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方法論記事

生きたマウスにおける大腿骨髄吸引

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DOI:

10.3791/51660

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2014年7月5日

 ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Department of Medicine, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center

この記事について

サマリー

このプロトコルは、マウスを犠牲にすることなく大腿骨骨髄(BM)の連続サンプリングの手順を説明しています。この手順により、マウスのBM組成の経時的な縦断的研究が容易になり、ex vivoおよび移植研究のためにBM内の細胞への連続アクセスが可能になります。

要約

骨髄(BM)の細胞組成の連続サンプリングは、臨床血液学にとって重要な日常的な手順です。このプロトコルは、BMに存在する細胞の連続的な特性評価を可能にする生きたマウスでの類似の手順の詳細な段階的な技術的手順を説明しています。この手順は、例えば異種移植研究で行われるような、マウスのBM内の外因的に投与された細胞の存在を検出することを目的とした研究を容易にする。さらに、この手順により、造血幹細胞や前駆細胞(HSPC)などのBMに富む細胞をマウスを犠牲にすることなく、検索および特性評価を行うことができます。末梢血の細胞組成が必ずしも骨髄に存在する幹細胞および前駆細胞の割合および種類を反映しているわけではないことを考えると、マウスの終結を必要とせずにこのコンパートメントへのアクセスを提供する手順は非常に有用である。ここでは、骨髄細胞の細胞学的分析、造血幹/前駆細胞コンパートメントのフローサイトメトリー特性評価、および従来の骨髄採取と比較した大腿骨BM吸引によって得られた選別されたHSPCの培養に、大腿骨骨髄吸引の使用が示されています。

概要

すべての血液細胞は造血幹細胞(HSC)に由来します。マウスやヒトのHSCの大部分を占める部位である骨髄(BM)へのアクセスを可能にする手技は、動物の犠牲を必要とせずに、造血の原因を連続的に監視するためのリソースを提供します。ここで説明する手順の全体的な目標は、マウスの犠牲を通じてBM細胞の従来の収穫によって回収される細胞を代表する材料を提供する、生きたマウスの大腿骨からのBM細胞のサンプリングのための詳細なプロトコルを提供することである。従来のBM細胞の採取に対するこの手順の利点は、この手順がマウスの犠牲を必要としないため、マウスの骨髄コンパートメントの経時的な研究を可能にすることです。

このマウス骨髄吸引術は、多くの研究で使用され、以前にも説明されていますが(Sundberg et al. 歴史的レビュー1) の場合、この手法を説明する正式な段階的な手順は以前に公開されていません。このプロトコルは、マウスに外因的に導入された細胞のBMの生着を評価する(例えば、異種移植研究で行われるように)(例えば2,3)、末梢血のそれと比較するためのBMのキメラ現象の分析(結果が必ずしも一致しない場合)、造血幹細胞や前駆細胞などの骨髄に通常濃縮される特定の細胞タイプの存在量のモニタリングなどの目的で、BMの定期的な連続サンプリングを可能にします。 ex vivo培養および/または移植のためのBM細胞の回収。さらに、骨髄内容物の評価は、末梢血3-5で疾患が明らかでない可能性のある時点での血液疾患の負担を評価するのに役立つため、血液疾患のマウスモデルで非常に役立つ可能性があります。さらに、この手法は、治療研究で投与された薬物に対する骨髄内の血液疾患の反応を評価するために使用できます。したがって、ここで説明する手順は、マウスへの犠牲や害を必要とせずに、細胞学的分析、フローサイトメトリー分析、in vitro培養、および/またはin vivo移植研究のためにマウスから骨髄造血細胞へのアクセスを取得したい研究者にとって理想的です。

ここで述べられているBMのサンプリングのプロトコルは、骨髄腔内に直接材料を注入するために使用される技術と非常によく似ています3,6。主な違いは、このプロトコルは、大腿骨内注射のように骨髄腔腔に直接材料を注入するのではなく、骨髄から細胞を除去するための手順を詳述していることです。

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プロトコル

このプロトコルで説明されているすべての動物の手順は、実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施された、メモリアルスローンケタリングがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUCs）により承認された。

