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タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

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DOI：

10.3791/51872

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2015年8月2日

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1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

この記事について

サマリー

ほぼ全Sを含むタンパク質マイクロアレイを用いて、 セレビシエプロテオームは、並行して、タンパク質-タンパク質相互作用の何千もの迅速公正な尋問のためにプローブされます。この方法は、タンパク質 - 小分子、翻訳後修飾、およびハイスループットの他のアッセイに利用することができます。

要約

〜4,200組換え酵母タンパク質を含む高密度機能タンパク質マイクロアレイは、読み出しのためのV5エピトープタグを含むアフィニティー精製酵母キナーゼ融合タンパク質を用いてキナーゼタンパク質 - タンパク質相互作用のために検査されます。精製されたキナーゼは、GAL、誘導性プロモーター下キナーゼ-V5融合構築物を含むプラスミドを有する高コピータンパク質産生のために最適化された酵母株の培養により得られます。酵母は2％ガラクトースで誘導し、続いて6時間、中性の炭素源と制限された培地中で成長させます。次に、培養物を回収し、キナーゼアッセイにおける使用のための高度に精製されたタンパク質キナーゼを得るために、標準的なアフィニティークロマトグラフィー技術を用いて精製します。精製されたキナーゼアッセイのために適切な範囲のキナーゼ緩衝液で希釈し、タンパク質マイクロアレイは、タンパク質マイクロアレイにハイブリダイゼーションの前にブロックされます。ハイブリダイゼーション後、アレイをモノクローナルV5 antibでプローブしますキナーゼV5タンパク質によって結合したタンパク質を同定するODY。最後に、アレイは、標準的なマイクロアレイスキャナーを用いてスキャンされ、データは、インビボでの下流の検証のためのタンパク質の相互作用の高い信頼度のセットを決定するために、下流インフォマティクス分析1,2のために抽出されます。

概要

タンパク質生化学およびインビボでの結合活性のグローバル分析を実行する必要性は、タンパク質-タンパク質相互作用（のPPI）と全プロテオーム1,3-8の翻訳後修飾をプロファイリングするための新たな方法の開発をもたらしました。タンパク質マイクロアレイは、全長機能タンパク質4-6,8,9、または抗体10,11を含む分析タンパク質マイクロアレイを用いた機能性タンパク質マイクロアレイとして製造されています。これらは、12を解析幅広い生化学的に行うために必要な実験条件の多様を容易にするために、表面化学の様々な顕微鏡スライド上に配列されたタンパク質の高濃度を含むように操作されています。リジンを介して化学結合またはそのような他の13の中親和性結合のためのHisタグ付きタンパク質およびグルタチオンを取り付けるためのニッケルキレート化スライドのような親和性結合方法のためのニトロセルロースとアルデヒド表面化学。

タンパク質-タンパク質相互作用を検出するための機能的なタンパク質マイクロアレイの使用は、高品質な機能性タンパク質のライブラリ14へのアクセスを必要とする。S.セレビシエは、ハイスループットクロマトグラフィー精製技術とタンパク質構築物をタグ付けし、高コピー親和性の対形成により、このようなライブラリーを作製に適しています。酵母ゲノムの大部分が、配列決定されており、ほぼ全プロテオームの精製および生化学12を分析するための高コピープラスミドから発現させることができます。タンパク質が得られ、384ウェル形式に配列されると、それらは迅速なパラレルマルチパラメトリック生化学分析およびバイオインフォマティクス尋問8,14-16を可能に顕微鏡スライド上にプリントされています。タンパク質マイクロアレイは、タンパク質、脂質、小分子、および他の多くの用途の中で核酸と酵素アッセイと相互作用するために使用されています。プロテオームの表面上のタンパク質のアクセシビリティアレイは、免疫​​親和性などの分析的検出の異なるタイプにそれらを敏感に反応する表面プラズモン共鳴、蛍光、および多くの他の技術を表面。また、それは、生体内で行うのは難しいかもしれない実験条件の微調整を可能にします。

