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方法論記事

ハイドロゲルナノ粒子プラズマの収穫や少量のタンパク質を検出するための尿

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DOI:

10.3791/51789

⸱

2014年8月7日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Applied Proteomics and Molecular Medicine, George Mason University, 2Ceres Nanosciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

いくつかの病理学的バイオマーカーは、体液中の濃度が低く、分解酵素の存在、および大量の高分子量タンパク質が存在するため、現在の技術では容易に検出できません。化学的に官能基化されたハイドロゲルナノ粒子は、低存在量のタンパク質を採取、保存、濃縮することができるため、これまで検出できなかったバイオマーカーの検出が可能になります。

要約

新規バイオマーカーの発見は、より高感度かつ特異的な疾患検出を提供する上で重要な役割を果たしている。それらは、非常に低濃度で存在する不安定であり、しばしば、アルブミンまたは免疫グロブリンのような高量のタ​​ンパク質によってマスクされるため、残念ながら、生物学的流体中に存在する多くの低存在量のバイオマーカーは、容易に、質量分析またはイムノアッセイを用いて検出することができない。ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（NIPAM）ベースのナノ粒子を含有する餌は、これらの生理学的障壁を克服することができる。一工程において、それらは、捕捉し濃縮して、体液からのバイオマーカーを保持することができる。低分子量の分析物は、ナノ粒子のコアに入り、高親和性タンパク質ベイトとして作用する異なる有機化学色素によって捕捉される。ナノ粒子は、数桁目的のタンパク質を集中することができます。この濃縮係数は、タンパク質が範囲内にあるように、タンパク質レベルを増加させるのに十分である現在の質量分析計、ウェスタンブロッティング、および免疫アッセイの検出限界。ナノ粒子は、生物学的流体の過多とインキュベートすることができ、それらは、アルブミンおよび他の高分子量蛋白質を除外して大幅に低分子量タンパク質およびペプチドの濃度を豊かにすることができる。本発明者らのデータは、以前に検出できないバイオマーカーを検出するために質量分析および免疫アッセイを可能にする、特定の分析物の濃度の10,000倍の増幅が達成できることを示している。

概要

ヒトゲノムシークエンシングの完了にもかかわらず、かなりの進歩が早期の疾患の予測バイオマーカーの同定に行われていない、またはそれは、治療転帰または予後1と相関する。進歩の欠如の一つの理由は、多くの潜在的に重要なバイオマーカーが従来の質量分析法および他のバイオマーカー発見プラットフォームの検出限界未満の濃度で存在することがある。質量分析（MS）および多重反応モニタリング（MRM）は、分析物の大部分は50 pg / mlで、および10ng / mlの間の範囲の臨床検査秋にイムノアッセイによって測定しながら、ng / mlで50より典型的には検出感度を持つ。これは、特に疾患の早期段階における多くのバイオマーカーは、従来のMS及びMRM 2により検出できないことを意味する。さらに、このような複雑な生物学的流体中のアルブミンおよび免疫グロブリンのような高量のタ​​ンパク質の存在は、しばしば10億倍販売によってマスクエス低存在量、低分子量タンパク質およびペプチド3、図4に示すように 、このためいくつかのサンプル準備ステップは、質量分析配列決定および同定の前に必要とされる。そのような準備工程は、市販の空乏列5-8の高存在量タンパク質の枯渇を採用しています。それらはしばしば、非共有結合的に削除されるキャリアタンパク質と関連しているので、残念ながら、このステップは、候補バイオマーカーの歩留まりの低下につながる。サンプルが収集されると別の課題は、候補バイオマーカーex vivoでの安定性により表される。タンパク質は、内因性または外因性のプロテアーゼ9による分解を受けやすい。分解10-13からタンパク質を保護しながら、ヒドロゲルのナノ粒子は、アッセイの範囲内のレベルまでの推定バイオマーカーの濃度を増幅することにより、これらの重要な課題を超越することができる。

それは、目に注意することが重要ですLMWで血液中のタンパク質は、小さな完全なタンパク質だけでなく、大規模なタンパク質の断片の混合物である。 60kDaのより大きな組織由来のタンパク質は、受動的に、血管基底膜を通って血流に入るには大きすぎるが、それらはペプチドまたはタンパク質断片14として血液中に表すことができる。私たちの目標は、疾病の早期発見、治療のために患者の層別化、および治療に対する応答をモニターするための候補となり得る新規の循環バイオマーカーを測定することである。当社のナノ粒子は、同時により小さなタンパク質およびペプチドを捕捉し、出発容量に応じて、100倍にそれらを集中しながら、選択的に、高存在量の免疫グロブリンとアルブミンを除外するために作成されます。

