表現型のハイスループットアッセイサルモネラ菌ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

サマリー

インビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌関連性、浸潤、および高スループット能力を有する食細胞での複製にハイスループットアッセイを開発した。方法は、宿主-病原体相互作用におけるそれらの関与がためにサルモネラ遺伝子ノックアウト変異株を評価するために使用した。

要約

サルモネラ種は、人畜共通の病原体とヒトや家畜¹における食品媒介性疾患の主要な原因である。 サルモネラ -host相互作用のメカニズムを理解することは、 サルモネラ感染症の分子病態を解明するために重要である。食細胞におけるサルモネラ関連付けを表現型にゲンタマイシン保護アッセイ、浸潤及び複製は、RAW264.7マウスマクロファージを用いて宿主相互作用におけるサルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌の欠失変異体の役割を定義するためのハイスループットスクリーニングを可能にするように適合させた。このプロトコルの下で、分散野生型および複数の変異株が同一の培養皿に、同時に試験することができるので、測定値に有意に、標準プロトコルと比較して低減される。マルチチャンネルピペットの使用は、スループットが向上し、精度を向上させる。さらに、懸念が少ない鎬使用に関連96ウェル培養皿中でウェルあたり番目の細胞が対処された。ここでは、食細胞を使用して修正インビトロサルモネラ浸潤アッセイのプロトコールに成功協会、浸潤および細胞内複製のための38の個別サルモネラ欠失変異体を表現型に採用された。 インビトロ表現型は、そのうちのいくつかは、その後、動物モデルにおいてin vivo表現型を持っていることが確認された、提示される。このように、ハイスループット能力を有するマクロファージにおける修正された、 サルモネラの関連付けを表現型に標準化されたアッセイ、浸潤および複製は細菌-宿主の相互作用を研究するために、より広く利用することができる。

概要

非チフス性サルモネラは、すべての脊椎動物の腸内疾患の重要な原因である。ヒトでのサルモネラ症は、トップ細菌性食品媒介疾患¹つである。彼らの動物宿主でサルモネラとの相互作用を支える分子機構の特性は、主に、感染の組織培養および動物モデルでのサルモネラ菌血清型ネズミチフス菌（STM）の研究によって達成される。 STM-ホスト相互作用に洞察を得ることは、私たちはサルモネラ菌が生存し、宿主細胞の内部成長をどのように理解するのに役立ちます。これらの相互作用を研究する最初の課題は、ホストと病原体の両方から可能な限り多くの参加要因を特定することであるが、これらの努力は、主に、同時に2つの独立した複雑な生物学的システムを扱う、 すなわち 、ホストとサルモネラの重要な難しさによって妨げている 生理的条件下で。さらに、大規模なrepertサルモネラのoire、潜在的にホストの相互作用に関与する因子をコードする宿主遺伝子は、この課題に取り組むために、ハイスループットの生物学的なプラットフォームを必要とします。

サルモネラの関連付けを表現型に変更され、標準化されたアッセイは、ハイスループット能力を有するマクロファージにおける侵略と複製が可能性が高いサルモネラ -host相互作用に従事した遺伝子の大規模な....

プロトコル

1マウスマクロファージRAW264.7細胞培養

1. 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中でT-75細胞培養フラスコ通気フィルタキャップに低い継代数マウスマクロファージ細胞を増殖^{、RAW264.7（ATCC®}番号、TIB-71） 5％CO ₂インキュベーター中、37℃で0.5％のNaHCO _3、および1％100×非必須アミノ酸（NEAA）。
2. 細胞がフラスコ中の60〜80％コンフルエンスに達したら、細胞を採取し、血球計で細胞を計数し、細胞濃度を計算するために、細胞スクレーパーを使用する。
3. 細胞を再懸濁し、新鮮なDMEM細胞培養培地中で2.5×10 ⁵ / mlの細胞濃度に希釈する。 96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに5×10 ⁴細胞を含有するDMEM細胞培養培地200μlをプレートにマルチチャンネルピ ​​ペットを使用する。
4. 各サルモネラ株の 4つのウェルをプレート。 1セットのために3つの個別のプレートをセットアップします食細胞浸潤アッセイの、それぞれ、「会合」、「侵略」と「複製」でそれらをマークします。
5. マクロファージ細胞をウェルの底に付着させ、37℃ON、5％CO ₂インキュベーター内でプレートを置きます。

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結果

データが変更された食細胞浸潤アッセイに基づいてプロットされた後、代表的な結果（ 図2）を参照してください。データは複製⁸欠陥があることが知られている5の異なる株、WT、ΔinvA、ΔphoP、変異体A、および侵入のための欠陥があることが知られている突然変異体B.ΔINVA、およびΔphoPを含む、実験的な妥当性を評価するための陽性対照として使用されている。確かに、修正された浸潤アッセイで、ΔinvA変異体は、RAW264.7細胞によって不完全に内在化され、ΔphoP変異体は、24時間後にレプリケーションを減少させた。変異体A及びBは、このプロトコルを使用してアッセイの代表的な菌株である。変異体Aは、ΔphoP変異体と同様の複製（ 図2）の有意な減少を示している。興味深いことに、変異体Bは、複製が有意に増加します（ 図2）を示す。データは明らかに、これらの牟田の両方を示す国税庁は、マクロファージに侵入し、生存の.......

ディスカッション

ゲンタマイシン保護アッセイが広く、宿主細胞内の細胞内細菌性病原体の侵入および複製を研究するために使用され、それは、特に、その侵入感染^1を確立するための前提条件のステップであるサルモネラのように、病原体を研究するための重要な生物学的ツールである。 サルモネラ研究コミュニティにおける標準ゲンタマイシン保護アッセイを24ウェル培養皿⁵に実装されている。 48あるいは96ウェルプレートの使用は、高スループット能力⁹について以前に議論されたけれども、実際のプロトコルを詳細に実証されておらず、正常な細菌の突然変異体のコレクションをテストするために使用されている。ここで、修正された標準化プロトコルは、 サルモネラ変異体を表現型に、96ウェル培養皿を使用するために開発された。注目すべきことに、このプロトコルは唯一のサルモネラと食細胞を試験した、このように改変および最適化は、明らかにパーソナルプラグインに必要であろう r個の細菌または宿主細胞。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)	Life Technologies	11965
ウシ胎児血清	HyClone	SH30910.03
T-75 細胞培養フラスコベントフィルターキャップ	Nest Biotechnology	708003
100x Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140
セルスクレーパー	BD ファルコン	353086
96ウェル細胞培養プレート	Corning Incorporated	3595
Luria-Bertani (LB) broth	MP Biomedicals	3002-075
14 ml ポリプロピレン丸底チューブ	BD Falcon	352059
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamycinソリューション	シグマ	K0254
ゲンタマイシン溶液	シグマ	G1272
0.25% トリプシン-EDTA	ライフ テクノロジー	ズ 25200
トリパン ブルー	シグマ	T8154