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方法論記事

異心臓移植のマウスモデルを用いた肺動脈弁の移植

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DOI：

10.3791/51695

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2014年7月23日

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1Tissue Engineering Program and Surgical Research, Nationwide Children's Hospital, 2Cardiothoracic Surgery, Nationwide Children's Hospital, 3Pediatric Surgery, Nationwide Children's Hospital

この記事について

サマリー

組織工学心臓弁における新組織形成および狭窄の開発の基礎となる細胞および分子メカニズムを理解するためには、異所性心臓弁移植のマウスモデルを開発した。肺動脈心臓弁は異所心臓移植技術を用いてレシピエントに移植した。

要約

組織工学心臓弁、特に脱細胞弁は、まちまちな結果と再建手術の臨床使用で躍進を始めている。しかし、新組織開発、弁の肥厚および狭窄の発生の細胞および分子メカニズムは広く研究されていない。上記の質問に答えるために、我々は、マウス異心臓弁移植モデルを開発しました。心臓弁は、弁ドナーマウスから採取し、心臓ドナーマウスに移植した。新しいバルブに心臓がレシピエントマウスに異所移植した。移植された心臓は、受信者の心拍とは無関係に、独自のビートを示した。血流は、パルス波ドプラで高周波数超音波システムを用いて定量した。移植された肺動脈弁を通る流れは、最小限の逆流との流れを前進示し、ピークフローは100mm /秒に近いものであった。心臓弁移植のこのマウスモデルであるhighl多用途のyので、変性及び異なる血行力学環境​​を提供するために、および/または組織工学心臓弁に新組織発達を研究するために、種々のトランスジェニックマウスと共に使用することができるように適合させることができる。

概要

先天性心血管の欠陥は西部の世界の1,2乳児死亡の主要な原因の1つです。その中でも、肺動脈弁狭窄症と二尖大動脈弁の欠陥が頻繁に生じる形態3である。心臓弁置換手術は、再建手術の通常の選択である。しかし、狭窄および石灰化心臓弁の、および抗凝固剤に終生の依存など、合併症は慢性的な病気と死4-7の重要な源である。また、成長の可能性がないことは、さらに、これらの若い患者4,8,9の死亡率を増加させる、リビジョン手術を必要とします。

生分解性合成心臓弁8上に成長性、Shinoka ら播種した自己由来細胞との機能的な置換心臓弁を開発する試みである。成長ポテンショ持つ構造体のようなネイティブの心臓弁に変換する合成バルブアル。予備大型動物研究は、機能的な心臓弁10を作成するために、この方法論を使用することの実現可能性を実証した。しかし、長期の移植研究は、心臓弁の狭窄を生じるバルブ新組織の進行性肥厚に乏しい耐久性を実証した。 Sodianから作業ら Shinoka手法を使用しましたが、最終的には、より生理的なプロフィール9,11,12を構築する組織工学弁の生体力学的特性を与えた生分解性エラストマーのPGA行列を置き換えました。 in vivo試験では、着床の成功にもかかわらず、コンフルエント内皮細胞ライニングが、この足場12の長期的な成功を制限する可能性が形成されなかった。

合理的に改善された第二世代合成心臓弁を設計するために、心臓弁移植のマウスモデルは、細胞および分子メカニズムを調べるために作成されたunderlyinGの新組織形成、バルブの肥厚、および狭窄の開発。マウスモデルは、他の種7で容易に入手できないトランスジェニックを含む分子試薬の広大な配列を提供しています。この心臓弁移植モデルにおいては、ex vivoで同系肺動脈心臓弁置換は、最初に実行した;した後、移植された心臓弁と心臓は顕微手法を用いて、同系宿主中に異所移植した。このモデルは、心肺バイパスを必要とせずに心臓弁置換を可能にします。

本研究では、心臓弁の収穫の詳細な説明は、ドナー心臓製剤、心臓弁移植、および異所心臓移植について説明する。結果は、受信者のハートビートとは無関係であったドナー心臓から連続ハートビートを示した。移植された肺動脈弁を通る血流がパルス波飲酒して高周波数超音波システムを用いて測定したppler。

