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ヒト多能性幹細胞(hPSCs)は皿にヒト疾患をモデル化するためと病気や事故後の再生アプリケーション用の移植可能な細胞の供給源として、人間の胚発生を研究するための大きな可能性を秘めている。神経冠(NC)細胞は、末梢神経系およびグリア、メラノサイトおよび間葉細胞からの細胞などの成体の体細胞の多種多様のための前駆体である。彼らは、細胞運命の仕様および移行を含むヒト胚発生の側面を研究する細胞の貴重な情報源である。最終分化した細胞型へNC前駆細胞のさらなる分化は、 インビトロでのヒト疾患をモデル化する病気のメカニズムを調査し、再生医療用の細胞を生成する可能性を提供する。この記事ではhPSCsからNC細胞の誘導のために現在利用可能なin vitroでの分化プロトコルの適応を提示します。この新しいプロトコルは、diffeの18日間を必要とするrentiationは、フィーダーを含まない、ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞)ラインだけでなく、人間の人工多能性幹細胞(hiPSC)ラインのうち、容易に拡張性の高い再現性がある。新旧両方のプロトコルが同じアイデンティティのNC細胞を得る。
ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、良好な動物モデルでも、一次組織のいずれもが利用可能なヒト疾患の研究および将来の治療のための、特に、巨大な可能性を示している。ヒトES細胞/ hiPSC技術の応用例としては、以下の通りである:特定の目的の細胞は無制限数量1で、再生医療のためのhESC / hiPSCsから生成することができます。細胞は、特定の疾患を有する患者から製造し、インビトロ疾患モデル2,3 に確立するために使用することができる。このような疾患モデルは、新しい薬剤化合物の探求4並びに有効性および毒性5のための既存の薬物の試験に大規模な薬物スクリーニングに用いることができる。 インビトロ疾患モデルは、新規な病気のメカニズムの同定につながる可能性がある。ヒトES細胞/ IPSC技術のすべてのアプリケーションに対して、特定と連携することが重要で、よく定義関心対象の疾患において影響d個の細胞タイプ。このように、固体で再現性のin vitroでの分化プロトコルの利用可能性は、ヒトES細胞/ hiPSC技術のすべてのアプリケーションのために重要である。プロトコルは、ヒトES細胞/ hiPSCラインと異なる研究者間の最小の変動、時間費用、労力、難しさやコストだけでなく、最大の再現性を示すことが望ましい。
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1。培養培地、コーティングされた料理とhPSCsのメンテナンスの調製
1.1メディアの準備
注:最大2週間、暗所で4℃で殺菌し、ストアのすべてのメディアをフィルタリングします。試薬名、会社とカタログ番号は、 資料の表に記載されている。
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MS5-R-NCプロトコル11上のR-NCプロトコルの二つの最も重要な改善は、フィーダーを含まない、定義された分化条 件と時間の要件の全体的な短縮である。 MS5フィーダー細胞13は hESCの14から神経分化を支持することが示されているマウス骨髄由来間質細胞である。 hESCを従って、初期のヒト神経発生を模倣する、NC細胞を、10現れるそれらの周囲に、低密度フォーム上皮構造及び神経ロゼット15でMS5フィーダー細胞上で培養した。しかし、MS5フィーダー細胞から放出されるシグナル伝達分子とどのような成長因子は明らかではない。したがって、分化条件はあまりことが困難再発性実験及びHPSC線を横切って、それらを再生すること、定義されている。適切な神経誘導のために、ヒトES細胞は、MS5フィーダー細胞上に小さなコロニーに低密度で播種しなければ合併症を持っているティンスケールアップし、分化した細胞の高収量に達した。 2009年には、この方法は非常に効率的に12を hPSCsをneuralizingことを目的とし.......
