肺特異的血管形成を研究するためにマウスの肺にフィブリンゲルの移植

サマリー

>jove_content<局所的な血管新生を刺激する臓器特異的微小環境の再現は、損傷した組織の正常な再生に不可欠です。本報告は、成体マウスにおいて、肺特異的微小環境が血管新生と肺胞再生をどのように調節するかを探るために、生きたマウスの肺表面にフィブリンゲルを移植する新しい方法を示すものである。

要約

幹細胞研究と生物工学技術の最近の重要な進歩は、再生し、整形外科や歯周分野のシンプルな組織における損傷を修復するために生体材料を利用することで大きな進歩を遂げている。臓器再生の生物学的プロセスはよく検討されていないので、肺などのより複雑な三次元（3D）の構造と機能を再生しようとする臓器は非常に成功していない。これは、血管新生は、新しい血管の形成は、臓器再生において重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。新たに形成された血管系は、酸素、栄養素や臓器再生のために必要とされる様々な細胞成分を提供するだけでなく、再生地元の組織に有益な信号を提供するだけでなく。首尾成人肺を再生成するため、それは血管新生が局所肺組織の再生を駆動する肺特異的微小環境を再現することが必要である。共同もののnventional インビボでのそのようなヒドロゲル（ 例えば 、フィブリンまたはコラーゲンゲルまたはマトリゲル-エンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫細胞によって分泌ECMタンパク質の混合物）がリッチ細胞外マトリックス（ECM）の皮下移植などの血管新生アッセイ、広く探求するために利用される肺における生体材料の同所移植のための方法は十分に確立されていないため、血管新生の一般的なメカニズムは、肺特異的血管新生は、十分に特徴付けられていない。このプロトコルの目的は、ゲル内部ホスト肺由来の血管新生の成功要約を可能に、生きている成体マウスの肺の表面にフィブリンゲルを注入するユニークな方法を導入することである。このアプローチは、肺特異的微小環境が正常および病的両方の条件で血管新生および肺胞の再生を制御するメカニズムを探求する研究者を可能にします。注入された生体材料のリリース以来隣接lの物理的および化学的な信号を供給し、長官組織、罹患肺におけるこれらの生体材料の注入は、潜在的に肺疾患の様々なタイプの新しい治療アプローチを開発するための研究を可能にする、隣接した病変組織を正常化することができる。

概要

このプロトコルの全体的な目標は、研究者は肺血管および肺発達の分子機構を特徴づけることができ、成体マウスの肺表面にフィブリンゲルを注入する方法を導入すること、及び可能な生体模倣材料を開発するためにこの知識を活用することである様々な肺疾患を治療するための生理的な肺の血管および肺胞形成を反復するの。

35以上の万人のアメリカ人が慢性閉塞性肺疾患および肺線維症を含む慢性肺疾患に苦しむ。これらの患者は大幅に日常生活^1-3を損なうような息切れ、胸部圧迫感、しつこい咳、および疲労などの長期的な慢性呼吸器症状を持っている。これらの肺疾患のための効果的な治療法を開発する努力が多量にもかかわらず、現在、治療法は存在しない。そのため、これらの患者の生活の質が悪いと経済で、人的コストがhiであるGH ^4-7。現在、肺移植は、末期慢性肺疾患を有する患者を保存する唯一の方法である。しかし、移植ドナー、高コスト、深刻な合併症、および低い生存率^8-11の不足のため、移植が最適なアプローチではありません。組織工学技術の最近の急速な進歩は、前駆細胞または人工多能性幹（iPS）細胞^12,13の様々なタイプの脱細胞化肺全体を再増殖することにより、移植可能な肺をbioengineerする研究者を可能にした。しかし、これらの生体工学肺が唯一の注入^12,14,15後に数時間の宿主動物において機能的である。肺の複雑な構造および機能を再生するために生体材料を利用しても、かなり成功していない。成人の肺の再生を支配する主要な生物学的プロセスが十分に検討されていないためと考えられる。肺では、血管系の形成が早いと最も重要なイベントの一つ対応時間は限らですNGの開発と再生^16-21。肺で新たに形成された血管系は、酸素、栄養素や器官形成に必要な各種の細胞成分を提供するだけでなく、細胞の^22〜25の周囲に有益な調節シグナルを提供するだけでなく。このように、血管新生は、成人肺^24,26,27回生肺胞形成において重要な役割を果たしている。また、調節解除された血管新生は、慢性閉塞性肺疾患^{（COPD）28、}気管支肺異形成^{（BPD）、21-23、}および肺線維症²⁹のような慢性の肺疾患に寄与する。したがって、肺のエンジニアリングまたは慢性肺疾患を治療するためのより効率的な戦略を開発するためには、肺特異的血管形成の基本的メカニズムを理解する必要がある。