大腿骨から骨髄の1。吸引（BM）細胞

  1. 精密気化器を用いて投与イソフルラン（1-4％）で大腿骨髄穿刺を受けるマウスを麻酔。麻酔の深さは、外科的処置および/または耳、足指、および尾部ピンチに関連付けられた呼吸数に変化がないことを観察することによって、プロシージャ中のあらゆる5〜10分を監視すべきである。麻酔はイソフルランで誘導し、また、イソフルランによる手順を通して維持されている。 0.05〜0.1ミリグラムの用量でブプレノルフィンの先制事前手続き線量は/ kgを皮下に、すべての6から12時間は、ADJのような手順に関連する痛みを防止するために使用することができますカルプロフェンにUNCT。
  2. 角膜の乾燥を防ぐために、麻酔の導入後のマウスの眼に眼軟膏を適用します。
  3. 毛皮を慎重に意図された吸引部位の面積よりも約150％大きく皮膚の領域から切り取られます。緩い毛皮は、湿ったガーゼパッドを用いて除去する。手順の間に低体温症を防ぐために、循環温水パッドまたは他の安全なサーモスタット制御された表面上でマウスを保管してください。
  4. （ポビドンヨード（ベタジン）またはクロルヘキシジン（Nolvasan）スクラブと70％イソプロピルアルコール、70％エタノールに浸したガーゼスポンジのいずれかと交互に）スクラブが交互に3組の吸引を受ける大腿骨を含む足全体を消毒する。
  5. BMを吸引する前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄：;：0.5ミリリットルツベルクリンシリンジ（27.5 Gゲージ0.5ccの体積）を濡らす。のPBS 200〜500μlの注射器を記入し、すぐに、PBSを追放。 2〜3トンにこの手順を繰り返しますのIME。
  6. 薬指や小指のいずれかで脛骨を押すことによって大腿骨から脛骨を曲げておく。適切な麻酔面が達成されたことを確認してください。シリンジを親指と人差し指を使用して保持される。これは、顆を露出させることを可能にし、針の挿入を容易にする。
  7. 針が大腿骨の2顆の間でセキュアに提出されるように、注射器を湿らせた後、膝蓋腱を通して針を挿入します。親指と人​​差し指で、大腿骨の骨端に近い骨幹を保持することによって、針は簡単に大腿骨のシャフトに挿入されている。
  8. それは大腿骨の軸に平行になるように外向き、上向き針を旋回さ。このアクションは、大腿骨シャフトからの骨髄の内容の検索を容易にします。
  9. 大腿骨髄腔にゆっくりと押しながら、針を時計回りと反時計回りに回します。優しくSYを移動して、針の正確な位置決めを確認横方向にringe。
  10. BMキャビティ内に前後に針を移動させながら、優しく、負圧にする、後針プランジャーを引く。注：BM吸引量は、一般的に0.4〜0.8×10 6の単核細胞に相当し、約5μLになります。成功吸引は注射器の基部に針の上での血液の出現によって、視覚的に確認される。まだ血液がシリンジ内に見られない場合、それは小さな骨または組織片が針に貼り付けられている可能性がある。これは、（これはシリンジBM吸引する前にPBSで予め充填されるべきである1つの理由で）PBSで上下プランジャを移動させることにより、針から除去することができる。組織がシリンジから外れできない場合は、新しい針と注射器を（再びのPBS 200〜500μlの注射器を濡らし）を使用します。
  11. BMが正常大腿骨から吸引された後、大腿骨やマウスから針と注射器を取り外します。
  12. マイクロチューブPRに吸引BMを移動500μlのPBSでefilled。ほとんどのアプリケーションでは、BM細胞を、可能であればさらなる処理まで氷上で保存する。
  13. 手続きの完了に続いて、5 mg / kgの皮下カルプロフェンと鎮痛剤を投与し。その後、麻酔からマウスを削除し、完全に回復するまで加熱パッドの上に置きます。注記：正しく行われれば吸引手順に従って経験しない合併症や苦痛があってはならない。
  14. 住宅エリアにマウスを返す前に、彼らが歩き回ると食料や水に到達できることを確認してください。次の24時間での苦痛や感染後の手続きの兆候マウスを観察します。兆候としては、以下が挙げられる：定数出血、貧血、無気力を。これらの徴候のいずれかが後の手順を見ている場合は、動物（S）は、安楽死させなければならない。注：BM吸引/サンプリングを繰り返すことができるが、反復手順は同じ脚に繰り返される外傷を防ぐために反対側の大腿骨に対して行われるべきである。 FRに関する入手可能な情報はほとんどないBM吸引を行うことができるequency。大腿骨髄穿刺は、一般的にこれ以上の頻度で2週間ごとよりも繰り返される。

吸引しBM細胞における細胞含有量の2。評価

  1. 4 O Cまたは室温で5分間300×gで遠心分離することによりマイクロチューブ内のBM吸引や場所から検索された細胞をペレット化。
  2. 上清を吸引してから、ACK赤血球細胞溶解バッファー（「塩化アンモニウムカリウム「溶解バッファー）500μl中にペレットを再懸濁します。
  3. 10分間、赤血球溶解緩衝液中で細胞をインキュベートし、次いで1mlのPBSを添加し、4°Cの 、またはRTで5分間300×gで再び混合物をスピンダウンする。注意：赤血球を溶解ペレットは現在のBM単核細胞で構成されています。これらは、（屠殺したマウスから採取BM細胞が使用されるのと同様に）FACS染色、細胞計数、移植、サイトスピン分析および/または任意の他の使用のために再懸濁させることができる。

