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方法論記事

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージングのApc最小/ +腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

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⸱

DOI:

10.3791/51916

⸱

2014年10月6日

 ,  , 
1Department of Oncology, INSERM U661, Functional Genomic Institute, 2Department of Anatomy, University of California

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

トランスジェニックレポーターマウスと注射可能な蛍光標識を使用することにより、長期の生体内スピニングディスク共焦点顕微鏡法は、ApcMin/+結腸直腸癌モデルにおける骨髄細胞の挙動を腸腺腫に直接可視化することを可能にします。

要約

骨髄細胞は、腫瘍内の最も豊富な免疫細胞であり、腫瘍の進行を促進することが示されている。現代の生体内イメージング技術は、臓器内部の生きた細胞挙動の観察を可能にするが、そのような腸などの臓器や腫瘍のアクセシビリティのためにいくつかのタイプの癌に挑戦することができます。腸腫瘍の直接観察は、以前に報告されていない。ここで説明する外科的処置は、トランスジェニック蛍光レポーターマウスおよび注射トレーサーまたは抗体を使用して生きたマウスにおける腸腫瘍内の骨髄細胞動態の直接観察を可能にする。この目的のために、迅速な画像取得との長期の連続撮影を可能にする四色、マルチリージョン、マイクロレンズ化スピニングディスク共焦点顕微鏡が用いられている。交差して小腸内の複数の腺腫を発症Apcの 最小 / +マウス骨髄細胞を可視化するには、c-FMS-EGFPマウスを用いたとACTB-ECFPマウスを用いた陰窩の腸上皮細胞を可視化した。そのような血管および好中球、および漿膜面を画像化するために、腫瘍を位置決めするための手順と異なる腫瘍の成分を標識するための手順も記載されている。イメージングの数時間からコンパイルタイムラプスムービーは、腸の微小環境におけるその場での骨髄細胞の挙動の分析を可能にする。

概要

圧倒的な証拠が、腫瘍の微小環境は、線維芽細胞、内皮細胞、免疫および炎症細胞、細胞外マトリックスおよび可溶性因子を含む不均一な細胞集団からなる、ほぼすべてのに寄与することによって、固形腫瘍の開始と進行に重要な役割を果たしていることを示している癌1の特徴。実際、腫瘍進行中に、悪性2に有利な微小環境を生成するために進化し、形質転換癌細胞と間質細胞との間の一定の動的相互作用が存在する。腫瘍微小環境に浸潤する免疫細胞の中では、骨髄細胞を3で最も豊富である。 （TAM）腫瘍関連マクロファージから成る、骨髄由来サプレッサー細胞（MDSCを）、樹状細胞（DC）及び好中球（PMN）、骨髄細胞は骨髄から動員されると次第にサイトカイン、増殖因子及びプロテアーゼ放出、腫瘍に浸潤する促進することができます腫瘍増殖および4を広げる。がん細胞および骨髄細胞間のクロストークが複雑で動的である。従って、それらの相互作用の性質を理解することは、これらの細胞ではなく、抗腫瘍免疫応答に関与する癌の進行を促進する理由を決定するために重要であり、それを制御するための新しい目標を発見するのに役立つ。

生体顕微鏡による直接観察が生きたマウス5の組織内細胞動態に関する情報を提供します。四色は、多領域は、マイクロレンズ付きスピニングディスク共焦点システムは、乳腺腫瘍6内の間質細胞を研究するために設計された。このアプローチは、長期の連続撮影を可能にし、そのような運動アーチファクトを最小化するためには、（a）迅速な画像の取得、（b）は、長期の麻酔、（c）は、異なる細胞型に追従す​​る4色の取得、（d）の蛍光標識のようないくつかの利点を含む異なる腫瘍コンポーネント、および異なる腫瘍微小環境のウィットの（e）の観察マウス変動7-9にマウスを避けるために、同じマウスヒン。この技術により、異なる細胞行動が腫瘍形成の進行段階を表示する乳癌ウイルス（MMTV）プロモーター駆動オーマミドルT癌遺伝子（PyMT）モデルで報告されている。制御性Tリンパ球（Foxp3のEGFP導入遺伝子によって可視化Tregは、）のDC（CD11cの-DTR-EGFP）、癌関連線維芽細胞（FSP1 + / + -EGFP）および骨髄細胞（C-FMSのに対して、血管に近接して優先的に移行-EGFP）は、腫瘍塊内でよりも腫瘍周辺で高い運動性を示す。急性の全身性の低酸素状態において、細胞は、異なっ移行：Tregは6を移動し続ける骨髄細胞とは対照的に移行停止。また、同じマウスモデルでは、腫瘍段階とドキソルビシン感受性の変化を示したが、薬物分布は、薬物反応、およびドキソルビシンに関連している治療は、腫瘍への骨髄細胞のCCR2依存動員につながる。したがって、ライブイメージングはまた、その場および化学療法抵抗10,11の生物学における薬物応答への洞察を得るために使用することができる。

