ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

サマリー

細胞培養モデルは、環境条件を詳細に制御を提供し、したがって、神経細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なプラットフォームを提供します。私たちは、隔離解離、およびニワトリ胚の培養感覚ニューロンために、迅速な安価で、かつ信頼性の高い方法を記載する。基質の調製および免疫細胞化学の詳細も提供される。

要約

ニューロンは、感覚、運動、移動、学習、およびメモリを含むさまざまな機能のために重要な情報を運ぶ多面細胞である。 生体内で神経細胞を研究することは、それらの複雑さ、彼らの多様かつ動的な環境、そして技術的な限界に挑戦することができます。これらの理由により、in vitroでニューロンを研究することは神経細胞の複雑な謎を解明することが有益で証明することができます。細胞培養モデルの明確に定義された性質は、環境条件および変数を詳細に制御を提供する。ここでは、隔離解離、およびニワトリ胚由来の培養一次ニューロンする方法について説明します。この技術は、迅速で安価であり、ロバスト感覚ニューロンを成長生成する。手順は、一貫して非常に神経細胞について濃縮された培養物を生成し、非常に少数の非神経細胞（5％未満）を有している。一次ニューロンは、したがって詳細な手順二つディスタンを作成するために、未処理のガラスまたは組織培養プラスチックによく接着しないCT、ニューロンのメッキ用の、明確に定義されたラミニン含有基質が記載されている。培養したニューロンは、共免疫沈降、生細胞想像、RNAiを、および免疫細胞化学を含む複数の細胞および分子技術、に非常に適している。これらの培養神経細胞をダブル免疫細胞化学のための手順は、最適化されており、ここに記載されている。

概要

ニューロンは、感覚、視覚、運動運動、学習、およびメモリを含む、さまざまな機能に不可欠な情報を伝達する複雑な細胞である。他の細胞型からのユニークな、ニューロンは、通信のための不可欠な神経の高速道路を形成するために、軸索と呼ばれる、アーム状のプロセスを拡張します。成長円錐と呼ばれる成長の軸索の先端に位置して開発専門のコンパートメント、中、その適切な宛先に軸索をリードして、細胞外手がかりのコンサートをナビゲート。成長円錐ナビゲーションの根底にある複雑な分子メカニズムは完全には理解されていない。より良いこれらのメカニズムを理解するために、研究者らは、in vitro環境で定義され、簡略化のニューロンを研究するための細胞培養モデルを使用している。神経分化^2、細胞骨格のダイナミクス、エンドサイトーシスおよび人身売買、デンドライト：文化¹に留学ニューロンは、ニューロンを含む細胞生物学の理解において大きな進歩をもたらしたレギュレーション^3,4、軸索再生^5、そのような神経障害⁶などの臨床症状。加えて、培養神経細胞は、成長円錐の運動性のタイムラプス分析などの免疫細胞化学、細胞表面共免疫沈降、ウエスタンブロット、トランスフェクション、RNAiは、ライブイメージングを含む、研究技術の広い範囲に非常に適している。このように、一次ニューロンを培養したニューロンの細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なアプローチ....

プロトコル

1。カバースリップの準備：アシッドウォッシュと焼く

1. 解剖（ステップ2）の前に少なくとも2日間、カバーガラスを準備するには、次の手順を開始します。オイル、徹底的にきれいなカバースリップを除去するための酸洗浄ステップを実行します。
2. 縦にカバースリップを配置して互いに接触するのを防ぐ磁器ホルダーに用紙をカバースリップ。 2 M塩酸（HCl）を充填したガラス組織学容器にホルダとカバースリップを沈める。磁器ホルダーが使用できない場合あるいは、広がっ〜20カバーガラスを水平方向に100mmのガラス製ペトリ皿の底をカバーし、2 M HCl中でカバースリップを水没する。
3. ドラフト内でロッカー·テーブル上の（酸中に沈めカバースリップで）ガラス容器を置き、室温で少なくとも5時間、穏やかに振動を可能にする。あるいは、酸洗浄は、同じ条件下で一晩カバースリップ。
4. 洗浄は、ロードされた磁器ホルダーを転送することにより、蒸留H ₂ O（のdH ₂ O）を用いてカバースリップのdH ₂ Oで満たされた清浄なガラス組織学コンテナに2MのHClからのカバーガラスと代わりに、カバーガラスとガラスペトリ皿から2MのHClをデカントとDH ₂ Oで補充
5. 再びのdH ₂ Oをデカントし、新鮮なのdH ₂ Oでガラス容器を再充填することによって洗浄する3迅速....

結果

ここで説明するプロトコルは、文化に非常に少ない（ 例えば 、<5％）非神経細胞^7,8,10,16と解離胚性感覚ニューロンの濃縮集団を研究者を可能にします。多数のDRGを腰仙部、胸部および頸部から得ることができる。治験責任医師の必要に応じて、これらの異なる解剖学的領域からのDRGを容易に単離することができる。たとえば、 図1は、図1Cおよび1Dおよび図1Eおよび1Fでの胸部のDRGで強調表示腰椎DRGを持つ解剖のさまざまな段階を経てニワトリ胚の画像を示す。

培養細胞を簡単に免疫細胞化学によって標識されている。ここでは、培養した細胞は、β1インテグリンおよびNCAM（ 図2）に対する抗体で免疫染色されている。驚くべきことに、私たちはこれらの後に最長1年間の蛍光染色を視覚化することができましたICC手順、スライドを4℃、暗所で水平に保持した場合。しかし、ICCの汚れの寿命は、.......