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結果

ライブC57/B6マウスの大腿BM吸引犠牲後の同じマウスのBM従来の収穫に続くBM単核細胞を得るために利用された。 2つの方法によって得られたBM単核細胞を、次いで、BM細胞（1）細胞学的分析によって分析し、（2）造血幹/前駆細胞の相対頻度（HSPCs）を決定し、ソートHSPCs（3）ex vivoで培養した。後者の実験では、系統陰性のSca1 + C-KIT +（LSK）細胞は、骨髄吸引によってだけでなく、従来のBMの収穫から得た単核細胞から選別した。各方法で得られた150 LSK細胞を、次いで、技術的連で7日間骨髄赤血球サイトカインを含むメチルセルロース半固体培地に播種した。 図1のAに示すデータは、Bは、バルク細胞およびHSPCs類似のタイプおよび比率は、大腿BM吸引または従来のBMの収穫のいずれかを用いて形態学的およびフローサイトメトリー分析によって見られたことを示している。

定量的に大腿骨髄吸引対従来の骨髄採取で見LSKおよび骨髄前駆細胞の割合を決定するために、我々は3つの独立した願望と、...

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ディスカッション

シリアルのBM吸引は、ヒトの血液疾患の臨床研究に不可欠な日常的な手順である。長時間の実験を通して、BMの細胞組成および成分の特徴付けマウスでは、BMの類似シリアルサンプリングを実行する能力は、同様に非常に貴重なものです。この手順では、マウスを犠牲にせずにも、末梢血の内容はBMに存在する細胞が反射性でなくてもよい場合においてBM中の追加の細胞型の存在を検出するためのHSPCの特徴付けのために有用である。シリアルBM吸引は、例えば3免疫不全マウスに異種移植したヒト細胞の存在を監視するこの後者の目的のために非常に効果的に使用されている。 0.4〜0.8×10 6細胞は、通常、各BM吸引を使用して取得していることを考えると、これらの細胞は、細胞学的分析（ 図1A）を含む多くの目的、径のために利用することができるグノーシスフローサイトメトリー（ 図1B）、細胞（ 図1C）の培養を含むソートされた細胞のさらなる下流の使用に続いて、フローサイトメトリーによる細胞分離、核酸抽出、制限された細胞数のプロテオミク...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

O.A.-W. は、NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01)、米国国防総省の骨髄不全研究における博士研究員賞 (W81XWH-12-1-0041)、Josie Roberston Investigator Program、および Evan's Foundation の支援を受けた Damon Runyon Clinical Investigator Award によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PBSPAAH15-002
ウシ血清アルブミンPAAK41-001
ACK 溶解緩衝液自家製1 L. pH 7.2 ~ 7.4 を調整し、0.22 μm真空フィルター。
8.3 g 塩化アンモニウムFisher ScientificA661-500
1 g 重炭酸カリウムFisher ScientificP184-500
200 μl 0.5 M EDTA pH 8Gibco15575-038
RPMI 1640PAAE15-842
0.5 ml ツベルクリンシリンジ 27.5 Gベクトン ディキンソン305620
滅菌セルストレーナー 70 μmフィッシャーサイエンティフィック22363548
イソフルラン、USPアタネNDC:66794-014-25
鈍い端の針Stemcell Technologies28110
PrecisionGlide 針 23 Gベクトン ディキンソン305193
3 ml シリンジ ルアーロック チップベクトン ディキンソン309657
非組織培養処理プレート、6 ウェルベクトン・ディキンソン351146
12 x 75 mm 5 mlチューブ Becton Dickinson352054FACS 染色
12 x 75 mm 5 ml チューブ セルストレーナーキャップ付きBecton Dickinson352235FACS 染色
NK1.1 APC-Cy7Biolegend108723
CD11b APC-Cy7Biolegend101225
CD45R (B220) APC-Cy7Biolegend103223
CD3 APC-Cy7Biolegend
Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7Biolegend108423
Ter119 APC-Cy7Biolegend116223
CD19 APC-Cy7Biolegend302217
CD4 APC-Cy7BioLegend317417
CD117 (c-KIT) PEBioLegend105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7バイオレジェンド
CD34 APCBiolegend128612
CD16/32 e450eBioscience48-0161-82
DAPI(4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)Sigma-Aldrich32670
MethoCult GF M3434STEMCELLTECHNOLOGIES3434メトセルロース培養用
CarprofenCrescent Chemical会社C110458501回分(5mg/kg) 
フローサイトメーター、LSRFortessaBecton Dickinson
Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment)Dechra-US17033-211-38
100222122513

参考文献

  1. Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
  2. Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
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