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プロトコル

注：すべての動物の手続きは、全国の小児病院施設内動物管理使用委員会によって承認された。

心臓弁ドナーマウスから1。肺心臓弁の収穫

  1. 手術前に、すべての手術器具をオートクレーブ：細かいハサミ、3Xマイクロ鉗子、2倍のマイクロ血管クランプ、鉗子を適用する1Xクランプ、1Xマイクロニードルホルダー、1X春のはさみ、1Xリトラクターを1X。
  2. 6〜8週齢の雌C57BL / 6マウスは、肺、心臓弁供与体として使用される。そのケージからマウスを取り外して重量を量ると、ケタミン/キシラジンカクテル（ケタミン、200 mg / kgのキシラジンと、20 mg / kgを、IP）の過剰投与により安楽死させる。
  3. 胸の部分をクリップし、パッドの上に背側横臥位にマウスを置きます。その後、開胸を行います。 、心臓を露出右心房に小さなカットを行い、氷冷生理食塩水で左心室を灌流。
  4. ぶっきらぼう昇順Aからの肺動脈（PA）を解剖するオルタ。肺動脈の2ミリメートルカフと一緒に肺動脈弁（PV）を切り出す。心の残りを処分。
  5. 冷たいヘパリンおよび食塩水（100単位/ ml）で、PVを格納します。注：PVは、ドナー心臓への移植前2時間溶液中に保持することができる。

2。ドナー心臓の準備

  1. 6〜8週齢の雌C57BL / 6マウスは、心臓ドナーとして使用される。そのケージからマウスを取り外して重量を量ると、ケタミン/キシラジンカクテル（ケタミン、200 mg / kgのキシラジンと、20 mg / kgを、IP）の過剰投与により安楽死させる。これは、端末の手順である。
  2. 胸の部分をクリップし、パッドの上に背側横臥位にマウスを置きます。その後、開胸を行います。ぶっきらぼう心臓、下大静脈（IVC）、上大静脈（SVC）、上行大動脈、PA、および肺静脈を分離する。氷冷、滅菌生理食塩水でIVCを灌流。
  3. IVC、SVC、その後、より優れカット6​​-0絹縫合糸で肺静脈を結紮合字。
  4. 2ミリメートルカフと大動脈とPAをカット。
  5. PVを切り出し、それを処分する。

3。心臓弁移植ドナー心臓の上に

  1. すぐにステップ2.5の後に、ドナー心臓にステップ1.5から心臓弁を配置し、心臓弁を向けます。
  2. テーパー針に10-0モノフィラメント縫合糸を使用したバルブの右側のステッチのPVを確保し、太陽光発電の反対側から5-6 stichesで連続縫合を開始します。
  3. 前面を終えた後、水平に心を回転させ、ドナー心臓へのPVの裏側を縫合し始める。
  4. 冷滅菌ヘパリン/食塩水に心を保管してください。注：ドナー心臓をレシピエントマウスへの移植前2時間溶液中に保持することができます。