このプロトコルの目的は、タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、機能性タンパク質マイクロアレイの適切な使用を実証することです。このアプリケーションは、目的の高度に精製された分析物（タンパク質）を用いてタンパク質結合活性のハイスループット並列生化学的解析を可能にします。 C末端（カルボキシ末端）は、関心のV5融合ベイトタンパク質は、タンパク質精製のために最適化された酵母株における高コピープラスミドから生成されるタグ付き。 C末端タグは、全長タンパク質が翻訳されていることを保証します。この研究で使用されるタンパク質は、His6Xタグを介して、ニッケル親和性樹脂を用いて精製するTda1-V5融合タンパク質キナーゼです。 Tda1-V5融合constructは、アッセイで使用するための最も高度に濃縮された画分を溶出するためにイミダゾール勾配を使用して、シリアル溶出により精製されます。

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プロトコル

1.プローブの準備

  1. 培養し、以下のように他のタンパク質との相互作用を調べるために使用されるV5融合キナーゼプローブを精製します。
    1. 新しく作製した酵母株Y258を使用します（マタpep4-3、his4-580、ura3-53、leu2-3,112）（GATEWAYベクターpYES-DEST52から発現）V5融合タンパク質を含みます。マイクロアレイ上のプローブとして単離されたタンパク質を使用してください。合成完全ウラシル（SC-URA）/ 2％ブドウ糖/寒天に酵母をプレートと凍結培養（-80°Cグリセロールストック）から3日間30℃で成長します。
    2. 単一コロニーからスターター培養物（5〜ml）を接種し、30℃でのプラットフォーム（220〜250 RPM）やホイールを振るのSC-URA / 2％デキストロース中で一晩成長します。
    3. 翌朝は、0.1の最終OD 600に十分なスターター培養物を皮下-URA / 2％のラフィノース文化の400ミリリットルを接種します。
    4. 0.6の600は V5-キナーゼのfuのガラクトース誘導に続いてODまで接種を育てますシオンガラクトースの最終濃度が2％になるように3倍の誘導培地を希釈するのに十分に添加することにより、6％ガラクトースを補った3×酵母抽出物/ペプトン（YEP）の溶液を添加することによって表現を構築します。
    5. 振盪プラットフォーム上で6時間30℃で細胞を誘導します。適切な通気を確保するために2 L三角フラスコを使用してください。
    6. 4℃で5分間、1000×gで細胞懸濁液を400mlの紡糸によってJA-10（または同等の）ローターを用いて収穫細胞。
    7. 氷冷PBS緩衝液50mlで細胞を1回洗浄し、50mlコニカルチューブに移します。溶解のためのチューブキャップスナップ2ミリリットルに溶解し、転送に使用（洗剤または他の添加剤なし）の氷冷PBS緩衝液で再びペレットを洗浄。
    8. ペレットとピペット離れバッファに4℃で1分間20,000×gで細胞をスピン。
    9. 氷の上にチューブを置き、溶解ステップに進みます。
    10. 0の細胞を溶解（250〜350μlのペレット）1：1 0.5ミリメートルのジルコニアビーズ1細胞ペレットの体積、ビーズ、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶解緩衝液と4℃で2分間隔で3回攪拌プラットフォームを用いて混合物をボルテックス。
    11. 4℃で10分間、卓上微量20,000×gで溶解物を遠心します。
    12. ピペットポリカーボネート高速遠心チューブに上清を4℃で15万×gで30分間ulracentrufugationにより明確にします。
    13. ヒスチジンをキャプチャするために4℃で2時間、ニューテーター上で予備洗浄のNi 2+親和性樹脂（〜100μl）を含むチューブに清澄化ライセートを移し、インキュベート（彼の）6XがV5融合タンパク質をタグ付けしました。
    14. 洗浄緩衝液で4℃で10分間樹脂を3回洗浄します。 4℃、1,000×gで5分間、卓上遠心機を用いて樹脂をペレット化し、上清を吸引します。各洗浄のために新鮮な洗浄緩衝液を添加し、洗浄の間にチューブを攪拌するための旋回装置を返します。
    15. 洗浄後のSTEPSは、溶出のために新たにG-25カラムに洗浄した樹脂を適用し、完了しています。
    16. 9画分の合計のための50mM刻みで500 mMイミダゾールに100 mMのイミダゾールで始まる段階的に溶出バッファー25μlのを適用します。
    17. アッセイアッセイで使用するための最も高度に濃縮された画分を同定し、に使用するまで-80℃で30％ストアにグリセロールを添加することがドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）およびクーマシー染色を用いて回収した画分アッセイ。

