ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動（2DE）および質量分析（MS）は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
腫瘍の開始と進行に関与する分子の同定は、患者の臨床管理のために、結果として、理解病の生物学のための基本であり。本研究では、慢性リンパ性白血病（CLL）の進行に関与する分子の同定のために最適化されたプロテオミクスアプローチを説明する。詳細には、白血病細胞溶解物を、2次元電気泳動（2DE）によって解決され、2DEゲル上の「スポット」として可視化した。プロテオームマップの比較分析は、採取、単離および質量分析（MS）により同定される（存在量および翻訳後修飾の点で）示差的に発現するタンパク質の同定を可能にする。同定された候補の生物学的機能は、私たちが一次白血病細胞のために最適化されていること、異なるアッセイ（ すなわち遊走、接着およびF-アクチン重合）によって試験することができる。
概要
慢性リンパ性白血病（CLL）、西洋諸国の中で最も一般的な成人の白血病は、モノクローナル腫瘍性CD5 + Bリンパ球の蓄積から派生し、臨床的に非常に不均一である。それは、モノクローナルB細胞リンパ球増加症（MBL）1,2,3として定義前白血病の形として存在することができる。病気はどちら無痛臨床経過と表示されることが他のケースでは、それは、治療を必要とする前に、何年も安定した状態を保つことができ、あるいは予後不良を伴う進行化学療法抵抗性疾患などの治療にもかかわらず。最後に、頻繁に致命的な高悪性度リンパ腫（リヒター症候群-RS）2,3,4に進むことができる。疾患の転帰および生存の予測因子に関する補足情報を提供して予後因子のセットに基づいて、良い面と悪い予後：患者は通常、2つの主要なサブセットに分類される。臨床異質性が可能性が高い生物学的な不均一性を反映している。遺伝、微小環境およびCEの数全く統一メカニズムは5見出されていないにもかかわらずllular因子は、疾患の病因に同意することが示されている。詳細には、いくつかの研究は、疾患の臨床経過の差が部分的に予後値6,7,8を持ついくつかの生物学的マーカーの存在（または不在）によって説明することができることを実証した。これらのデータは、疾患の生物学のより良い理解の両方の予後マーカーおよび治療標的の同定により、病状の臨床管理のための追加のヒントを提供することができることを実証した。 <....
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プロトコル
注：すべての組織サンプルはサンラッファエッレ病院（ミラノ、イタリア）の治験審査委員会の承認が得られた。
1ヒト組織サンプルおよび細胞精製（図1）
注：白血病リンパ球はマリガンらによると、CLL患者の末梢血（PB）から入手したと診断された9。
PBから1.1）白血病細胞分離
- ヘパリンナトリウムとバキュテナー採血管でPBを収集します。
- 15mlチューブに血液を移し、全血の50μL/ mLでヒトB細胞濃縮カクテルを追加します。よく混合し、室温で20分間インキュベートする。
- 、PBS + 2％FBSを等容量の試料を希釈してくださいインターフェイスを壊さないこと、フィコールの上に優しく、慎重にオーバーレイ血を混ぜる。希釈した試料15ミリリットルtの（ すなわち 4ミリリットルをFicoll + 10ミリリットルの血液を2部にフィコールの少なくとも1部を使用してくださいUBE）。
- ブレーキなしで20分間、室温（20℃）で400×gで遠心する。単核細胞を界面になります。
- 慎重に細胞を回収し、新しいチューブにするインターフェイスを吸引。 5分間、暗所で、300×gでPBSおよび遠心分離機で一回、4℃で細胞を洗浄する。ペレットを一番下に....
