アン体外モデル

Summary

グロボイド細胞は、現在効果的な長期治療を欠いている白質ジストロフィーであるクラッベ病の決定的な病理学的特徴です。私たちは、活性化ミクログリアの自然生物学的および病原性の可能性と、それらがグロボイド細胞に形質転換するための細胞培養モデルを開発しました。

Abstract

球様細胞白質萎縮症（GLD）の中枢神経系においてユニークに豊富に存在する球様細胞と呼ばれる多核ミクログリアの正確な機能は、不明である。知識のこのギャップは、研究のためのin vitroモデルで適切なの欠如によって妨げられてきた。ここで、私たちは初代マウスグリア培養系を記述するGLDで見られる特徴的な球様細胞に似たミクログリアの多核化におけるサイコシン結果による治療中。この新規なシステムを用いて、グロボイド細胞の研究のための条件および分析のモードを定義した。このモデル系の使用の可能性は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）のための潜在的な役割を同定し、当社の以前の研究で検証された-3 GLDに。 インビトロ系でのこの小説はこれらのユニークな細胞の形成と機能だけでなく、潜在的な治療操作を、研究するのに有用なモデルかもしれません。

Introduction

また、クラッベ病として知られている球様細胞白質萎縮症（GLD）は、galatocerebrosidase（GALC）遺伝子¹における機能変異の喪失に起因する致命的な脱髄性疾患である。 GLDの最も一般的な形態は、幼児期に発症に代表される、多くの場合、年齢^2,3、5年前にモーターと早死につながる認知機能低下の積極的な臨床経過することを特徴とする乳児変種です。遺伝子検査は、GLD ⁴の診断を確認するために使用される。 GLDの神経病理は、球様細胞^5-7と呼ばれる広範な脱髄、神経細胞の萎縮、アストログリオーシスおよび充血多核ミクログリアの存在が明らかになる。これらの目立つ細胞の特定の機能は、とらえどころのない推移しているものの、多くの場合、それらの細胞質内に管のある介在物を含む球様細胞の同定は、過去97年間のGLDの決定的な特徴となっている。

非myelの関与GLDの病因におけるinatingグリア（ミクログリアおよびアストロサイト）は、長いこの病気⁸における深遠な脱髄に二次応答と考えられてきた。興味深いことに、1916年⁵クヌードクラッベによるこの病気の最初の説明は、「球様細胞」と命名し、この病気の決定的な特徴であるされた脂質の破片を含む多核食細胞の形成を報告した。

GLDでの役割は長い間無視....

Protocol

動物に関わるすべての手順は、実験動物の愛護管理と使用に関する方針に従って行った実験動物福祉（NIH）の事務所が定めるだけの大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）から承認を得てコネチカット保健センター。

混合グリア培養物の調製

1. 使用前にすべての楽器を滅菌する。冷たい保つために氷の上で維持さ3の滅菌60ミリメートルペトリ皿にマグネシウム（Mg ^{2 +}またはCa ^{2 +}を）全くの陽イオンを含まない氷冷滅菌ハンクス液（HBSS）の3ミリリットルを追加します。
2. 以前に^17,18に記載され^ているように、出生後のP0〜P2の仔マウスからの皮質を分離します。
   注：このような海馬などの皮質下構造は、これらの培養物に含まれていません。
3. ねを使って、慎重に髄膜を除去した後、新鮮なHBSSに隔離皮質を転送し、酵素的に組織を解離製造業者のプロトコルに従ってウラル組織切開キット。
4. プレート細胞無菌T-175フラスコに及び[1×ペニシリン/ストレプトマイシンを含む10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）]を培地中で一晩インキュベートする。
5. 新鮮な培地と次の日、すべてのメディアを交換してください。約3週間または携帯単層が確立されるまで、通常のメディアの変化と、文化をインキュベート....

Results

このプロトコルは、書かれたように、（：実験ワークフロースキーム図1を参照してください）最初から最後まで完了するのに約36日かかると予想される。サイコシンに応答した多核細胞の形成は、一貫して7日間の処理で観察されている：それは、この初代培養系における「球様様」細胞の開発は信頼性と再現性の両方であることを私たちの経験をされています。

大型の識別を可能にする核対比染色と併せて伊庭-1を使用しミクログリアの免疫細胞化学染色は、多核細胞を丸く（ 図1b）。いくつかの例では、これらの球様細胞様細胞の核内容が明確な核と一緒に表示されます。しかし、多くの場合、核の大きさの総額の拡大は、これらの細胞（ 図1b）の多核の状態を反映している。グロボイド細胞様細胞の数は、視野を視野で変えることができるそれはインビトロで形成された球様細胞の割合が<総ミクログリア細胞集団の5〜10％を表していることは注目に値する。それはサイコシン治療はまた、これらの培養における単核ミクログリアおよび多.......

Discussion

ここに記載されているプロトコルは、活性化したミクログリアと球様細胞の発達および機能的特徴を研究するための新しいモデルシステムを提供します。イムらによる以前の研究。 HEK293細胞株を使用する球様細胞形成の研究のための²¹本のプロトコルの開発のためのテンプレートを提供した。それは、モデルで導出球様細胞がGLDにおける識別可能なネイティブ球様細胞とは異なることを指摘することも重要です。 GLD中球様細胞が頻繁に10の核を超える含有が観察されているが、たとえば、私たちは日常的に、私たちのマウス培養におけるミクログリアのquadranucleationを観察している。 in vivoで観察されるものと比較して、第二に、in vitroの系で形成された球様細胞も直径が小さい。使用される培養系の相対的な単純化を含んでもよいこれらの表現型の違いのために、いくつかの理由がある可能性が高い。例えば、全く存在しないこの一次グリア培養手順を用いて、球様細胞形成の誘導期の間に存在するニューロンまたはオリゴデンドロサイト。また、7日間のプロトコルのタイミングは球様細胞の有意な密度が得ら.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ハンク陽イオンを含まない平衡塩溶液(HBSS)(Mg2+およびCa2+)。	ライフ	テクノロジー14175-095
神経組織解離キット	Miltenyi	130-092-628
40 μm細胞ストレーナー	フィッシャーブランド	22363547
Hank'陽イオン(Mg2+およびCa2+)を含む平衡塩溶液(HBSS)。	Gibco	14025-092
ダルベッコ修正イーグル培地 (DMEM)	Gibco	11995-065
ウシ胎児血清 (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilin/Streptomycin	Life technologies	15070-063
Laminin	Sigma	L2020
Trypsin-EDTA solution	Life technologies	25299-056
サイコシン	Σ	P9256
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Σ	D2650
パラホルムアルデヒド (PFA)	電子顕微鏡 科学	19208
正常ヤギ血清 (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iba-1	和光	019-19741
Alexa Fluor 結合antisera	Life Technologies	各種
封入剤	Southern Biotech	OB100-01
食作用アッセイキット	ケイマンケミカル	500290
HEPES	Σ	BP310-500