方法論記事

キナーゼ阻害剤に対して耐性変異のスクリーニングおよび検証のための方法

DOI：

10.3791/51984

⸱

2014年12月7日

 ,  ,  , 
1Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cancer Blood Disease Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

キナーゼ阻害剤治療に対する遺伝的抵抗性の出現は、効果的な癌治療のための重要な課題を提起する。新たに開発された薬剤に対して耐性変異の同定および特徴は、より良い臨床管理、次世代薬剤設計に役立ちます。ここでは、in vitroスクリーニングおよび耐性変異の検証のために私たちのプロトコルを記述します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

慢性骨髄性白血病（CML）におけるドライバ癌遺伝子としてBCR / ABLの発見は、実際には、効果的にCML患者の治療によって癌におけるキナーゼを標的とする可能性を示し、イマチニブの開発をもたらした。この観察は、EGFR、B-RAF、KIT及びPDGFRs、のような様々な他の悪性腫瘍に関与する発癌性キナーゼを標的とする薬剤の開発に革命をもたらした。しかしながら、抗キナーゼ療法の一つの主要な欠点​​は、薬物に対する親和性を減少または消失しているターゲットをレンダリングする薬剤耐性突然変異の出現である。耐性変異体で採用のメカニズムを理解することは、次世代の阻害剤の開発に役立つだけでなく、パーソナライズされた薬を使用する臨床管理に弾みを与えていないだけ。我々は、次の世代BCR / ABL阻害剤の開発に役立っているBCR / ABLの抵抗付与突然変異のスペクトルを識別するためのレトロウイルスベクターベースのスクリーニング戦略を報告した。 Ruxoliの使い方薬剤標的ペアとしてtinibとJAK2は、ここでは、JAK2キナーゼのランダム変異のライブラリーを発現するマウスBAF3細胞を利用vitroスクリーニング方法で説明します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロテインキナーゼは、一見したところ、すべての細胞の機能を調節する細胞内シグナル伝達経路の重要な調節酵素である。キナーゼを介したシグナル伝達を適切に制御するには、主に、UPSによるキナーゼ、ホスファターゼ及びその分解の適切なレギュレーション（ユビキチンプロテアソーム系）に依存している恒常性と開発、非常に重要です。脱調節キナーゼは、多くの癌のセンターステージにあり、ヒト疾患1のホストに関与。ヒトゲノムは、〜400ヒト疾患2に、直接的または間接的にリンクされている500以上のタンパク質キナーゼをコードする。これらの観察は、小分子阻害剤3-5によるキナーゼの治療標的化のための概念を支 ​​持した。

慢性骨髄性白血病（CML）の治療におけるこのようなイマチニブのようなABLキナーゼ阻害剤、の実証は、このアプローチ6,7のための概念の証拠を提供した。この観察だけでなく、アリに革命をもたらしI-キナーゼ療法だけでな​​く、骨髄増殖性新生物（MPN）で真性多血症（PV）と患者からJAK2における発癌性変異の発見につながる治療標的化のための他の腫瘍性疾患、遺伝的病変を識別するためのアイデアを施行。この発見は、小分子キナーゼ阻害剤とJAK2を標的とすることによりMPNsの治療に大きな関心を生成した。今、JAK2阻害剤のほとんどダースは、臨床試験中であり、そのうちの一つは、骨髄線維症の治療のために最近承​​認された。癌における小分子阻害剤による発癌性キナーゼの特異的ターゲティングは有望な結果をもたらすが、それはまた、治療に対する耐性を発現苦しむ。実際には、これまでのところ、そのようなイマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびダサチニブのようなキナーゼ阻害剤で治療した患者は、大部分の薬物は、8-10をターゲットとするために、キナーゼドメインにおける変異を取得することにより、耐性変異を開発した。遺伝子突然変異の結果として抵抗がo制限を強調fは発癌性キナーゼに対する単剤療法を目標とし、これまで以上に成功した癌化学療法の開発の次の挑戦を表します。薬剤耐性の機構および機能的結果を選択し、薬剤開発のための無料の化合物の設計のための根拠を提供するべきである。 in vitroでの画面を使用して同定された変異は、患者に見られるものとの高度の相関を示している。したがって、臨床的再発を引き起こす可能性がある耐性パターンを識別するのに臨床的または前臨床開発を支援における所与の薬物標的のペアのための薬剤耐性を付与する変異をin vitroスクリーニング。これらの変異型を同定するだけでなく、薬物反応および再発について患者をモニタリングするのに役立つだけでなく、より強固な次世代阻害剤の設計のために必須である。たとえば、次の世代BCR / ABL阻害剤、ニロチニブとPonatinibの開発は、理由も大きいメックに可能作られたhanistic理解は、突然変異誘発、構造的、および機能的研究から得られた。