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ヒトES細胞/ hiPSCsからのR-NC細胞の正常な分化のために、次の点に注意して行ってください。これは、常に無菌培養条件の下で動作することが重要である。特に、この汚染が成功分化の妨げになることから、定期的にマイコプラズマ汚染のためHPSC培養をテストすることが重要ですが、容易にHPSC培養で視覚的に検出することができません。 R-NC分化が90〜100%の細胞密度で開始されるべきである;低い細胞密度、細胞生存およびR-NC分化の効率に影響を与える。これは、経験的に、効率的なNC分化を支援するための特定のKSRに、最適濃度および試薬の一部のロット番号を検証することが重要です。細胞が液滴中11日目に再播種される場合、10μlの液滴内の細胞密度が高くあるべきであり、最高の経験的に決定される。適切なロゼットとNC-形成は、液滴中の適切な細胞密度に依存します。私たちは、obserを経験的に細胞をAccutaseを用いた治療後に少なくとも二回洗浄されたときVEDは、細胞生存を増加させた。 FACSによるR-NC細胞の正常な分離のためにこのような染色染色していない、単一の抗体および二次抗体のみ染色された細胞などの適切な実験のコントロールは、非常に.......
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著者らは、開示することなく、競合する利害関係はありません。
そしてトライ制度幹細胞イニシアチブ(スター財団);この作品は、スイス国立科学財団からNYSTEM(C026447 C026446)からの補助金を通じて先進的な研究者のためのフェローシップでサポートされていました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| 牛胎児血清 (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| ノックアウト血清交換 | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | ロットは試験すべき |
| L-グルタミン | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| ペニシンリン/ストレプトマイシン | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM 最小必須アミノ酸溶液 | ギブコ・ライフ・テクノロジーズ | 11140-050 | |
| β-メルカプトエタノール | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 毒性 |
| 組換えヒト FGF 基本 (FGF2) | R&Dシステム | 233-FB-001MG / CF | |
| ノックアウトDMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM / F12パウダー | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| 重炭酸ナトリウム | Sigma | S5761 | |
| APOヒトトランスフェリン | Sigma | T1147 | |
| ヒトインスリン | Sigma | I2643 | |
| プトリシン二塩酸塩 | Sigma | P5780 | |
| 亜セレナイト | Sigma | S5261 | |
| プロゲステロン | Sigma | P8783 | |
| マトリゲル基底膜 | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L オルニチン臭化水素酸塩 | Σ | P3655 | |
| マウス ラミニン-I | R&アンプ;D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 二塩酸塩 | Tocris-R&Dシステム | ズ1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&Dシステム | ズ1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| アスコルビン酸 | シグマ | A4034 | |
| BDNF | R&Dシステムズ | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| マウス組換えソニックヘッジホッグ (SHH) | R&Dシステム | ズ464SH | |
| HBSS | ギブコライフテクノロジー | ズ14170-112 | |
| HEPES | ギブコライフテクノロジー | ズ1563-080 | |
| ヒト組換えEGF | のR&Dシステム | 236EG | |
| ゼラチン(Mg / CaなしのPBS) | 社内 | ||
| 抗体: | |||
| 抗HNK-1 / N-Cam(CD57)mIgM | シグマ | C6680-100TST | ロットをテストする必要があります |
| 抗p75 mIgG1(神経成長因子受容体) | 高度なターゲティングシステム | AB-N07 | ロットは、 |
| APCラット抗mIgM | BDをテストする必要がありますパルミンゲン | 550676 | ロットは、 |
| AlexaFluor 488ヤギ抗マウスIgG1 をテストする必要があります。 | Invitrogen | A21121 | ロットは試験する必要があります |
| 抗Oct4 mIgG2b(1:200希釈で使用) | Santa Cruz | sc-5279 | ロットを試験する必要があります |
| 材料/機器: | |||
| マウス胚性線維芽細胞(700万細胞/バイアル) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| 細胞培養皿:10 cmおよび15 cmプレート、遠心チューブ、FACSチューブ、 ピペット、ピペットtips | |||
| ガラス血球計算盤 | |||
| 細胞培養遠心分離機 | |||
| 細胞培養インキュベーター (CO2, 湿度・温度制御) | |||
| 顕微鏡内蔵 | |||
| 細胞培養バイオセーフティフード | |||
| 細胞選別機 i.e. MoFlo | |||
| 倒立顕微鏡 | |||
| 1ml TB シリンジ 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter ポリエチレン | Corning Incorporated | 3008 |
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