Method Article

キナーゼ阻害剤に対して耐性変異のスクリーニングおよび検証のための方法

DOI:

10.3791/51984

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December 7th, 2014

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1Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cancer Blood Disease Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In This Article

Summary

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キナーゼ阻害剤治療に対する遺伝的抵抗性の出現は、効果的な癌治療のための重要な課題を提起する。新たに開発された薬剤に対して耐性変異の同定および特徴は、より良い臨床管理、次世代薬剤設計に役立ちます。ここでは、in vitroスクリーニングおよび耐性変異の検証のために私たちのプロトコルを記述します。

Abstract

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慢性骨髄性白血病（CML）におけるドライバ癌遺伝子としてBCR / ABLの発見は、実際には、効果的にCML患者の治療によって癌におけるキナーゼを標的とする可能性を示し、イマチニブの開発をもたらした。この観察は、EGFR、B-RAF、KIT及びPDGFRs、のような様々な他の悪性腫瘍に関与する発癌性キナーゼを標的とする薬剤の開発に革命をもたらした。しかしながら、抗キナーゼ療法の一つの主要な欠点​​は、薬物に対する親和性を減少または消失しているターゲットをレンダリングする薬剤耐性突然変異の出現である。耐性変異体で採用のメカニズムを理解することは、次世代の阻害剤の開発に役立つだけでなく、パーソナライズされた薬を使用する臨床管理に弾みを与えていないだけ。我々は、次の世代BCR / ABL阻害剤の開発に役立っているBCR / ABLの抵抗付与突然変異のスペクトルを識別するためのレトロウイルスベクターベースのスクリーニング戦略を報告した。 Ruxoliの使い方薬剤標的ペアとしてtinibとJAK2は、ここでは、JAK2キナーゼのランダム変異のライブラリーを発現するマウスBAF3細胞を利用vitroスクリーニング方法で説明します。

Introduction

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プロテインキナーゼは、一見したところ、すべての細胞の機能を調節する細胞内シグナル伝達経路の重要な調節酵素である。キナーゼを介したシグナル伝達を適切に制御するには、主に、UPSによるキナーゼ、ホスファターゼ及びその分解の適切なレギュレーション（ユビキチンプロテアソーム系）に依存している恒常性と開発、非常に重要です。脱調節キナーゼは、多くの癌のセンターステージにあり、ヒト疾患1のホストに関与。ヒトゲノムは、〜400ヒト疾患2に、直接的または間接的にリンクされている500以上のタンパク質キナーゼをコードする。これらの観察は、小分子阻害剤3-5によるキナーゼの治療標的化のための概念を支 ​​持した。

慢性骨髄性白血病（CML）の治療におけるこのようなイマチニブのようなABLキナーゼ阻害剤、の実証は、このアプローチ6,7のための概念の証拠を提供した。この観察だけでなく、アリに革命をもたらしI-キナーゼ療法だけでな​​く、骨髄増殖性新生物（MPN）で真性多血症（PV）と患者からJAK2における発癌性変異の発見につながる治療標的化のための他の腫瘍性疾患、遺伝的病変を識別するためのアイデアを施行。この発見は、小分子キナーゼ阻害剤とJAK2を標的とすることによりMPNsの治療に大きな関心を生成した。今、JAK2阻害剤のほとんどダースは、臨床試験中であり、そのうちの一つは、骨髄線維症の治療のために最近承​​認....

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Protocol

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注：このプロトコルのすべての手順は、動物の倫理的な治療とケア研究所健康のガイドラインに従って行われ、承認されたIACUC動物使用プロトコルに従って行った。

1.細胞株メンテナンス

  1. RPMI-1640培地中で培養BAF3細胞を、10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン（100単位/ mlおよび100μg/ ml）およびWEHI細胞の使用済み培養培地を補充した。 10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中でHEK293T細胞を増殖させる（100単位/ mlおよび100μg/ ml）。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃で細胞を維持する。

2.プラスミドの構築

  1. マウスJAK2およびLRによるのpMSCV-puroを-GWにおけるその発癌アイソフォームJAK2-V617F標準の組換えクローニング手順を使用してクロナーゼのクローンを作成。
  2. ルシフェラーゼ発現ベクター（のpMSCV-リュック·チェリー-GW）の構築のために-VIで使用VOイメージング、プライマーを用いてPCRによりpLVX-はTet-ONベクターからのルシフェラーゼを増幅（LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCGとLUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC）が使用されているのpEN....