当社グループは、成功し、タンパク質およびペプチドのための高親和性高分子の餌として作用することができる小さな有機色素のセットを同定した。タンパク質 - 色素結合、疎水性及び静電的相互作用の組合せに起因すると考えられているS。タンパク質表面11上の疎水性ポケットを経由してタンパク質と色素のインターリーブ上の芳香環。

餌は、それらの化学的性質に応じて、分析物の選択されたクラスに対して特定の親和性を示す。餌は、タンパク質またはペプチドを、アルブミンなどのキャリアタンパク質と競合する。粒子中に捕捉される低分子量タンパク質/ペプチド。例えば、アルブミンおよび免疫グロブリンなどの高分子量タンパク質に起因ヒドロゲル11（図1）の制限のため、細孔にふるい分け能力の粒子に侵入することを防止している。

ヒドロゲルのナノ粒子は、過硫酸アンモニウム11によって開始沈殿重合により合成される。 N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAM）は、アクリル酸（AAC）およびアリルアミン（AA）及び架橋剤N、N'-メチレンビスアクリルアミド（BIS）のコモノマー、希釈条件1を 6時間70℃で反応させ1,13。共有結合を介してナノ粒子にアミノ基含有染料（ すなわち 、sulfonatedanthraquinonetriazine染料）を組み込むことによって達成ポリ親和性（N-イソプロピルアクリルアミド-コ-アクリル酸）（ポリ（NIPAM-コ-AAC）nanoparticlesis結合高タンパク質染料11、13の親水性/疎水性特性に依存して水性または有機溶媒中で実施アミド化反応。anthraquinonetriazine色素の塩素原子を有するナノ粒子中のアミン基の求核置換は、色素含有ポリ（NIPAMを作成するために利用されるコ-アリルアミン）（AA）は、11ナノ12。二段階の重合プロセスは、ビニルスルホン酸（VSA）11,13の外殻を含むヒドロゲルのナノ粒子を作成するために利用される。

ヒドロゲル粒子は、全血、血漿、血清、脳脊髄液、汗、および尿を含むさまざまな生物学的液体に適用することができる。ワンステップで、溶液中で、nはanoparticlesは（数分以内）急速隔離および低分子量の濃度は10、11、13、15-18分析物行う。タンパク質は、続いて19-21、質量分析法10、11、13、15、18、22、23、イムノアッセイ/ ELISA 10、11、15、18、または逆相タンパク質マイクロアレイ16を、ウェスタンブロッティング用いてナノ粒子から溶出し、検出され24アッセイ。化学餌で官能ナノ粒子と、コアまたはコアシェル·アーキテクチャを提示するには、餌/シェルの物理化学的特性に基づいてタンパク質を捕捉し、濃縮する。ナノ粒子に組み込まれた別の染料は、したがって、色素親和性に基づいて効率、溶液のpH、高濃度タンパク質13、競合の存在/不在を変化させて、タンパク質の異なるサブセットを捕捉するであろう。さらに、溶液の体積に対するナノ粒子の量は、ナノ粒子からのタンパク質収量に影響する。これらの態様のハイドロゲルナノ粒子収穫は、タンパク質を大量に含有して血漿サンプルから、典型的には大量のタンパク質を含まない尿サンプルからタンパク質を回収するための3つの異なるナノ粒子ベイトを用いて実証されている。このプロトコルでは、収穫およびポリ（NIPAM-コ-AAC）、ポリ（NIPAM /染料）、及びコア - シェル型ナノ粒子を用いて血漿サンプルからの腫瘍壊死因子α（TNFα）の濃縮を実証する（ポリ（NIPAM - コ - VSA）） 。ポリ（NIPAM /色素）のナノ粒子は、 結核菌感染個体を模倣するために、ヒト尿サンプルに添加したマイコバクテリウム種の抗原を濃縮することが示されている。

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プロトコル

ヒト血漿および尿がジョージ·メイソン大学施設内倫理委員会は、プロトコールを承認した後に、書面によるインフォームドコンセントを、健康なボランティアドナーから採取した。寄付者は、同様に個別に分析された25および42の試料歳の間白人、男性と女性の間に分布し、プールされませんでした。