ディスカッション

ここでは、単離するための詳細なプロトコールを提示し、培養ニワトリ胚からの感覚ニューロンを解離さ。この手順では、in vitro ^7,8,10,16 におけるロバスト成長ニューロンの濃縮集団を生成します。多数の細胞および分子技術がここに記述されている免疫細胞を含む、これらの培養ニューロンに適用することができる。このプロトコルは、最近、定量的感覚成長円錐^8,16で免疫標識し、活性化インテグリンの強度を評価した。これらの以前の研究では、ソフトウェアプログラムを正確に成長円錐の遠位端20ミクロンのアウトラインを作成するために使用された。概要はNCAM染色に基づいて行った。神経細胞におけるNCAMの遍在的な発現は、全成長円錐ではなく、成長円錐の限られた部分を識別するためのソフトウェアプログラムを使用可能。この成長円錐の輪郭がそのレジ内の関心領域及びインテグリン染色強度として同定された関心のあるソフトウェアによって評価した。このようにして、目的のタンパク質の強度を容易に培養感覚ニューロン内の特定の領域で測定することができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
滅菌小型培養皿(35 mm)	コーニング	430165
滅菌大型培養皿(100 mm)	ファルコン	353003
滅菌大型シャーレ(100 mm)	VWR	89000-302
ガラスシャーレ(100 mm)	VWR	D108962
ファインサイエンス	ツール	11251-10
標準的な鉗子	ファインサイエンスツール	1100-12
スリップ(22 x 22 mm)	フィ	ッシャー12 518 105K	0.13-0.17 mmの厚さは顕微鏡検査に最適です
磁器カバースリップホルダー	トーマス科学	8542E40
シ血清	Gibco	17502-048	の500ミリリットルあたり50ミリリットルのアリコートを使用します
			2 Mで使用し、
NaCl	Sigma	S9888	ラミニン-1ストック溶液に5 M NaCl溶液を使用します
Laminin-1	Invitrogen	23017-015	72 & micro;滅菌5 M NaClのlと50 µへのアリコート;l
15 ml コニカルチューブ	セル治療	229411
PBS CMF 10x	Gibco	14200	1x で使用し、滅菌ミリポアろ過水で希釈
PBS 10x	Gibco	14080	を 1x で使用し、滅菌ミリポアろ過水で希釈
Ham's F12	Lonza	12-615F
ウシ胎児血清アルブミン (BSA)	Gibco	10438	10%
HEPES	シグマ	H3375	、蒸留水で滅菌1M溶液を作成し、F12培地で希釈して10 mM
ペニシリン/ストレプトミオシン		GF031	の500 mlで5 mlを使用する
			滅菌ミリポア水1mlを加え、滅菌条件下で分注し、-20°Cで保存します。C、F12H培地の最終濃度10ng / mlで使用し、-20°Cに保ちます。C非霜取り冷凍庫
NGF	RnDシステム	256-GF	1x PBSを0.1%BSAで1ml追加し、滅菌条件下で分注し、-20°Cで保存します。C、最終濃度10 ng/mlでF12H培地
L-グルタミン	シグマ	G7513	アリコートを無菌条件下で使用し、-20°Cで保存。C、無菌条件下でF12H培地
トリプシン	シグマ	T4049	、-20°Cで保存します。C
ウシ血清アルブミン (BSA)	Gibco	15260
その他の必要なアイテム: ガラスパスツールピペット、肥沃な白いレッグホーン鶏の卵、チェックエッグインキュベーター(加湿、37°C;C)、細胞インキュベーションチャンバー(加湿、37°C;C)、層流フード、両眼立体視解剖スコープ
免疫細胞化学試薬 Table
スクロー		Sigma S9378	固定液に使用 (4% パラホルムアルデヒエ、30% スクロース、2x PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
パラホルムアルデヒド	ΣP6148		固定液に使用 (4% パラホルムアルデヒエ、30%)スクロース、2x PBS)
フルオロマウントG	サザンバイオテック	0100-01
正常なヤギ血清	ライフテクノロジー	PCN500
顕微鏡スライド	VWR	16004-430
Primary 抗体 テーブル
>NCAM	ミリポア	AB5032	ポリクローナル
抗体に対する抗体アクティブ化 & ベータ;1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
二次抗体 Table
ヤギ抗マウスIgG Alexa 488	Life technologies	A11001
ヤギ抗ウサギ IgG Alexa 548	Life technologies	A11036

カバー胎児ウハムのF12メディアHCl VWR VW3204-1を廃棄する前に2回使用できます を でF12HS20使用しの最終濃度を得る ΣP0781 F12培地NT3ミリポア滅菌アリコートの最終濃度200mMで使用しス