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Results

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遺伝子変異の出現は、目標と抗キナーゼ療法のための大きな課題を提起する。突然変異研究は、選択次世代薬物開発の設計に尽力している機構的及び機能的洞察を提供することに加えて、より良い臨床管理を可能にし、将来的にパーソナライズされた治療のために、より有用であろう。この実験では、JAK2-V617Fキナーゼでruxolitinib耐性変異（ 図1）のスクリーニングを示した。私たちは、のpMSCV-チェリー-GWへの完全長マウスJAK2-V617FcDNAを導入することによってのpMSCV-JAK2-V617F-cherry.gatewayベクターを構築。これは、配列の偏りに関連する限界に起因するPCRである方法の最も一般的な選択、の間、ランダム突然変異を、開発するために、細菌宿主（ 大腸菌のXL-1赤株）を使用することを推奨し、大きな遺伝子断片を増幅することが困難であるている。ランダム突然変異誘発DNAライブラリーは、レトロウイルス産生のために、HEK293T細胞にトランスフェクトした。これらの変異体VIR用途は、1または5 RuxolitinibのμMのいずれかでIL-3の非存在下で軟寒天中で.......

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Discussion

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臨床的再発と標的遺伝子中の薬剤耐性突然変異の出現：CMLの治療におけるイマチニブの臨床的成功は、小分子阻害剤による頬紅キナーゼを標的とする可能性が、標的療法のも明らかに限定するものではないだけを示した。耐性変異の同定は、より良い臨床管理及び次世代阻害剤の開発に役立つ。このプロトコルは、標的遺伝子に薬剤耐性変異を同定するための方法論を説明しています。この方法は、Eに内蔵され、ランダムに突然変異を誘発プラスミドライブラリーを使用しています大腸菌は 、変異体タンパク質を発現する。ライブラリはその後BAF3細胞（癌遺伝子による形質転換を受けやすい）で導入され、化学療法剤の存在下での細胞クローンの選択を行った。耐性クローンからの標的遺伝子の配列決定は、耐性を付与する突然変異を識別します。最後に、同定された変異は、のためにそれらを検証するために部位特異的突然変異誘発により再作成されます薬剤耐性。

我々はそれぞれ、Ruxolitinibおよびイマチニブに対する耐性を付与するJAK2およびBCR / ABL変異のスペクトルを定義し、この戦略を使用して。私たちは、.......

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Disclosures

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利益相反は宣言されていません。

Acknowledgements

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この研究は、NCI (1RO1CA155091)、NHLBI (1R21HL114074)、および白血病研究財団からのM.A.への助成金によって支援されました。著者は、編集してくれたサラ・ローラボー博士に感謝しています。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
細胞・組織培養 
BaF3細胞ATCC
HEK293T細胞ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GWロス・レバイン
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C。GW自社
pMSCV-JAK2-V617F / L983F。GW自社
pMSCV-JAK2-V617F / P58A。GW自社
pMSCV-V617F-Cherry.GW自社
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW自社
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW自社
pMSCV-Luciferase-puro.GW自社製
RPMICellgro (corning)15-040-CV
DMEMCellgro (corning)15-013-CV
Penn/StrepCellgro (corning)30-002-CI
FBS Atlanta biologicalS11150
Trypsin EDTA 1XCellgro (corning)25-052-CI
1x PBSCellgro (corning)21-040-CV
L-GlutamineCellgro (corning)25-005-CL
ピューロマイシンGibco (ライフテクノロジーズ)A11138-03
硫酸プロタミンSigmaP33695 mg/ml 水溶液
トリパンブルー溶液 (0.4%)SigmaT8154
DMSOCellgro (コーニング)25-950-CQC
INCB018424 (ルキソリチニブ)ChemieTeK941678-49-5
WST-1Roche11644807001
0.45 ミクロン ディスク フィルターPALL2016-10
70 ミクロン ナイロン セル ストレーナーBecton Dickinson352350
細菌培養
XL-1 赤E. coli細胞Agilent Tech200129
SOCNew England BiolabsB90920s
アンピシリンシグマA0166100 mg/ml原液 
バクト寒天Difco214050
素晴らしいスープベクトン ディキンソン243820
アガロースGenemateE-3119-500
キット
Dneasy 血液&組織キットQiagen69506
ロングテンプレート PCR システムロシュ1168134001
ウィザードSvゲルおよびPCRクリーンアップシステムプロメガA9282
ピュアイールドプラスミドミニ調製システムプロメガA1222
pDONR 221 &OmniMAX 2 コンピテントセルInvitrogen12535029
ゲートウェイ LRクロナーゼ酵素ミックス Invitrogen11791019
Mouse reagents
Vivo-Glo Luciferin in-vivo GradePromegaP1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2Becton Dickinson329461
Mortor pestleCoor tek 60316 および 60317
イソフローラン (Isothesia TM)Butler Schien29405
Instruments
NAPCO シリーズ 8000 WJ CO2 インキュベーターThermo scientific
スイングバケットローター遠心分離機 5810REppendorf
TC-10 自動セルカウンターBio-RADこれは必要ではなく、細胞計数に標準的な血球計算装置を使用することができます
からの贈り物製製製製製製

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109, 275-282 (2002).
  2. Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).
  3. Cohen, P.

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Drug Resistance MutationsKinase Inhibitor ScreeningRandom Mutation LibraryIn Vitro ScreeningSite Directed MutagenesisJAK2 V617FRuxolitinib ResistanceBAF3 CellsRetroviral VectorIC50 Validation

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