血清または血漿検体の1ナノ加工

血漿中に潜在的な低豊富なバイオマーカーは、ハイドロゲルナノ粒子で、溶液中で、捕獲されている。粒子は、血漿に添加し培養し、遠心分離によって分離し、洗浄し、捕捉されたタンパク質が溶出されている。溶出したタンパク質は、下流の質量分析配列決定および同定のための窒素気流下で乾燥させる。

  1. マイクロチューブに50mMのトリスHCl pHが7（500μlの血清+500μlのトリスHCl）で2：血清1500μlの希釈する。
  2. 500μLのポリ（NIPAM / AAC）コアnanopを追加記事。 RTで15分間インキュベートする。
  3. 固定角ローターを備えた遠心分離機で10分間、16,100×gで、25℃でサンプルをスピン。上清を除去し、廃棄する。
  4. ペレットに500μlのチオシアン酸ナトリウム（25 mm）を追加します。精力的に複数回ピペッティングによりナノ粒子を懸濁します。
  5. 固定角ローターと遠心機中で10分間、16,100×gで25℃、サンプルをスピン。上清を除去し、廃棄する。
  6. ナノ粒子ペレットにMilliQ水を500μlを加える。精力的に複数回ピペッティングによりナノ粒子を懸濁します。
  7. 固定角ローターと遠心機中で10分間、16,100×gで25℃、サンプルをスピン。上清を除去し、廃棄する。
  8. 新鮮な溶出バッファーを準備します。清潔なチューブ内の300μlの水酸化アンモニウムを700μlのアセトニトリルを加える。注意：水酸化アンモニウムが腐食性である。適切な換気をすること。注：溶出緩衝液は、予備校でなければなりません使用直前にared。溶出バッファーを保管しないでください。
  9. ナノ粒子ペレットに溶出バッファーを300μlを加える。精力的に複数回ピペッティングによりナノ粒子を懸濁します。 RTで15分間インキュベートする。
  10. 固定角ローターと遠心機中で10分間、16,100×gで25℃、サンプルをスピン。きれいな、ラベルされたマイクロチューブに溶出液を取り出し、保存してください。
  11. 1.10 - を繰り返して、1.9を繰り返します。 1マイクロ遠心チューブに2溶出液を組み合わせる。
  12. 8（ 図2F）に設定し、空気流で、42.1℃の窒素蒸発器マニホールド内の窒素気流下で溶出液を乾燥させる。
  13. O / N個の保存のために室温で乾燥させ、溶出液を保管したり、長期保存のために-20℃、での質量分析、ウェスタンブロッティング、またはELISAアッセイ（オプション）の前に。

尿サンプルの2ナノ加工

正常な尿未満では30mg / dlのタンパク質を含有し1 +血液よりも少ない。しかし、多くの疾患/状態は、尿タンパク、血液の正常なレベルを変化させることができる。尿サンプルに追加するナノ粒子の最適な量を決定するのを助けるために、尿検査は、ナノ粒子の収穫に先立って行われる。尿バイオマーカーは、尿量にナノ粒子の比率を最適化する必要があり、極めて低濃度で存在することができる。この手順は、下流のウェスタンブロット分析のための尿サンプルのナノ粒子収穫を記述する。