以前、我々はそのようなイマチニブ11,12、PD166326 12、及びAP24163 13と阻害剤に対する耐性を付与する変異のスペクトルを明らかにするために、BCR / ABLのランダム突然変異誘発を用いて私たちのスクリーニングの結果を報告している。結果は、臨床的な抵抗および疾患再発を付与する変異を同定し、だけでなく、薬剤耐性及びキナーゼ機能11,14を支配する原則のメカニズムの理解を提供するだけでなく。ここでは、このスクリーニング戦略のより広範な適用を可能にするために、薬物標的対としてRuxolitinibおよびJAK2を使用して、追加の方法論の詳細を提供する。

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プロトコル

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注：このプロトコルのすべての手順は、動物の倫理的な治療とケア研究所健康のガイドラインに従って行われ、承認されたIACUC動物使用プロトコルに従って行った。

1.細胞株メンテナンス

  1. RPMI-1640培地中で培養BAF3細胞を、10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン（100単位/ mlおよび100μg/ ml）およびWEHI細胞の使用済み培養培地を補充した。 10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中でHEK293T細胞を増殖させる（100単位/ mlおよび100μg/ ml）。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃で細胞を維持する。

2.プラスミドの構築

  1. マウスJAK2およびLRによるのpMSCV-puroを-GWにおけるその発癌アイソフォームJAK2-V617F標準の組換えクローニング手順を使用してクロナーゼのクローンを作成。
  2. ルシフェラーゼ発現ベクター（のpMSCV-リュック·チェリー-GW）の構築のために-VIで使用VOイメージング、プライマーを用いてPCRによりpLVX-はTet-ONベクターからのルシフェラーゼを増幅（LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCGとLUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC）が使用されているのpENTR-リュックを、生成するためのpENTR-SD-TOPO中にクローニングし、その後LRクロナーゼを使用して再結合を介したクローニングにより、レトロウイルスベクター、のpMSCV-チェリー-GW中のルシフェラーゼ遺伝子を転送する。

ランダム変異ライブラリの調製、突然変異をスクリーニングし、識別

3.1）ランダム突然変異誘発

  1. JAK2野生型および商業組換えクローニング技術を使用してのpMSCV-puroを-GWレトロウイルスベクターにV617F変異のクローンの全長。
  2. 変換するためにJAK2-V617FプラスミドDNAの1μgのを使用し、XL-1レッド、E.従って、それらは、複製中にランダム突然変異を導入する可能DNA修復機構における欠陥がある大腸菌細胞 、。より具体的には、50ミックス - 100ngのDNAを10（DNA 100 ng以上の形質転換効率を低下させる）0あらかじめ冷却ポリプロピレンチューブ中のコンピテントセルのμL、静かに5分毎に渦巻く、30分間氷上でインキュベートした。良いライブラリカバレッジの場合は、コンピテントセルの四から六の管を使用しています。
    注：DNAの100以上のngは、変換効率が低下する
  3. 45秒間のヒートショックを42℃の水浴中でチューブを浸漬し、2分間氷上でインキュベートする。次いで、SOC培地1ml（2.0％トリプトン、0.5％酵母エキス、0.05％のNaCl、10mMのMgCl 2を、10mMの硫酸マグネシウム、および0.4％D-グルコース）を追加。 90分間の225から250 rpmで振とうしながら、37℃でチューブをインキュベートします。
  4. 100μg/ mlのアンピシリンを含む4 10センチメートルLB寒天プレート上に各チューブからプレートの細胞。 37℃で24時間 - 16プレートをインキュベートします。
  5. 目に見えるコロニーに続いて、無菌のプレートスクレーパーでプレートをこすることによってそれらを収集。各プレートからのプール細胞および市販のプラスミド抽出キットを用いてプラスミドDNAを単離する。
    注：通常のコロニーが小さく、なるように18〜24時間を取る目に見えるこれらは成長の遅い細菌の菌株であるため。この段階では、そのようなSau3A1またはTaq1または配列決定などの頻繁なカッターで制限消化によりライブラリ内の変異の不均一性を評価する。

