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方法論記事

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

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DOI:

10.3791/51609

2014年5月22日

この記事について

サマリー

神経堤ヒト多能性幹細胞に由来する(NC)細胞(HPSC)は、ヒトの発生および疾患をモデル化し、細胞置換療法のための大きな可能性を有する。ここでは、現在広く使用されているのフィーダーフリー適応 in vitroで hPSCsからNC細胞の誘導のための分化プロトコルが提示される。

要約

ヒト多能性幹細胞(hPSCs)は皿にヒト疾患をモデル化するためと病気や事故後の再生アプリケーション用の移植可能な細胞の供給源として、人間の胚発生を研究するための大きな可能性を秘めている。神経冠(NC)細胞は、末梢神経系およびグリア、メラノサイトおよび間葉細胞からの細胞などの成体の体細胞の多種多様のための前駆体である。彼らは、細胞運命の仕様および移行を含むヒト胚発生の側面を研究する細胞の貴重な情報源である。最終分化した細胞型へNC前駆細胞のさらなる分化は、 インビトロでのヒト疾患をモデル化する病気のメカニズムを調査し、再生医療用の細胞を生成する可能性を提供する。この記事ではhPSCsからNC細胞の誘導のために現在利用可能なin vitroでの分化プロトコルの適応を提示します。この新しいプロトコルは、diffeの18日間を必要とするrentiationは、フィーダーを含まない、ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞)ラインだけでなく、人間の人工多能性幹細胞(hiPSC)ラインのうち、容易に拡張性の高い再現性がある。新旧両方のプロトコルが同じアイデンティティのNC細胞を得る。

概要

ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、良好な動物モデルでも、一次組織のいずれもが利用可能なヒト疾患の研究および将来の治療のための、特に、巨大な可能性を示している。ヒトES細胞/ hiPSC技術の応用例としては、以下の通りである:特定の目的の細胞は無制限数量1で、再生医療のためのhESC / hiPSCsから生成することができます。細胞は、特定の疾患を有する患者から製造し、インビトロ疾患モデル2,3 確立するために使用することができる。このような疾患モデルは、新しい薬剤化合物の探求4並びに有効性および毒性5のための既存の薬物の試験に大規模な薬物スクリーニングに用いることができる。 インビトロ疾患モデルは、新規な病気のメカニズムの同定につながる可能性がある。ヒトES細胞/ IPSC技術のすべてのアプリケーションに対して、特定と連携することが重要で、よく定義関心対象の疾患において影響d個の細胞タイプ。このように、固体で再現性のin vitroでの分化プロトコルの利用可能性は、ヒトES細胞/ hiPSC技術のすべてのアプリケーションのために重要である。プロトコルは、ヒトES細胞/ hiPSCラインと異なる研究者間の最小の変動、時間費用、労力、難しさやコストだけでなく、最大の再現性を示すことが望ましい。

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プロトコル

1。培養培地、コーティングされた料理とhPSCsのメンテナンスの調製

1.1メディアの準備

注:最大2週間、暗所で4℃で殺菌し、ストアのすべてのメディアをフィルタリングします。試薬名、会社とカタログ番号は、 資料の表に記載されている。

  1. DMEM/10%FBS:DMEM 885ミリリットル、100ミリリットルのFBS 10mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび5mlのL-グルタミンを組み合わせる。
  2. HES-培地:DMEM/F12 800ミリリットル、200ミリリットルKSR 5mlのL-グルタミン5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを10mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液1mlのβ-メルカプトエタノールを組み合わせる。メディアをフィルタリングした後に10 ng / mlのFGF-2を追加します。
    注意:β-メルカプトエタノールは毒性が、吸入、経口摂取、皮膚接触を避ける。
  3. KSR-分化培地:820ミリリットルノックアウトDMEM 150mlのKSR 10mlのL-グルタミンを10mlのペニシリン/ストレプトマイシンを10mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液、1mlのβ-メルカプトエタノールを組み合わせる。
  4. N2-differentiati培地上:1.55グラムのグルコース、2グラム重炭酸ナトリウムおよ....

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結果

MS5-R-NCプロトコル11上のR-NCプロトコルの二つの最も重要な改善は、フィーダーを含まない、定義された分化条 ​​件と時間の要件の全体的な短縮である。 MS5フィーダー細胞13は hESCの14から神経分化を支持することが示されているマウス骨髄由来間質細胞である。 hESCを従って、初期のヒト神経発生を模倣する、NC細胞を、10現れるそれらの周囲に、低密度フォーム上皮構造及び神経ロゼット15でMS5フィーダー細胞上で培養した。しかし、MS5フィーダー細胞から放出されるシグナル伝達分子とどのような成長因子は明らかではない。したがって、分化条件はあまりことが困難再発性実験及びHPSC線を横切って、それらを再生すること、定義されている。適切な神経誘導のために、ヒトES細胞は、MS5フィーダー細胞上に小さなコロニーに低密度で播種しなければ合併症を持っているティンスケールアップし、分化した細胞の高収量に達した。 2009年には、この方法は非常に効率的に12を hPSCsをneuralizingことを目的とし.......