大腸腺腫様ポリポーシス（APC）遺伝子変異は、一般的にヒト結腸直腸腺腫および癌腫12および大腸癌13に非常に高いリスクを与える家族性大腸腺腫症（FAP）、中APC遺伝子結果の単一コピーの変異で起こる。マウス系統のApc 最小 / + は、APC 遺伝子のコドン850での切断変異を運び、自発的にすべての小腸14〜16を介して複数の腸腺腫を開発しています。腹膜腔を開くと、腸へのアクセスのために必要があるため、腸の長期生体内イメージングは​​、原因処置の侵襲性の挑戦である。短期ライブイメージングSTudiesは、以前に健康な腸17,18上で公開されているが、腸腫瘍の長期の直接観測が報告されていない。外科的処置は、以前に画像乳房腫瘍6,10に使用される生体スピニングディスク顕微鏡システムを使用して、腸の漿膜表面を介して腫瘍を可視化するために設計され、洗練されている。本論文では、プロトコルは、1 は 、APC 最小 / +マウスを使用することにより、小腸の腫瘍内の骨髄細胞の挙動に追従することを可能に記載されている。

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プロトコル

注：すべての動物実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）、UCSFによって承認された手順に従って行った。すべての画像化実験は、非生存手順た動物を、画像取得の終了の直後に安楽死させた。

マウスの1世代

注：Apcの最小/ +マウス、APC遺伝子上の変異を有する、自然に小腸で50-100腺腫を開発しています。

  1. クロスApcのアクチンプロモーター下にECFPを表現ACTB-ECFPラインと最小/ +マウス、および骨髄細胞を検出するために、C-FMSプロモーター下にEGFPを発現するのc-FMS-EGFPライン、とのさらなる。 ACTB-ECFPおよびc-fmsの-EGFPについてヘテロ接合性の動物を、蛍​​光を検出するために使用される。
  2. 画像明らかに検出腺腫に生後3〜4ヶ月でマウスを使用してください。

Mの調製手術前aterials

NOTE：顕微鏡セットアップの詳細は、以前に6,7に記載されている。

  1. 顕微鏡
    1. 加熱ブランケットをオンにします。 488nmの励起固体を405nm、561 nmの波長は640nmレーザ用のアルゴンレーザーをオンにします。顕微鏡をオンにし、回転するディスク制御部と、AOTF、レーザ制御部と、カメラコントローラ。
    2. 赤色LEDを点灯顕微鏡シャッターを開きます。コンピュータとカメラのソフトウェアの電源をオンにします。
  2. イメージングプラットフォーム
    1. ステージインサートが汚れていないことを確認してください。それ以外の場合は、石鹸と水、次いで、乾燥した清潔な。
    2. 2カバースリップを取り、挿入時に、それらを保護するためにラボのテープを使用しています。ステージ上でインサートを置き、アルコールワイプで清掃してください。
    3. ラボのテープを使用して、ステージの右側に加熱ブランケットを添付します。
    4. ノーズコーンにゴム製のダイヤフラムの整合性を確認し、necessarに応じて変更しますyを。ガーゼとラボテープを用いて動物にイソフルラン麻酔送達用ノーズコーンを置き、固定します。
  3. イソフルラン麻酔システム
    1. イソフルランタンクを補充。
    2. 真空をオンにして、/分1.2リットルに調整します。
    3. 噴霧器に蒸留水を追加し、イソフルランシステムにネブライザーを接続してください。
    4. 酸素分析計の電源を入れ、イソフルランシステムに接続します。酸素タンクをオンにして、酸素濃度計が100％を示していることを確認してください。 /分0.2リットルのO 2流量を調整します。
    5. 窒素タンクをオンにして/分0.8 Lの流れを調整します。酸素濃度計は21％を示していることを確認してください。
  4. 手術ツールとプラットフォームの準備
    1. 石鹸と水で切開鉗子と鋏の2ペアを清掃してください。
    2. ホットビーズ滅菌器の電源を入れ、250℃に到達しましょう​​。 30秒間の手術ツールを滅菌する。彼らは冷やすましょう。
    3. 手術台にラボおむつカバーを置きます。
    4. 外科的プラットフォームとして発泡スチロールの蓋を使用します。ラボおむつカバー片で覆う。マウスを剃毛した後に変更するためにラボおむつカバー2枚目を準備します。
    5. 覆われた発泡スチロールの蓋の上麻酔のラインにノーズコーンを置き、いくつかのテープで発泡スチロールの蓋（しないラボおむつカバー上）に添付して所定の位置に維持するためにノーズコーンの両側に2本の針を使用しています。
    6. ベタジン、アルコール綿、滅菌ガーゼ、スーパー接着剤、顕微鏡用スライド、電気シェーバー、とラボテープの4個を組み立てます。