レトロウイルス上清および形質導入の3.2）生産

  1. トランスフェクションの1日、プレートを10％FCS、ペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含むDMEM 100 10cm皿上に4×10 6個のHEK 293T細胞の前。
  2. 次の日、培地を交換し、変異誘発のpMSCV-JAK2-V617Fライブラリで細胞をトランスフェクト。各10cmプレートの場合は、無血清DMEM培地を用いて、400μlの総体積にトランスフェ40μlのDNAを10μg（プラスミドライブラリー5μgのレトロウイルスパッケージングプラスミド5μgの、pCLEco）を混ぜる。室温で20分間、DNAおよび脂質ミックスをインキュベートする。 20分後HEK293T細胞の上に賢明なDNA-脂質複雑なドロップを追加します。
  3. 6時間後、トランスフェクション培地ワットを変更するi番目の新鮮な培地には、ウイルス産生のために、37℃で48時間プレートをインキュベートし。インキュベーションの48時間後に、0.45μmのアクロディスクフィルターを通して濾過し、ウイルス上清を集め。

インビトロでの耐性クローンの3.3）の選択

  1. 薬剤耐性JAK2-V617F変異体の場合は、0.5〜1×10 6のウイルス力価を持つウイルス上清100mlで億BaF3細胞に形質導入する。より具体的には、10％血清を含むRPMI培地を用いて300ミリリットルの全体積のウイルス上清を100ml、及びpolybereneの24μg/ mlの（ploybereneの最終濃度を8μg/ mlである）と10 8細胞を混合する。複数で6ウェルプレート（4-5 1mlあたりをよく）これらのセルミキサを配布します。
  2. 25℃で90分間1250×gでプレートを遠心。遠心分離後、24時間、37℃でプレートをインキュベートする。
  3. 次の日、一緒に細胞をプールし、Ruxolitinibと媒体が柔らかい寒天を含むと混合し、Si中のメッキxのウェルプレート。各薬物濃度について、50mlチューブ中Ruxolitinib適当量の形質導入されたBAF3細胞（10〜20万個の細胞）を10mlを混合する。 20％血清を含むRPMIを用いて40mlまでボリュームを構成する。 mixcarefullyとプレート6ウェルプレートで、細胞に1.2％寒天の10ミリリットルを追加します。
  4. 2週間、37℃でプレートをインキュベートする。 3-4日ごとに個別に24ウェルプレートで0.2ミリリットルのピペットチップを使用して、耐性コロニーとサブカルチャー、それらを選択します。
  5. 室温で5分間、450×gで遠心分離することによって耐性BAF3細胞を採取する。商業ゲノムDNA単離キットを用いてゲノムDNAを単離する。 PCRはプライマー（mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAGとmJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG）を使用して、100ngのゲノムDNAから完全長JAK2 cDNAを増幅し、長期テンプレートは、高忠実度PCRシステムを展開します。
  6. アガロースゲル電気泳動でPCR産物を分離する。 JAK2コーディングフレームを表すDNAバンドの3.4キロバイトを切除し、DNAを単離商業ゲル抽出キットを用いて。シーケンス8内部プライマー（P1 - P8）を使用して、cDNAの全長市販のソフトウェアを使用して、コード配列にまたがる、分析シーケンスを。

耐性変異のインビトロ検証4.

多くの細胞クローンは、耐性表現型の各突然変異の寄与を試験するテンプレートとしてのpMSCV-JAK2V-617Fのプラスミドを用いて部位特異的突然変異誘発によって選択された変異体を作製するために、二つ以上の突然変異を有する。

