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方法論記事

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

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DOI:

10.3791/51762

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2014年10月17日

 , 
1Department of Neuroscience, Ohio State University

この記事について

サマリー

ここでは、推定細胞接着分子の固有の接着特性を特徴付けるための簡単で迅速な方法を提示します。 細胞接着分子の分泌されたエピトープタグ付きエクトドメインは、培養培地から小さく均一な官能基ビーズに捕捉されます。 これらのビーズは、その後、単純なビーズ凝集アッセイですぐに使用できます。

要約

細胞 - 細胞接着は多細胞生命の基本であり、細胞表面タンパク質の多様な配列によって媒介される。しかし、これらのタンパク質の多くのための接着剤の相互作用はほとんど解明されていない。ここでは、推定される同種親和性細胞接着分子の接着特性を特徴付けるための、シンプルで迅速な方法を提示する。培養されたHEK293細胞は、細胞表面タンパク質の分泌、エピトープタグ外部ドメインをコードするDNAプラスミドでトランスフェクトされる。エピトープタグに特異的な官能化されたビーズを用いて、可溶性の分泌された融合タンパク質を培地から捕捉される。コー​​ティングされたビーズは、その後、ビーズ凝集アッセイにおいて、または同種親和性接着を試験するためのアッセイを選別蛍光ビーズに直接使用することができる。所望の場合、突然変異誘発は、その後の接着に必要な特定のアミノ酸又はドメインを解明するために使用することができる。このアッセイは、発現されたタンパク質の少量のみを必要とする安定な細胞株の産生を必要とせず、アコすることができ4日間でmplished。

概要

細胞間接着は、多細胞生物の発生および完全性に必須であり、細胞表面分子の多様な配列によって媒介される。これらの接着分子の多くは、多くはまだ発見されていないものの、同定され、特徴付けられている。いくつかの方法は、アッセイを、細胞選別、細胞凝集アッセイ1-8と、原子間力顕微鏡、表面力分光法9-12のような生物物理学的方法を含む細胞接着分子（CAM）の特性を調べるために使用される。

偶数細胞株を用いてインビトロ系において簡略化の複雑さは、それが困難な推定上のCAMの接着特性を決定することを可能にする。非接着細胞株にトランスフェクトした場合には細胞凝集を誘導する場合、通常、分子はCAMと考えられている。しかし、これは接着活性の直接的な証拠はないことは明らかである。例えば、細胞表面の配信または安定性を促進するCAMはまた、増加した細胞凝集1,13をもたらすであろう。また、真のCAMは、細胞株は、細胞表面送達または安定化に必要なその他の補助因子を欠いている場合、細胞凝集を媒介することに失敗することがあります。

これらの複雑な要因を回避するために、より直接的なアッセイは、接着性相互作用は、細胞外ドメインの固有の生化学的性質であるべきであるという考えに基づいていることを採用することができる。ビーズは最初に呉-CAM 2を特徴付けるために使用されたが、これらのアッセイは、カドヘリン介在性接着12,14,15を調べるために拡張されている。 C-カドヘリン細胞外ドメイン-Fc融合の融合を使用して、Gumbinerラボは、複数のカドヘリンリピートが相互作用14を同種親和性に寄与することを示した。 ショウジョウバエからプロト1,15-18とDSCAMアイソフォームの数を持っているように、同等のビーズ凝集アッセイ、E-カドヘリンとN-カドヘリン接着を使用すると、、12,15を特徴づけられている 19。ここでは、推定上の同種親和性のCAM（ 図1）の分泌され、エピトープタグの外部ドメインの接着活性を特徴付けるため、比較的簡単かつ迅速なアッセイを記述する。私たちは、カドヘリンスーパ​​ーファミリーのメンバーを特徴づけるために、主にこのアッセイを使用している。

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プロトコル

1。細胞調製（日-2〜0）

  1. 分割HEK293細胞1： - 80％コンフルエント（2 - 3日間）および0.05％トリプシン-EDTA溶液を用いて5〜60まで、5％CO 2、37℃で増殖培地中でインキュベートする。各条件については、2×100mm皿内の培養細胞。

2細胞トランスフェクション（1日目）

  1. そのようなリポフェクタミンなどのトランスフェクション試薬を使用してコードするプラスミドFc融合でHEK293細胞をトランスフェクトする。同等のトランスフェクション効率をもたらす代替的な方法を用いてもよい。
  2. 24時間インキュベーターにトランスフェクトされた細胞を返します。

3セルの伝播（2日目）

  1. 37℃までのウシ胎児血清（-FBS）なしの予熱増殖培地。
  2. 料理は10ミリリットルの成長メディア-FBSで2回すすぎ、1時間、37℃のインキュベーターに皿を返す。
  3. 合計3回の洗浄のために、10ミリリットルの成長メディア-FBSと文化の料理をもう一度洗浄します。
  4. Incuお譲りしたメディアを収集する前に、FBSを含まない別の48時間、37℃でトランスフェクトされたHEK293細胞。