注射剤の調製

  1. 水面下では、2000 kDaのローダミン - デキストラン（4 mg / mlの100μlの中にストック·AF647共役のLy-6G（群Gr1）抗体（1 mg / ml）を、7μlのインスリン注射器（28 Gのx½中）を調製）後眼窩注射のため。これらの動物に発症する貧血は、尾静脈のdifficuを作るので、後眼窩注射は、Apcの最小/ +マウスで推奨されているLTは、皮膚を通して検出する。
  2. 腸の蠕動運動を減衰させるために画像化する前に、1mg / kgの皮下（sc）を150μlのPBS中に希釈アトロピン注射して第二のインスリン注射器を準備します。

イメージングのための腸の4。準備

  1. 誘導室に麻酔ラインが開放されており、手術台や顕微鏡へのラインが閉鎖されていることを確認します。
  2. 麻酔室に動物を転送します。麻酔チャンバーを閉じ、（21％O 2で）4％にイソフルランをオンにします。
  3. マウスは（5-6分後に）深くゆっくりと呼吸すると、その腹部に外科的ステージに転送し、群Gr1抗体溶液および/またはデキストラン溶液の眼窩を注入。
  4. 外科プラットフォームにリンク麻酔ラインを開きます。麻酔室にラインを閉じ、麻酔コーンでの鼻との背中の上でマウスを置く。
  5. イソフルランを削減2.5％4％の濃度。
  6. マウスは十分にそのフットパッドをつまんで角膜反射をテストすることによって麻酔をかけていることを確認します。
  7. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に眼科潤滑軟膏を追加します。
  8. ラボテープを追加することにより、外科的ステージにマウスの手足を固定します。
  9. 電気シェーバーを使用して、腹面から髪を削除します。また、買収前に酸素濃度計を配置するために、左後肢から毛を取り除く。外科段階から研究室のおむつカバーを外し、髪の汚染を避けるためクリーンなものと交換してください。
  10. アルコールワイプとベタジンで腹面を消毒する。
  11. マウスのワン脇腹に皮下 （3.2）アトロピン液を注入。
  12. 皮膚やハサミを使用して、腹膜や鉗子の1対を介して1センチメートル腹側正中切開を行います。慎重に腸3-4センチ引き出し、イメージにつまたは複数の腫瘍を同定。
  13. ガラスMICRを取るoscopeスライド位置上部の腫瘍を、その上に、腸のループ。
  14. スライドに付加する腸に沿っていくつかの場所にいくつかのスーパー接着剤を追加します。接着剤が乾燥するために1つの分待ちます。共焦点とその局在を容易にするために、腫瘍を指してスライド上に線を描画するためにマーカーを使用してください。

5。位置決めステージ上のマウスと準備画像取得のための

  1. 手足からラボテープを外します。
  2. 顕微鏡ステージへの麻酔ラインを開き、外科プラットフォームに1を閉じます。
  3. 下にその腹側とノーズコーンでの鼻顕微鏡ステージに慎重にマウスを転送します。いくつかの研究室テープで麻酔ラインを固定します。
  4. 再位置マウスおよび/またはカバースリップをウィンドウのいずれかの中心に腸を持っているためにスライド。そっとラボテープでスライドを下テープで固定します。
  5. マウスの左肢に酸素濃度計プローブを取り付けますその心臓および呼吸数に従い、酸素飽和レベル動脈。
  6. 低体温症を避けるために、加熱ブランケットマウスをカバー。
  7. イメージングのために1から1.5パーセント、2.5％からイソフルラン濃度を下げます。