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結果
私たちは、一次白血病B細胞はCLL患者のPBを形成する単離され、私たちはプロテオームマップを分析した。サンプルた（n = 104）は、各患者の臨床的特徴に基づいて、2つの主要なサブセット（良好な予後対悪い予後）にグループ分けし、2DEゲルの比較分析を行った。
分析許容差次つのサブセット間で発現スポットの同定（翻訳後修飾の変化を暗示存在/不在又はゲル上のシフト期間中、であり、n≈16）。私たちは、MALDIプレート上にスポットした2DEゲルから選択されたスポットを切り出し、還元およびアルキル化された後、タンパク質が得られた上清中にトリプシンおよびペプチドを用いて消化した。スペクトルは、MALDI-TOFボイジャーDEで取得した。その結果、ピークリストはMASCOTと深遠に提出された。特定の質量許容内の質量は、考えられているタンパク質の中に、データベース内のペプチド配列に割り当てられ、その後、組み立てられているそれは一定の確率スコア（ 図3）合格した場合に識別。この分析により、私たちは、主に細胞骨格活性や代謝プロセス（未発表データ）に.......
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ディスカッション
本稿の目的は、このアプローチは他の疾患および/ または他のサンプルタイプ16-18に拡張することができる場合であっても、CLLの病因に関与する分子の同定のための最適化されたプロトコルを記述することである。悪い予後19 対 良好CLL患者の2サブセットのプロテオミクスプロファイルを比較することによって、私たちは、彼らがHS1のリン酸化状態が異なり、その活性化が白血病細胞の遊走および接着能力に影響を与えることを実証した。
他の方法に関しては、原稿、2DEゲル及びMSに提示プロテオミクス技術の主な利点は、それらが細胞プロテオームの完全な指紋を提供し、最も重要なことは、タンパク質の翻訳後修飾に関する情報を提供することである。差別的にリン酸化またはグリコシル化されたタンパク質は、ゲル中で自分の位置を変更し、おそらく細胞内でそれらの活性を変更する。
ove_content ">また、私たちは細胞骨格の機能をテストするために使用された細胞の遊走および接着性の評価のためのプロトコルを記載し、こ.......アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
私たちは、リンパ性悪性ユニット、エリサ10ハッケン、リディアScarfò、マッシモアレッシオ、アントニオ·コンティ、アンジェラテガミバチ、そしてアンジェラカッタネーオに感謝します。
Associazione ItalianaのあたりのラRicercaスルCancro AIRC（ - ミルフィーユの＃9965あたり5調査官助成や特別プログラム分子臨床腫瘍）：このプロジェクトは、によってサポートされていました
CSとBAは、研究を設計し実験を行ってデータを分析し、原稿を書いている。 MTSB、原稿を書くことを支援UR、FBPR。 PGおよびFCCは研究は、患者のサンプルや臨床データを提供して設計しました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アセトニトリル | メルク | 61830025001730 | |
| 重炭酸アンモニウム | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-ジチオエリスリトール | SIGMA | D9680-5G | |
| ヨードアセトアミド | SIGMA | I6125-25G | |
| 塩化カルシウム二水和物 | SIGMA | 223506-25G | |
| トリプシン、シーケンシンググレード | ロシュ | 11418475001 | |
| α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 | SIGMA | C2020-10G | |
| トリフルオロ酢酸 | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUEDUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS 1114547 | ||
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | ベックマン・コールター | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | ベックマン・コールター | 082A07789 | PC5 |
| エッタン IPGphor 3 等電点電点集電装置 | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| 尿素 | SIGMA | U6504 | |
| Tris-HCL バッファー | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | 線形pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| グリセロール | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL セル | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| アクリラミド | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| メタノール | SIGMA | 32213 | |
| 酢酸 | VWR | 631000 | |
| ホルマリン | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| エタノール | VWR | 9832500 | |
| チオ硫酸ナトリウム | FLUKA | 72049 | |
| 硝酸銀 | FLUKA | 85228 | |
| 分子動力学 パーソナル SI レーザー濃度計 | アマシャムBiosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| 炭酸ナトリウム | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer ソフトウェア (バージョン 3.2) | Applied Biosystems | ||
| トランズウェルシャンブル 直径 6.6 mm | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | L-グルタ |
| ミン ゲンタマイシン | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| 平底 96 ウェルプレート | ベクトン ディキンソン | 353072 | |
| BSA | サンタクルス | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| パラホルムアルデヒド | SIGMA | P6148 | |
| サポニン | SIGMA S-7900 | ||
| ファロイジン | ライフThechnology | A12379 | レクサフロー488 |
参考文献
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-....
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