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ディスカッション

ヒトES細胞/ hiPSCsからのR-NC細胞の正常な分化のために、次の点に注意して行ってください。これは、常に無菌培養条件の下で動作することが重要である。特に、この汚染が成功分化の妨げになることから、定期的にマイコプラズマ汚染のためHPSC培養をテストすることが重要ですが、容易にHPSC培養で視覚的に検出することができません。 R-NC分化が90〜100%の細胞密度で開始されるべきである;低い細胞密度、細胞生存およびR-NC分化の効率に影響を与える。これは、経験的に、効率的なNC分化を支援するための特定のKSRに、最適濃度および試薬の一部のロット番号を検証することが重要です。細胞が液滴中11日目に再播種される場合、10μlの液滴内の細胞密度が高くあるべきであり、最高の経験的に決定される。適切なロゼットとNC-形成は、液滴中の適切な細胞密度に依存します。私たちは、obserを経験的に細胞をAccutaseを用いた治療後に少なくとも二回洗浄されたときVEDは、細胞生存を増加させた。 FACSによるR-NC細胞の正常な分離のためにこのような染色染色していない、単一の抗体および二次抗体のみ染色された細胞などの適切な実験のコントロールは、非常に.......

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開示事項

著者らは、開示することなく、競合する利害関係はありません。

謝辞

そしてトライ制度幹細胞イニシアチブ(スター財団);この作品は、スイス国立科学財団からNYSTEM(C026447 C026446)からの補助金を通じて先進的な研究者のためのフェローシップでサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMGibco-Life Technologies11965-092
牛胎児血清 (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
DMEM/F12Gibco-Life Technologies11330-032
ノックアウト血清交換Gibco-Life Technologies10828-028ロットは試験すべき
L-グルタミンGibco-Life Technologies25030-081
ペニシンリン/ストレプトマイシンGibco-Life Technologies15140-122
MEM 最小必須アミノ酸溶液 ギブコ・ライフ・テクノロジーズ11140-050
β-メルカプトエタノール Gibco-Life Technologies21985-023毒性
組換えヒト FGF 基本 (FGF2)R&Dシステム233-FB-001MG / CF
ノックアウトDMEMGibco-Life Technologies10829-018
DMEM / F12パウダー Invitrogen12500-096
GlucoseSigmaG7021
重炭酸ナトリウム SigmaS5761
APOヒトトランスフェリンSigmaT1147
ヒトインスリン SigmaI2643
プトリシン二塩酸塩SigmaP5780
亜セレナイトSigmaS5261
プロゲステロンSigmaP8783
マトリゲル基底膜BD Biosciences354234
Poly-L オルニチン臭化水素酸塩ΣP3655
マウス ラミニン-IR&アンプ;D Systems3400-010-01
FibronectinBD Biosciences356008
Hank's Balanced Salt Solution 5 U/mlStem Cell Technologies7013
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 二塩酸塩Tocris-R&Dシステムズ1254
LDN193189Stemgent04-0074
SB431542Tocris-R&Dシステムズ1614
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
アスコルビン酸 シグマA4034
BDNFR&Dシステムズ248-BD
FGF8R&D Systems423-F8
マウス組換えソニックヘッジホッグ (SHH)R&Dシステムズ464SH
HBSSギブコライフテクノロジーズ14170-112
HEPESギブコライフテクノロジーズ1563-080
ヒト組換えEGFのR&Dシステム236EG
ゼラチン(Mg / CaなしのPBS)社内
抗体:
抗HNK-1 / N-Cam(CD57)mIgMシグマC6680-100TSTロットをテストする必要があります
抗p75 mIgG1(神経成長因子受容体)高度なターゲティングシステムAB-N07ロットは、
APCラット抗mIgMBDをテストする必要がありますパルミンゲン550676ロットは、
AlexaFluor 488ヤギ抗マウスIgG1 をテストする必要があります。InvitrogenA21121ロットは試験する必要があります
抗Oct4 mIgG2b(1:200希釈で使用)Santa Cruzsc-5279ロットを試験する必要があります
材料/機器:
マウス胚性線維芽細胞(700万細胞/バイアル)GlobalStemGSC-6105M
細胞培養皿:10 cmおよび15 cmプレート、遠心チューブ、FACSチューブ、 ピペット、ピペットtips
ガラス血球計算盤
細胞培養遠心分離機
細胞培養インキュベーター (CO2, 湿度・温度制御)
顕微鏡内蔵
細胞培養バイオセーフティフード
細胞選別機 i.e. MoFlo
倒立顕微鏡
1ml TB シリンジ 27Gx1/2BD Biosciences309623
Cell lifter ポリエチレンCorning Incorporated3008
ズ細胞培養層流フード

参考文献

  1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.

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再版と許可

タグ

FACS HNK 1 p75 Poly L ornithine N2