マイクロマネージャーソフトウェアを使用して画像の取得6。

  1. 構成設定での画質を向上させるために2,500 rpmまでCSUX速度を上げます。
  2. 10X 0.5 NAまたは20X 0.75 NA Fluarレンズ目標を選択することが目的のドロップダウンメニューを使用します。
  3. カラードロップダウンメニューからのレーザは405nmを選択してください。
  4. ライブをクリックして、顕微鏡でピントを調整します。
  5. 自動的に画像の極端な画素値に基づいて、表示画像の最大値と最小ピクセル強度を調整する自動クリックしてください。表示画像のピクセル強度のヒストグラムは、メインウィンドウの下部のグラフに示されている。
  6. パイパー[コントロールパネル]ウィンドウで、カメラの露出を調整することによりクロック数を（1クロックは33.333ミリ秒）に変更する。
  7. 信号が最低の暴露と明るすぎる場合には、顕微鏡制御部を用いてレーザ強度​​を低下させる。
  8. 488nmで、561 nmおよび640 nmのレーザーライン用の信号強度を確認してください。レーザ自身の制御ユニット（488 nmおよび561 nm）以下顕微鏡制御部と、レーザ強度​​を調整します。
  9. マルチDアクイジション·ウィンドウで、タイムポイントボックスをチェックし、時点の数と所望の時間間隔を入力します。
  10. Z-スタックボックスをチェックし、「相対Z "を選択し、現在の位置までのZの開始およびZエンド相対を定義します。
    注：10Xまたは20X客観的には、離れてそれぞれ3 Z平面、8μm以上4μmで始まります。
  11. いくつかの場所を撮像するための複数の位置（XY）ボックスをチェックし、その後、編集位置リストをクリックして4から6の異なる位置をマークします。
  12. チャンネルボックスをチェックし、ドロップダウンメニューと標準の[新規]を選択レーザーラインからチャネルを追加（33.333ミリ秒の倍数）各チャンネルの露光の電子。
  13. 「マルチD取得」ウィンドウで[保存画像を確認してください。
  14. フォルダを選択し、取得したすべての画像は、自動的に指定された名前の接頭辞で、このフォルダに保存されます。
    注：各連続取得は、各時点での各色の各Zスライスの個別のTIFFファイルとして個別のサブフォルダに保存されます。
  15. マルチDアクイジション·ウィンドウで設定の保存]をクリックしてすべての設定を保存します。
  16. 取得を開始するために多次元の取得]ウィンドウに取得]をクリックします。
  17. オキシメータプローブが使用されていないか、うまく動作しなくなった場合（パルスが安定または検出が困難でない場合）、フットパッドをつまんと角膜反射をチェックすることにより、麻酔の効率化を画像化手順の間に15分ごとに確認してください。マウスはこれらの刺激に応答する場合は、麻酔を調整します。
  18. 買収後、イソフルランコンセントを増やすことによって、マウスを安楽死させる5％配給。全く呼吸の動きが検出されない場合には、段階からマウスを削除し、頸椎脱臼を行います。

Imarisソフトウェアを利用した画像の解析7。

  1. ファイル（ 補足図1A）.imsへの変換
    1. カメラのソフトウェアを開き、[ファイルにバッチコンバーターをクリックします。
    2. 追加のファイルをクリックして、最初の位置の最初のファイルを選択します。各位置について、この手順を繰り返します。
    3. アップロードされたファイルごとに、[設定]をクリックすると、Zスタックのための時間チャンネルについては、「C」および「Z」の設定「t」がこの順序で表示されていることを確認します。
    4. 任意のフォルダに保存します。ブラウズし、変換されたように、新しいファイルを作成します。
    5. すべてのセットをクリックして起動します。
  2. 調整（ 補足図1B）
    1. 具体的な変換されたフォルダに移動し、最初のファイルを開きます。
    2. 表示調整ウィンドウでは、背景を調整必要に応じて各チャンネル毎に最小番号を変更することにより、信号遮断。
    3. 必要であれば、最大数（下位最大数、より高い信号の強度）を変更することにより、信号強度を調整する。
      注：信号強度/コントラストの調整は、よりよい視覚化を持つために細胞の挙動または区画のハイライトを有効にしてください。それは、結果自体は変更されません。
    4. 編集と画像のプロパティをクリックします。
    5. x、y、およびzの値に変更し（10×対物レンズ、xとy = 0.712、zは=8μmのために、20X対物レンズ用：xとy = 0.36、zは= 4）を形成した。
    6. 時間点を調整するためにすべての等距離をクリックします。開始日を追加して、買収の開始時刻。買収（ 補足図1C）の終了日と終了時刻を追加します。
    7. 映画を見て、再生ボタンをクリックします。
    8. [編集]をクリックし、ぼやけた画像を削除するには、時間点を削除します。
    9. つの別個の買収峠に参加するにはTHER 1ムービーに、最初の映画の最後の時点に移動し、[編集]をクリックしてください> 2番目のファイルを追加した時点を追加します。
  3. ムービーとして保存する（ 補足図1D）
    1. 録音をクリックして、のMOV拡張子と0の圧縮率を選択します。
    2. [保存]をクリックします。