2.アレイのプロービング

注：このアッセイを開始する前に、抗体溶液を調製するために、このセクションのステップ2.6を参照してください。

  1. 相互作用を検出するために、プローブ·バッファ内の260 ng / mlでのV5 -フルオロフォアコンジュゲート抗体（ すなわちのAlexaFluor 647）を希釈し、振とうして十分に混合します。
    注：使用してnutatにチューブを配置する30分前に、この抗体溶液を準備しますやホイール完全混合し、抗体の均質な懸濁液を確保します。
  2. 5-500 / mlの濃度範囲にわたってV5融合タンパク質プローブを希釈します。
    注：プローブ緩衝液を用いて、各タンパク質 - タンパク質相互作用アッセイのために最適化。最適化は、バッファをプローブするための複数のプローブを加えることを含みます。典型的には10μg/ mlの出発点として使用され、信号強度に基づいて、それに応じて調整されます。
  3. 冷凍庫（-20℃）からタンパク質マイクロアレイを削除し、使用直前に冷蔵庫に4℃にもたらします。
  4. タンパク質micorarraysを含むスライドホルダーに直接ブロッキングバッファー追加し、漏出を防ぐためにパラフィルムでトップをカバーしています。 4℃でのステージ上で50 rpmで振とうすることによって1時間ブロッキング緩衝液中の配列をブロックします。
  5. ブロックした後、4℃に冷却加湿チャンバーに配列を転送し、アレイ表面に直接希釈したプローブの90μlを添加します。 ARRをオーバーレイ1.5時間4℃で加湿チャンバーで上昇リフタースリップでaysと静的インキュベート（無振盪）。
  6. 3 50mlコニカルチューブにプローブバッファに1分ごとにアレイを3回洗浄します。完全にスライドを包むのに十分な予備冷却プローブ緩衝液を含むコニカルチューブにスライドを追加します。リフタースリップを静かタンパク質マイクロアレイ（これはアレイ表面に損傷を与える可能性があるので、それを強制的にオフにしない）のオフにスライドすることができます。
  7. 直前のような隆起したリフタースリップで洗浄（ステップ2.5）とオーバーレイを完了した後、アレイに直接抗体溶液を適用します。加湿チャンバー内で4℃で30分間、アレイをインキュベートします。
  8. （プローブ緩衝液中で3回1分）前と同じ洗浄工程を行い、室温で5分間、卓上遠心機で800×gで50mlのコニカルチューブをスピン。 647 nmでの配列をスキャンする前に30分間、暗所でスライドホルダーの配列を空気乾燥させます。

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結果

タンパク質-タンパク質相互作用活性は、約4,200ユニークS.を含む酵母機能的タンパク質マイクロアレイに対するベイトタンパク質として構築Tda1-V5タンパク質キナーゼ融合を評価するために、標準的なチップリーダーを用いて観察されましたセレビシエ GST融合タンパク質。 GENEPIXソフトウェアとさらに尋問は、様々な強度の結合事象の多くを明らかにしました。親和性は、その標的（V5-キナーゼ）に結合したモノクローナルV5 - フルオロフォアコンジュゲート抗体に由来する信号の段階的な強度から測りました。 ProCatスコアリングアルゴリズム2（それぞれのタンパク質は、アレイ上の二回スポットし）連でアッセイしたタンパク質のそれぞれのための2つの別個のタンパク質マイクロアレイを横切って、タンパク質-タンパク質相互作用を同定するために使用された後、閾値カットオフを観察し相互作用をスコアリングするために決定されました。

二つの配列を比較することによって、一つはint型を判断するために使用できる4技術的反復（N = 4）を取得します相関...