4。ビーズ集約（4日目）

  1. 培養皿からメディアを収集するには、細胞破片をペレット化し、5分間500×gで50ミリリットルコニカルチューブとスピンに料理の各ペアからメディアを転送します。
  2. 30ミリリットルの注射器、0.45μmのシリンジフィルターを用いて遠心フィルターに50ミリリットルコニカルチューブからフィルターメディア。
  3. 濃縮された培養培地の体積は約500μlの（約15分）まで、4,000×gで、4℃で遠心分離フィルタースピン。すべての培養培地を添加して、濃縮されるまで繰り返します。
  4. 、各サンプルについて1.5mlのマイクロチューブに結合バッファーの氷冷1mlにプロテインG磁気ビーズを1.5μl加え、磁石上の場所とバッファを削除します。すぐにプロテインG磁気ビーズに濃縮した培養培地を追加します。
  5. 2時間、4℃で管を回転させます。
  6. Plの磁石上のエースチューブとは、メディアを取り出します。すばやく結合バッファーの氷冷1で2回ビーズを洗浄した後、結合緩衝300μlのビーズを懸濁します。
  7. スプリットは2管、各チューブに150μlの中にビーズを再懸濁し、その後、それぞれ、「カルシウム」と「いいえカルシウム」の条件について200のCaCl 2または200のEDTA、1.5μlを添加する。
  8. うつ病への転送、各条件からの100μlをうまくスライドさせ、透過光顕微鏡（ 図2）を使用して、顕微鏡写真を収集します。所望の各時点での各実験のために5視野からの画像を収集します。

5。データ解析

  1. [ファイル ]プルダウンメニューから... ImageJの、または同等の画像解析ソフト、 インポート/イメージシーケンスを使用して、5つの画像データセットのオープン1を使用した。これらは、画像スタックとして開かれます。
  2. イメージ / プロパティ...]ダイアログボックスで、私を変更ピクセルにメイジユニットおよび1.0にピクセルの幅と高さをピクセル単位で設定します。
  3. 画像プルダウンメニューで調整/しきい値...コマンドを使ってバイナリに画像を変換します。ビーズやビーズ凝集体に貢献する画素が含まれるようにしきい値を設定しますが、その背景と小さい粒子を除外します。スタック内のすべての画像に適用します。
  4. セットの測定 ]ダイアログボックスで、 エリアとスタックポジションチェックボックスをオンにします。
  5. プルダウンメニューの分析に...粒子を分析し実行します。これは、それらの大きさ（面積）およびそれらが同定された画像を含む同定された粒子のリストを生成する。
  6. 実験と実験条件について、この手順を繰り返します。

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結果

実験例は、FC（NcadEC-Fc）のに融合したN-カドヘリンの細胞外ドメインによってカルシウム依存性ビーズの凝集を示した図2に示されている。カルシウムの非存在下では、ビーズは凝集するほとんど又は全く傾向を示す、時間（ 図1A、C）との凝集体サイズの増加はない。カルシウムの存在下では、ビーズは、凝集体サイズが（ 図1B、C）は、時間の経過とともに増加し、NcadEC-Fcのショー堅牢な集約でコーティング。この実験は、5つの非重複視野からの画像からなる各インスタンスで、3回繰り返した。画素領域内の粒子サイズは、5つのフィールド内の各集合体について決定した。これらのデータは、各実験における各時点について平均した。 3回の実験のデータは、各時点（ 図2C）における手段と測定の標準誤差を決定するために平均化した。

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ビーズ凝集アッセイ中の分泌、エピトープタグの外...

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ディスカッション

細胞接着は多細胞生命の本質的な特徴であり、細胞表面タンパク質の広範な配列によって媒介される。このうち、詳細な接着性が比較的小さい割合と理解される。ここでは、便利なエピトープタグに融合された分泌された外部ドメインの同種親和性接着剤能力を調査するための、シンプルで迅速なプロトコルを記載している。このアプローチは、多くの重要な利点を有している。タンパク質の十分な量が100mm皿の一過性トランスフェクションによって生成することができるように、まず、安定した細胞株は、14,20を必要としない。 例えば点または削除変異体- -これは構造体のより多くのスクリーニングを可能にする細胞株を大量に生成し、維持するための努力と費用をかけずに。第二に、これらのビーズアッセイは、減少し、システム内の推定上の接着分子の生化学的性質の直接的な試験である。そのため、接着は直接タンパク質に起因することができます調査ではなく、潜在的な間接的影響下に。第三に、可能な補因子の効果を調べるために、細胞を、推定上の接着分子とその推定上の補因子の分泌された形態の、別個のエピトープタグとのそれぞれに同時トランスフェクトすることができる。それは、...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、NSF/ARRA賞(IOS 0920357)とNIH賞(5R21MH098463)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
pFc-N1プラスミドAddgene提出予定
HEK293細胞American Type Culture CollectionCRL-1573
DMEMMediatech - Corning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF2442
100x Pen-Strep (10,000 U/ml)Life Technologies15140-122
0.05% Trypsin-EDTAライフテクノロジーズ 25300054
リポフェクタミン 2000ライフテクノロジー11668030
Dynabeads –プロテインGライフテクノロジー10003D
ウシ血清アルブミンシグマA3294
うつ病スライド電子顕微鏡科学71878-06
アミコン ウルトラ-15 遠心フィルターユニット ウルトラセル-10 膜ミリポアUFC901024
0.45 mm シリンジ フィルターサーシュテット83.1826
Dynamag-2 MagnetLife Technologies12321D
フィジー (ImageJ) 画像解析ソフトウェアhttp://fiji.sc/Fiji
Table of Buffers/Solutions
Growth MediaDMEM + 10% FBS + Pen-StrepFilter 滅菌し、4°Cで保存します。
グロースメディア–FBSDMEM + Pen-Strepは、4°Cで滅菌および保管します。
結合バッファー50 mM Tris、pH 7.4、100 mM NaCl、10 mM KCl、0.2% BSAVortex 溶解するまで、氷上に保ちます。
ズ ズ フィルター

参考文献

  1. Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
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  19. Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
  20. Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).

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