受信者のマウスの上に4。異心臓移植

  1. 6-8週齢の雌C57BL / 6マウスRECIとして使用されたpient。そのケージからマウスを削除し、ケタミン/キシラジンカクテル（ケタミン、100 mg / kgのキシラジンおよび10 mg / kgの）で麻酔して、それを比較検討する。ケトプロフェン（5 mg / kgの）を、前麻酔鎮痛剤として使用される。
  2. つまんテールによる鎮静のレベルを確認した後、腹部と胸の毛をクリップ。無菌眼軟膏で目を潤滑し、パッド上の背側横臥位にマウスを置きます。ベタジンとアルコールパッドで腹部を消毒。その後、滅菌ドレープでマウスをカバーし、唯一の切開領域を公開します。
  3. 恥骨領域への剣状突起下から正中開腹切開を行い、自己保持リトラクターを挿入します。生理食塩水湿らせたガーゼで腸を包む。ぶっきらぼう大動脈大動脈と大静脈を定義します。
  4. 血液の循環を抑制するために大動脈と下大静脈を中心に近位および遠位2 6-0絹縫合糸を配置します。
  5. 腹部大動脈の右側にドナー心臓を配置し、滅菌GAUでそれをカバーZE。生理食塩水で保湿し。
  6. 30 Gの針を用いて腹部大動脈に大動脈切開を行い、ドナーの大動脈の大きさにハサミで開口部を拡張する。
  7. テーパー針に無菌10-0モノフィラメント縫合糸を使用してエンドツー側吻合を行う。腹部大動脈の開口部の近位端に1ステッチとドナーの大動脈を確保し、腹部大動脈の先端から4-5 stichesで連続縫合を開始します。
  8. 、左側に心をフリップ生理食塩水を注入ガーゼでそれをカバーし、腹部大動脈の先端から4-5 stichesと連続して縫合糸に開始します。
  9. 30 Gの針を用いてIVCにおける静脈切開を行い、ドナー肺動脈の大きさに開口部を拡張する。
  10. テーパー針に無菌10-0モノフィラメント縫合糸を使用した側吻合に終止符を実行します。 IVCの開口部の近位端に1ステッチとドナーのPAを確保してから4-5 stichesで連続縫合を開始下大静脈の先端部。大動脈の方法であるため、今回は、ドナーのPAの左側壁の縫合は、IVCの内側にあることを確認してください。
  11. ヘパリンおよび生理食塩水（100単位/ ml）でIVC内腔を洗い流す。先端部に連続して、それらを縫合することにより、ドナーとレシピエントのPA IVCの右壁を閉じます。
  12. 遠位合字を削除し、局所吸収性無菌止血剤を塗布して出血を制御します。出血が完全に停止すると、近位の縫合糸を取り除き、出血を同じように制御します。
  13. 腸を返して6-0黒色ポリアミドモノフィラメント縫合糸を使用した2層に腹部の筋肉と皮膚を閉じます。
  14. 0.5ミリリットルの生理食塩水を皮下注射すると、マウスが完全にモバイルになるまで、温暖化パッド上で回復ケージにマウスを置きます。復旧時には、紙の寝具で新しいケージにマウスを返す。 48時間、鎮痛薬（イブプロフェン、30 mg / kgで、飲料水）を得た。やる完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けている動物を返さない。

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結果

図1は、異所性心臓移植を用いた心臓弁移植モデルの概略図を示す。心臓弁は、ドナー心臓から採取し、第二のドナーマウスから心臓に移植した。次に、新しい心臓弁と心臓はレシピエントマウスの腹部に移植した。 図2は、腹部の空間（A）、右心臓移植（B）の後、および移植後5分に注入された心臓の図を示している。大動脈と下大静脈の両側に縫合糸を除去する際に、心臓は、後1〜2分のビートを開始し、より多くの血液循環とピンカーになる。右心房より、（B）よりも（C）に拡張されることに注意してください。心は徐々に強力なビートと24時間後に安定している。

移植された肺動脈弁を通る血流を使用して10日間、移植後に経皮的に測定した、パルス波ドプラモード（ 図3）と高周波数超音波システム。 Bモードでの大動脈の位置、右心室（RV）、注入された肺動脈弁（PV）、および肺動脈（PA）を<...