  1. 清潔で乾燥したプラスチック製のカップに尿サンプルを収集します。 22ミリリットル最小体積が必要です。分析する直前まで、-80℃で保存する尿検体。
  2. RTで、または4℃CO / Nで凍結した尿を解凍する。ボルテックスミキサーで簡単にミックス。 50ミリリットルコニカルポリプロピレンチューブに尿を少なくとも22ミリリットルを注ぐ。
  3. 15分間3,700×gで、スイングアウトローターを遠心分離器で尿をスピン。清潔な50mlコニカルボトムpolyprに、ペレットを乱すことなく、尿をデカントopyleneチューブ。ペレットを捨てる。
  4. 多検体 "尿ディップスティック」試薬ストリップを使用して尿検査を行います。注意：直射日光を避け、湿度17から密閉容器内で18を試薬ストリップを格納します。
    1. 清潔で乾燥したペーパータオル上、試薬ストリップ、フェイスアップにして置きます。
    2. ステップ2.3で調製した尿1ミリリットルを吸引する使い捨てピペットを使用してください。
    3. 2分間タイマーを設定し、それを起動しないでください。試薬ストリップの各テストパッドの上に尿を2滴 - すばやく1を分注する。すぐにタイマーを開始。注：尿容器内に直接試薬ストリップを水没しないでください。試薬ストリップ中の染料/化学的指標は、潜在的に尿容器に試薬ストリップから浸出することができます。
    4. 試薬ストリップ容器に記載されている時には、対応する色分けされたインディカに個別の試薬ストリップの色を比較することにより、試薬ストリップ上のさまざまな分析物について定性的な結果を記録試薬容器上の役。典型的な正常な尿の結果は以下のとおりです（正常または負）血液、タンパク質、白​​血球、亜硝酸塩、グルコース、ケトン、ビリルビン、およびウロビリノーゲンのために;尿pH（5.5から7.0）;比重（1.001から1.020）。注：尿試料での高タンパク質レベルは、ナノ粒子上の結合部位について目的のタンパク質と競合しうる。ナノ粒子を有するタンパク質収穫を最大にするために、ナノ粒子の体積/尿の体積比は、高存在量タンパク質のいずれかから限界競争に調整することができる、または非常に低濃度で存在するタンパク質を採取することに最適化することができる。尿タンパクの値が1 +以上の場合、ステップ2.5未満で、ナノ粒子の2倍のボリュームを追加する。目的の分析物が非常に低い豊富なタンパク質である場合、それを2ml（図3）までのナノ粒子の体積を増加させる必要があるかもしれない。
  5. 転送クリーン50ミリリットルコニカルポリプロピレンチューブにステップ2.3から明確に尿を20ミリリットル。しないでください尿管の底部であってもよく、任意の破片/ペレットを乱さ。 20ミリリットルの尿サンプルにナノ粒子を200μlを追加。ボルテックスミキサーで簡単にミックス。尿タンパク値が1+以上の場合、20ミリリットルの尿へのナノ粒子の400μlのを追加してください。
  6. ロッキング/ミキシングすることなく、室温で30分間の尿/ナノ粒子混合物をインキュベートする。
  7. 10分間3,700×gで、スイングアウトローターを装備した遠心分離機中尿/ナノ粒子懸濁液をスピン。注：ペレットが見え、次の遠心分離がない場合は、追加の2のためのサンプルをスピン - 7分。
  8. 上清を除去し、廃棄する。ナノ粒子ペレットに500μlのミリQ水を加える。
  9. 精力的に複数回ピペッティングによりナノ粒子を懸濁します。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにナノ粒子溶液を転送します。
  10. 10分間16,100×gで固定ローターを装備した遠心分離機でナノ粒子をスピン。注：ペレットが見えFOLされていない場合7分 - 遠心分離をlowing、さらに2のためのサンプルをスピン。
  11. 上清を除去し、廃棄する。
  12. 繰り返してナノ粒子を洗浄するために200μlの18ミリQ水（2回）2.8と2.11を繰り返します。
  13. 新鮮な溶出バッファーを準備します。清潔なチューブ内の30μlの水酸化アンモニウムに970μlのアセトニトリルを加える。注意：水酸化アンモニウムが腐食性である。適切な換気をすること。注：溶出緩衝液は、使用直前に調製しなければならない。溶出バッファーを保管しないでください。
  14. ナノ粒子ペレットに20μlの溶出バッファーを追加します。精力的に複数回ピペッティングによりナノ粒子を懸濁します。 RTで15分間インキュベートする。
  15. 10分間16,100×gでのナノ粒子のサンプルをスピン。清潔な1.5 mlのマイクロチューブに上清を除去し、保存します。ナノ粒子ペレットを混乱しないでください。バイオハザードゴミ箱にペレットを捨てる。
  16. 化学ヒュームフード内のラックにサンプルを配置します。キャップを開き、INC室温で30分間ubate。 （ - 2時間1）または、乾燥するまで40℃で窒素流下でサンプルを配置します。
  17. サンプルに15μlのトリス - グリシンSDSサンプル緩衝液（2倍）を加える。 100での熱 オープンまたはチューブ内に残って音量まで、キャップを5分間のドライヒートブロック中で°Cを超えない20μlのではない。注：沸騰水浴を使用しないでください。水浴から湿度がバッファの蒸発を防止する。
  18. チューブのキャップを置きます。ヒートブロックからチューブを取り外します。サンプルは-80℃で保存するか、または下流のウェスタンブロット分析のために直ちに使用することができる。