  1. 商業誘発キットおよび点突然変異を作成するために設計されたオリゴヌクレオチドを​​使用してのpMSCV-JAK2-V617Fプラスミド上の部位特異的突然変異誘発を行います。配列決定によって変異体クローンのアイデンティティを確認してください。
  2. レトロウイルスBAF3細胞を形質導入する変異体プラスミドを用いて作らを1μg/ mlのピ​​ューロマイシンを用いた選択を行った。
  3. プレート10 4 BAF3-JAK2-V617F細胞（10％FCSを含むRPMIの50μl）を96ウェルプレートの各ウェルに。独立した37℃で60時間プレートを（0、1、3、5、10、及び20μMの最終濃度）とインキュベートlyがプレート全体でウェルにruxolitinib含有培地50μlを添加する。
  4. よく2-4時間、37℃でのインキュベーションに続いてそれぞれにWST-1試薬を10μl添加することにより、細胞の生存率を評価する。プレートリーダーを用いてA450でのレコード吸光度。三連とプロット内のすべてのアッセイを行うINCB018424濃度に対して吸光度を平均した。非線形カーブフィッティングアルゴリズムを使用して、最高のフィットS字曲線を実行します。携帯IC50として50％の細胞生存率の結果として薬物濃度をスコア。
  5. 次に、ruxolitinibの濃度を増加させ、37℃で4-6時間インキュベートし、10％血清を含むRPMI培地中で6ウェルプレート中のJAK2変異体を発現するプレート600万BAF3細胞。
  6. 4℃で5分間450×gでの遠心分離によって細胞を収集します。 PBSで細胞を一度洗浄し、そして20mMのトリス-Cl（pH7.5）中で溶解、50のNaCl、1％NP-40、0.1％SDS、5mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのフッ化ナトリウム、2mMのナトリウムバナジウム、および5％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤を補充した。 5×ゲルローディング緩衝液（350mMのトリス-HCl [pH6.8の]、続いて1分間の細胞懸濁液を超音波処理し、500mMのDTT、15％SDS、10mMのベンザミジン、5mMのEDTA、5mMのEGTA、5mMのナトリウムバナジン、5〜10分間70℃でプロテアーゼカクテル、50％グリセロール、および0.001％ブロモフェノールブルー）および変性。
  7. 変性条件下で、8％SDSポリアクリルアミドゲル上のタンパク質を解決する。マウスモノクローナル抗phopsho STAT5を用いたイムノ実行します。ブロットをストリップし、ウサギポリクローナル抗SATA5抗体で再プローブした。供給業者の推奨に従って、ECL試薬を用いてバンドを可視化。

生体内の検証5.

  1. のpMSCVリュック·シェールから作られたレトロウイルスで形質導入（ルシフェラーゼと桜を表現するBaF3細胞を形質導入JAK2-V617Fと耐性変異体を発現するウイルスとRY GW）。 JAK2とその抵抗変異体の発現のためのピューロマイシン選択後に生存している細胞を選択します。
  2. 尾静脈注射により 6 Balb / CマウスにPBSを200μlのJAK2-V617Fとその耐性変異を運ぶ200万活発に成長BAF3リュック/桜の細胞を注入する。
  3. 細胞移植の3日後、二週間1日2回Ruxolitinibた（100mg / kg）をマウスに注射する。
  4. イメージング·システムとルシフェラーゼベースの生物発光イメージングを行います。 。
    1. 簡潔には、滅菌脱イオン水25ml、小さな体積およびストア内のアリコートには300mgを溶解することによりルシフェリン溶液を調製。
      注：-80℃で保存ルシフェリンと使用まで光から保護する。
    2. 各マウスで125 mg / kgをを達成するためにIPによって各マウスに250μlのを注入。一緒に密封されたボックス内の吸入イソフルラン（1.5％-2.0％）を使用して、同じ群のマウスを麻酔。目の上の獣医軟膏を適用します乾燥を防ぐために、電子の目。
      注：スリープ状態にしたマウスにかかる時間（10〜15分）ルシフェリン活動がピークに達することができました。変動を避けるために、グループ間の一貫性のある時間をおいてください。
  5. イメージング室ステージにすぐにマウスを移し、イメージング手順の間1.5から2パーセントのイソフルランで麻酔を維持。シーケンシャル0.1、0.5、1、5、30、60、300秒の露光で画像マウス。画像を撮影し、画像取得及び分析ソフトウェアを用いて生物発光強度を定量する。イメージングは​​、そのケージに戻ってマウスを返すの後。
  6. 、in vivoでのキメラ現象の収穫総bonemarrow細胞について。頸椎脱臼で追跡5分間CO 2でマウスを安楽死させる。骨髄を収集するために4ミリリットルの冷PBSで骨やクラッシュを収穫する。蛍光顕微鏡下でのパーセント桜陽性細胞を分析し、FACSを用いて定量化する。各サンプルから2万イベントを収集。

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結果

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遺伝子変異の出現は、目標と抗キナーゼ療法のための大きな課題を提起する。突然変異研究は、選択次世代薬物開発の設計に尽力している機構的及び機能的洞察を提供することに加えて、より良い臨床管理を可能にし、将来的にパーソナライズされた治療のために、より有用であろう。この実験では、JAK2-V617Fキナーゼでruxolitinib耐性変異（ 図1）のスクリーニングを示した。私たちは、のpMSCV-チェリー-GWへの完全長マウスJAK2-V617FcDNAを導入することによってのpMSCV-JAK2-V617F-cherry.gatewayベクターを構築。これは、配列の偏りに関連する限界に起因するPCRである方法の最も一般的な選択、の間、ランダム突然変異を、開発するために、細菌宿主（ 大腸菌のXL-1赤株）を使用することを推奨し、大きな遺伝子断片を増幅することが困難であるている。ランダム突然変異誘発DNAライブラリーは、レトロウイルス産生のために、HEK293T細胞にトランスフェクトした。これらの変異体VIR用途は、1または5 RuxolitinibのμMのいずれかでIL-3の非存在下で軟寒天中で...