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結果

ACTB-ECFP;のc-fmsの-ECFPマウスは、漿膜面から可視化することができるスピニングディスク共焦点顕微鏡、Apcの最小/ +の小腸における非腫瘍及び腫瘍組織を使用することによって。イメージングの後、カメラのソフトウェアは、分析し、獲得（ 補足図1）を調整するために使用される。蛍光2000 kDaのデキストラン-ローダミンの静脈内（iv）注射とのLy-6G 647コンジュゲート抗体、後の血管およびPMNを、それぞれ（ 図1）を検出することができる。リンパ組織の集合体であり、骨髄細胞の完全な、簡単に見ることができパイエル板 （ 図1A）。小腸の陰窩は、血管および骨髄細胞（ 図1Aおよび1B）に囲まれている。腫瘍組織は、多くの場合、より多くの血管新生し、より骨髄細胞によって浸潤され、陰窩の構造は、wの少ないエル腫瘍の大きさに応じて（ 図...

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ディスカッション

本論文では、詳細なプロトコルは、腸の漿膜側から撮像生きた動物での数時間のために腸腫瘍における骨髄細胞動態のディスク共焦点画像を回転させる方法が記載されている。

炎症を避けるために、最適な生理学的条件を持つように、腸の画像化は、無傷の器官に行われなければならない。光が上皮に到達する前にそのような平滑筋などの異なる組織層を通過する必要があるので、腸の漿膜側からの画像化は、困難である。アクチンは高度に平滑筋細胞によって発現されるので上皮に着目し、特にアクチン-ECFPレポーターマウスにおいて、一部の地域では困難である。二光子顕微鏡法、共焦点顕微鏡と比較してより深い組織浸透性の利点を有するが、ここでは回転ディスク共焦点顕微鏡は、腸上皮構造の良好な可視化を得るために十分に強力であることを見出した。利点はOFの回転ディスク顕微鏡、共焦点分解能を犠牲にすることなく、非常に迅速な取得と独特の感性のための能力が含まれています。これらの資質は、いくつかの時間点による動きアーチファクトを削除する必要があり、光損傷を最小化し、比較的弱い蛍光分子のイメージングを可能にする場合でも、動的プロセスの観察を可能に...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは 、APC 最小/ +マウスのジェノタイピングのための英ゆうに感謝したいと思います。この研究は、INSERMと国立衛生研究所からの助成金（CA057621およびAI053194）からの資金によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ApcMin/+ マウスJackson Laboratory2020
ACTB-ECFP マウスJackson Laboratory3773
cfms-EGFP マウスJackson Laboratory18549
2,000 kDa デキストラン、ローダミン標識InvitrogenD7139
イソフルランバトラー アニマルヘルスサプライ29450
窒素UCSF
酸素UCSF
1x PBSUCSF 細胞培養施設
生理食塩水UCSF 細胞培養施設
抗マウス Ly-6G (GR1) 抗体 AF647UCSF モノクローナル抗体コアストック 1 mg/ml. 7 μg/マウス
アトロピンLARC UCSF1 mg/kg マウスで使用
アルコール ワイプベクトン ディキンソン326895
28 G x 1/2 インチ インスリン シリンジベクトン ディキンソン329465
レミウム カバー ガラスフィッシャー サイエンティフィック12-548-5M24x50-1
ベタジンLARC UCSF
ヒート ブランケットゲイマー産業 ホットビーズ
滅菌器ファインサイエンスツール18000-45使用の30分前に電源を入れ
綿チップアプリケーター 6インチ電子顕微鏡科学72310-10
麻酔システムサミット麻酔サポート
倒立顕微鏡カールツァイス株式会社ツァイスアクシオーバート 200M
ステージインサート応用Sientificインスツルメンテーション
ライフサイエンスMouseOx
ネブライザーサミット麻酔サポート
イマリスビットプレーン
μUCSFオープンソースソフトウェア
ICCDカメラスタンフォードフォトニクスXR-Mega-10EX S-30
スピニングディスク共焦点サカンヘッド横河電機株式会社CSU-10b
てください マウス牛酸素濃度計、ソフトウェア、センサースターベール研究室マネージャー

参考文献

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