVの早期（緑TRPV + DMSOに各処理及び正規化された）の成長）、中間（赤）、後期（青）MOI = 1またはMOIのいずれかで感染した細胞中のウイルスの発現は、10を=と20μMのST-で処理246。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

表1：ワクシニアウイルスレポーター株の一覧表蛍光レポーターウイルスを記述する。

著者らは、開示することは何もないし、何の特許は、ウイルスやスクリーニング法のために保留されていません。