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ディスカッション

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臨床的再発と標的遺伝子中の薬剤耐性突然変異の出現：CMLの治療におけるイマチニブの臨床的成功は、小分子阻害剤による頬紅キナーゼを標的とする可能性が、標的療法のも明らかに限定するものではないだけを示した。耐性変異の同定は、より良い臨床管理及び次世代阻害剤の開発に役立つ。このプロトコルは、標的遺伝子に薬剤耐性変異を同定するための方法論を説明しています。この方法は、Eに内蔵され、ランダムに突然変異を誘発プラスミドライブラリーを使用しています大腸菌は 、変異体タンパク質を発現する。ライブラリはその後BAF3細胞（癌遺伝子による形質転換を受けやすい）で導入され、化学療法剤の存在下での細胞クローンの選択を行った。耐性クローンからの標的遺伝子の配列決定は、耐性を付与する突然変異を識別します。最後に、同定された変異は、のためにそれらを検証するために部位特異的突然変異誘発により再作成されます薬剤耐性。

我々はそれぞれ、Ruxolitinibおよびイマチニブに対する耐性を付与するJAK2およびBCR / ABL変異のスペクトルを定義し、この戦略を使用して。私たちは、...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利益相反は宣言されていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、NCI (1RO1CA155091)、NHLBI (1R21HL114074)、および白血病研究財団からのM.A.への助成金によって支援されました。著者は、編集してくれたサラ・ローラボー博士に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞・組織培養 
BaF3細胞ATCC
HEK293T細胞ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GWロス・レバイン
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C。GW自社
pMSCV-JAK2-V617F / L983F。GW自社
pMSCV-JAK2-V617F / P58A。GW自社
pMSCV-V617F-Cherry.GW自社
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW自社
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW自社
pMSCV-Luciferase-puro.GW自社製
RPMICellgro (corning)15-040-CV
DMEMCellgro (corning)15-013-CV
Penn/StrepCellgro (corning)30-002-CI
FBS Atlanta biologicalS11150
Trypsin EDTA 1XCellgro (corning)25-052-CI
1x PBSCellgro (corning)21-040-CV
L-GlutamineCellgro (corning)25-005-CL
ピューロマイシンGibco (ライフテクノロジーズ)A11138-03
硫酸プロタミンSigmaP33695 mg/ml 水溶液
トリパンブルー溶液 (0.4%)SigmaT8154
DMSOCellgro (コーニング)25-950-CQC
INCB018424 (ルキソリチニブ)ChemieTeK941678-49-5
WST-1Roche11644807001
0.45 ミクロン ディスク フィルターPALL2016-10
70 ミクロン ナイロン セル ストレーナーBecton Dickinson352350
細菌培養
XL-1 赤E. coli細胞Agilent Tech200129
SOCNew England BiolabsB90920s
アンピシリンシグマA0166100 mg/ml原液 
バクト寒天Difco214050
素晴らしいスープベクトン ディキンソン243820
アガロースGenemateE-3119-500
キット
Dneasy 血液&組織キットQiagen69506
ロングテンプレート PCR システムロシュ1168134001
ウィザードSvゲルおよびPCRクリーンアップシステムプロメガA9282
ピュアイールドプラスミドミニ調製システムプロメガA1222
pDONR 221 &OmniMAX 2 コンピテントセルInvitrogen12535029
ゲートウェイ LRクロナーゼ酵素ミックス Invitrogen11791019
Mouse reagents
Vivo-Glo Luciferin in-vivo GradePromegaP1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2Becton Dickinson329461
Mortor pestleCoor tek 60316 および 60317
イソフローラン (Isothesia TM)Butler Schien29405
Instruments
NAPCO シリーズ 8000 WJ CO2 インキュベーターThermo scientific
スイングバケットローター遠心分離機 5810REppendorf
TC-10 自動セルカウンターBio-RADこれは必要ではなく、細胞計数に標準的な血球計算装置を使用することができます
からの贈り物製製製製製製

参考文献

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in vitro JAK2 V617F BAF3 IC50

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