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結果

ハイドロゲルナノ粒子サイズと均一性

ポリ（NIPAM-AAC）粒子間のバッチ内で極めて高い収率や再現性で製造されてきた。粒子が捕捉、貯蔵、およびタンパク質の溶出（少なくとも48時間）に必要な時間の間、室温で非常に良好なコロイド安定性を有し、ナノ粒子沈殿（ 図1）11 を観察されていない。コロイド安定性は、ナノ粒子による急速なタンパク質/ペプチドの取り込みのために非常に重要であり得る。

プラズマから収穫の可能性の低存在量のバイオマーカー

色素餌の取り込みは、溶液中の分子の取り込みを駆動し、捕捉された分子が分解13、15、18、25から保存されていることを保証する。このため、プロテアーゼ阻害剤は、サンプル前処理時に必要とされない。ナノ粒子のこの​​属性は、それらの行いフィールド内のサンプル収集のために、室温...

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ディスカッション

臨床的関連

血清または血漿試料は、全体としての生物体の状態に関する情報の豊富な供給源を提供することができる低存在量の循環タンパク質およびペプチドを含むと考えられる。血清プロテオミクスの約束にもかかわらず、臨床的有益性10、11、16、25にバイオマーカーの発見および翻訳を阻止3つの基本的かつ重大な生理学的障壁があります。

1重要な診断バイオマーカーは、血液中の非常に低存在量（濃度）で存在し得る。このような前転移性癌病変などの早期病変組織、数mm 3未満を構成することができる。このような小さな組織体積から循環中に流されたバイオマーカーは非常に全体の血液量で希釈されたになります。関連の検体は、質量分析法と従来の免疫アッセイの検出限界未満で存在してもよい。

2。低存在量のバイオマーカー/タンパク質は、血漿プロテオーム14の最大90％を表し、アルブミンおよび免疫グロブリンなど...

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開示事項

Benjamin Espinaは、この記事で使用する試薬を製造するCeres Nanosciences, Inc.の従業員です。ランス・リオッタ、アレッサンドラ・ルキーニ、バージニア・エスピナは、この記事で使用されているナノ粒子技術に関する特許(米国特許7,935,518および/または8,497,137)を保有しています。大学の職員として、彼らは大学の方針に従ってこれらの特許からロイヤリティを受け取る権利があります。ランス・リオッタとアレッサンドラ・ルキーニはセレス・ナノサイエンスの株主であり、科学諮問委員会の委員を務めています。

謝辞

親切に図5に示すデータの収集と分析を支援し、マイケル·ヘンリー、ダブリン市立大学、。この作品は、（1）ジョージ·メイソン大学によって部分的にサポートされていた、イタリア/アメリカの枠組みの中で（2）イタリア語IstitutoSuperioreディ·サニ'米国保健社会福祉省、ジョージ·メイソン大学、公衆衛生のイタリア省、LAL〜（3）のNIH、IMATプログラム助成1R21CA137706-01と1R33CA173359-01、および（4）セレスナノサイエンス株式会社の間で協力協定。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ヒドロゲルナノ粒子セレスナノサイエンスCS003ナノトラップESP粒子
18 MΩ-cm水タイプ1試薬グレード水
トリスHCl、50 mM pH 7.0VWRIC81611650 mM、pH 7
アセトニトリルBDHBDH1103-4LPVWR水
酸化アンモニウムNH4OHBDHBDH3014VWRから入手可能、28-30% NH3
チオシアン酸ナトリウムでアッセイ 25 mMAcros Organics419675000血清/血漿サンプル用
多検体尿試薬ストリップシーメン2161尿サンプル用
トリスグリシンSDSサンプルバッファー (2X)Life TechnologiesLC2676RTで使用してSDSが沈殿する
のを防ぎますドライバスインキュベーター(100 oC) 加熱ブロック付きバーンステッド11-715-125DQ沸騰水浴を代用しないでください
窒素蒸発器マニホールドオルガノメーションアソシエイツMicrovap118血清/血漿サンプル用
遠心分離機、スイングアウトローターSorvallLegendシリーズ50mlチューブ容量、rcf 3,700 x g
遠心分離機、固定角ローターエッペンドルフ54241.7 ml微量遠心分離機容量、RCF 16,000 x
g 50 ml円錐形遠心分離機 チューブフィッシャーサイエンティフィ14-432-22尿サンプル用スクリューキャップ付き
1.5 ml 微量遠心チューブエッペンドルフ22363204
ボルテックスミキサーフィッシャーサイエンティフィック50-949-755
タイマーフィッシャーサイエンティフィS04782秒/分
から入手可能ナトリウムス ック ック

参考文献

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