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ディスカッション

プロトコルは提示本来インビボ 1 で新しいキナーゼ相互作用ネットワークの識別をもたらす酵母プロテインキナーゼの異なるファミリーおよび関連にわたって結合活性を比較するために85のユニークな酵母タンパク質キナーゼ-V5融合タンパク質を用いて行きました。新興プロテオミクスプロファイリング技術として、高スループット（HTP）ペプチドライブラリー、および、真核生物および原核生物のモデル生物8,17に依存していたタンパク質マイクロアレイを用いたプロテオームのスクリーニングの開発、後で、このアッセイプラットフォームは、植物およびヒト5,7などの高等真核生物に適用しました。現在のところ、市販の酵母タンパク質配列はありません。しかし、配列は、cDNAコレクションは、複数のリソースから入手できます。検証しました

技術が強力なことができますが、心に留めておくべき注意点が1つのアッセイは、インビトロで行われ、こうして結果が偽陽性を持っているということです。したがって、op...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業はNIHからの助成金によって支援されました。図1に示すアッセイは、Joseph Fasolo博士によって行われました。Rui Chen博士の有益なコメントに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ペトリ皿VWRNC-10747または同等の
バクト酵母エキスDifco0217-17
バクトペプトンDifco0118-17
バクト寒天Difco0140-01
デキストロースシグマD9434
ラフィノースシグマR0514
ガラクトースSigmaG0750
Sc-Ura ドロップアウト培地MP Bio114410622
Small Culture tubesVWR/Fisher
Large Erlenmeyer FlaskVWR/Fisher
Centrifuge JA-10 rotor
Centrifuge tubes (500 ml)
Falcon tube (50 ml)VWR/Fisher21008-951
PBSタブレットグマP4417
FastPrepチューブ(2 mlスクリューキャップチューブ)
FastPrep MachineMP Biomedicals116004500
Zircon BeadsBioSpec11079105
Triton X100SigmaP4417
DTTSigmaD9779
MgCl<サブ >2グマM8266&>
NaClSigmaS3014 
イミダゾール(pH = 7.4)SigmaI5513 
PMSFSigma93482
コンプリート インヒビター カクテル (EDTA フリー)ロシュ11873580001
ホスファターゼ インヒビター カクテル 1シグP2850
BSAシグマA2153 
Tween-20SigmaP1379 
ATPシグマA1852 
振とうインキュベーター(30°C;C)
ニッケルアフィニティ樹脂Life TechnologiesR901-01
G25カラムGEライフサイエンス27-5325-01 
ニューテーターVWR/Fisher
SDS-PAGE ゲル (NuPage)Life Technologies
Coomassie Blue StainLife Technologies
Monoclonal V5 AntibodyLife TechnologiesR960-25
Alexa647 タグ付きモノクローナルV5Life Technologies451098
Protein MicroarraysキットライフテクノロジーPAH0525013
Genepix スキャナーモレキュラーデバイス
リフター スリップトーマス・サイエンティフィックhttp://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
溶解バッファー: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT,
2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM イミダゾール (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail –EDTAフリー、ホスファターゼ阻害剤カクテル1、1 mM PMSF (使用直前に追加)		試薬を1x PBS(0.01 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウム、0.137 M塩化ナトリウム、pH 7.4)に加えて、所望の量の溶解液を得る
ブロッキング緩衝液:1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%Tween-20試薬を1x PBSに添加して、所望の量のブロッキング緩衝液を得る
プローブバッファー:2 mM MgCl2、0.5 mM DTT、0.05% Triton X-100、50 mM NaCl、500 μM ATP(キナーゼ用)、1% BSA1x PBSに加えて、必要な量のプローブバッファーを得る
Wash Buffer:0.1% Triton X-100、500 mM NaCl、0.5 mM DTT、50 mM イミダゾール(pH 7.4)、2 mM MgCl21x PBSに加えて、必要な量のプローブバッファーを得る
溶出バッファー:0.1% Triton X-100、0.5 mM DTT、2 mM MgCl2、500 mM NaCl、50 –500 mMイミダゾール(pH 7.4)、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル–EDTAフリー、ホスファターゼ阻害剤カクテル1、1 mM PMSF(使用直前に追加)始める前に、イミダゾールの濃度勾配(50 – 500 mM)に注意し、濃度ごとに別々のチューブを作成することが重要です(50 mM刻みを使用して間隔を作成することをお勧めします)。試薬を1x PBSに加えて、所望の量のプローブバッファー3x
YEP +6%ガラクトースを得る:酵母抽出物30 gとペプトン60 gを700 mlのH2Oに溶解し、オートクレーブします。フィルター滅菌した20%ガラクトース(wt / vol) ガラクトースはオートクレーブ滅菌しないでください
シマ 抗体 ズ 試薬を試薬をを300ml加えます

参考文献

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