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ディスカッション

この手順の死亡率は、主に受信者に腹部大動脈へのドナーの大動脈でのPV移植部位および吻合での出血によって引き起こされた20パーセント、に近接しています。ほとんどの場合、死亡率が有意に48時間後に手術を減少させる。生存したマウスは、移植PVを介して強力な心拍、血流を示した。全体のプロセスは、経験豊富なマイクロ外科医4時間かかります。これは、技術を習得するためにおよそ250匹のマウスがかかります。異所性心移植は、​​ドナー心臓へのPVの移植と比較して比較的単純である。成功したHV移植の最も重要なステップの一つは、ドナーマウスからPV構造の収穫である。 PV構造はバルブ下記1〜2ミリメートルの周りに横に切断する必要があります。残りの組織が短すぎると、吻合は、困難であろう。 PV下の組織、 すなわち （長すぎる場合。PAはアセンドに比べて長すぎになります）移植後に大動脈をING、注入されたPAは、ねじったり、キンクがあります。別の重要なステップは、移植されたPAと受信者IVC間吻合術である。 IVCは非常に薄いので、縫合中引き裂くことは極めて容易である。

このモデルでは、大...

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開示事項

我々は、開示することは何もありません。

謝辞

この作品は、CKBのNIH（RO1 HL098228）からの助成金によって部分的にサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DPBSGibco14190-144
顕微鏡カM80
C57BL / 6J(H-2B)、女性ジャクソン研究所6648-12週間
ケタミン塩酸塩注射Hospira Inc.NDC 0409-2053
ラジン滅菌溶液Akorn Inc.NADA#139-236
KetoprofenFort Dodge Animal HealthNDC 0856-4396-01
IbuprofenPrecisionDoseNDC 68094-494-59
Heparin SodiumSagent PharmaceticalsNDC 25021-400
生理食塩水(滅菌0.9%塩化ナトリウム)Hospira Inc.NDC 0409-0138-22
0.9%塩化ナトリウム注射ホスピーラ株式会社NDC 0409-4888-10
ワセリン眼科軟膏Dechra獣医製品NDC 17033-211-38
ヨウ素準備パッドトライアド使い捨て株式会社NDC 50730-3201-1
アルコール準備パッドマッケソン株式会社NDC 68599-5805-1
綿先端アプリケーターフィッシャーSientific23-400-118
細かいはさみFST14028-10
マイクロアドソン鉗子FST11018-12
クランプ適用鉗子FST00072-14
S&T血管クランプFST00396-01
ハサミFST15008-08
ColibriリトラクターFST17000-04
Dumont #5 鉗子FST11251-20
Dumont #7 - 細かい鉗子FST11274-20
Dumont #5/45鉗子FST11251-35
ティッシュニードルホルダー/鉗子MicrinsMI1540
ブラックポリアミドモノフィラメント縫合糸、10-0AROSurgical Instruments CorporationTI638402グラフトを縫合するための
ブラックポリアミドモノフィラメント縫合糸、6-0AROSurgical InstrumentsSN-1956筋肉組織および皮膚閉鎖用
不織布スポンジMcKesson Corp.94442000
性止血Ethicon1961
1 mlシリンジBD309659
3 mlシリンジBD309657
10 mlシリンジBD309604
18 G 1 1/2インチ、ニードルBD305190
25 G 1インチ、ニードルBD305125
30 G 1インチ、ニードルBD305106
温水リサーキュレーターゲイマーTP-700
温暖パッドゲイマーTP-22G
トリマーウォール9854-500
VEVO2100高周波超音波VisualSonicshttp://www.visualsonics.com/vevo2100カタログ番号と価格は、営業担当者から取得できます。
超音波透過ゲルParker Laboratories,
INC.		01-02
卓上実験動物麻酔システムVetEquip, INC.
イソフルランバクスター1001936060
ライキシスプリング吸収剤901806

参考文献

  1. Polito, A., et al. Increased morbidity and mortality in very preterm VLBW infants with congenital heart disease. Intens Care Med. 39, 1104-1112 (2013).
  2. Wren, C., Reinhardt, Z., Khawaja, K. Twenty year trends in diagnosis of life threatening neonatal cardiovascular malformations. Arch Dis Child Fetal. 93, F33-F35 (2008).
  3. Vacanti, J. P. Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture. Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).
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  8. Shinoka, T., et al. Tissue engineering heart valves valve leaflet replacement study in a lamb model. The Annals of thoracic surgery. 60, S513-S516 (1995).
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