各器官は生理学的および病理学的条件^30〜33の間で異なる場合がありますユニークな機械的および化学的特性を、表示されます。これらの器官特異microenvironメンツは、内皮細胞の挙動を調節し、器官特異的に^24,34-36に血管網の形成を調整する。したがって、肺の再生のためのより効率的な戦略を開発するために、肺特異的血管形成の基礎となるメカニズムは、理解される必要がある。皮下ヒドロゲル移植のような従来のin vivoでの血管形成アッセイは、血管形成の研究^37-39ために広く使用されてきたが、これらの方法は、器官特異的血管形成を再現しない。最近、マウス肺弾性モールドにマトリゲルを移植するための新規な方法が開発され、成功したゲル²²中に血管および肺上皮細胞を動員することが示されている。このユニークなアプローチは、研究者は肺特異的血管形成の機構、ならびに生理的および病的状態における血管および非血管肺細胞間の相互作用を探索することを可能にする。 1）マトリゲルは臨床応用には適していないので。 2）Eゲルをキャストするために使用ラスチック金型は、ヒドロゲルおよびホスト肺組織との間の相互作用に影響を与える可能性があり、3）肺弾性モールドは、潜在的に、より臨床的に関連するアプローチ、血管新生因子を含む3次元フィブリンマトリックスとして、呼吸中に肺機能および疼痛障害を引き起こす（血管内皮増殖因子（VEGF）/塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF））、弾性モールドに鋳造することなく、マウス肺に移植された、成功したホスト肺由来の血管新生を要約されている。フィブリンゲル、トロンビン切断されたフィブリノゲンから生成されたポリマー原線維は、トラップする生体 ^40,41 で血管新生を促進させるようなbFGFおよびVEGFなどの血管新生因子の様々な知られている。 、その再生能力及び生分解性の性質^42、フィブリンゲルが広く組織工学の分野で用いられている。

この記事では、生きているADULの肺の表面にフィブリンゲルを注入する新規かつユニークなアプローチを紹介しますトンマウスとホスト肺由来の血管新生は、in vivoでのゲルの内部に要約されていることを示している。肺特異的血管形成を研究するための研究を可能にし、この方法は、可能性肺疾患の様々なタイプの新しい治療アプローチの開発につながると有意に正常成体肺を再生する取り組みを進めます。

プロトコル

注：in vivoでの動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨事項に厳密に従って実施した。プロトコルを見直し、ボストン小児病院の動物実験委員会によって承認された（プロトコル番号：13-10-2526R、14-02-2568R）。このプロトコルで使用されるすべての薬物は、医薬品グレードであり、これらの薬物は、無菌条件下で調製される。

1.フィブリンゲルの準備

1. VEGFおよびbFGFが含まれているフィブリンゲルを準備します。
   1. 室温（25℃）に-80℃で保存されたフィブリノーゲンおよびトロンビ​​ンのストック溶液を解凍する。
   2. フィブリノゲンへのCaCl _2（最終濃度：45ミリモル）、VEGF（終濃度：0〜100 ng / ml）をおよびbFGF（0-100 / mlの最終濃度）のトロンビン（2.5 U / mlの最終濃度）を添加する溶液（最終濃度：0.9％sodiu 12.5 mg / mlの1.5mlチューブにおけるm食塩^43-45）。
   3. ピペッティングにより穏やかに混合します。
   4. 穏やかにp200とのピペットチップを用いて滴下様式で滅菌プラスチックシャーレ上に混合物200μlをピペット。
   5. 彼らが固化するまで、30〜60分間、37℃で滴をインキュベートする。
      注：固化ゲル注入（ 図1a）の前に数時間、室温（25℃）で密封されたプラスチックディッシュに保つことができる。
2. 移植前に小さな外科用ハサミを用いて約3×3×3 mmの立方体にフィブリンゲルをトリミング。

2.マウスの準備

1. 腹腔内ケタミンの（IP）注射（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kgの）によって成体マウス（8-12週）を麻酔し、マウスが十分にマウスのつま先をつまんで麻酔をかけていることを確認します。
   1. 実験中に乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を使用してください。
2. シェーブFUマウスの胸郭の左側の上R。
3. マウスの気管内挿管を行います。
4. 70°の角度をなす挿管スタンドにマウスを置き、スタンドの上部にある小さなゴムバンドの上に、その上部切歯をフックによって所定の位置にマウスを保持する。
5. 静かに鈍鉗子を用いて片側に舌を撤回。
6. 光ファイバグースネック顕微鏡照明装置を用いて喉頭を視覚化。
7. 気管内に気管内弾性カテーテル（21 G）を挿入します。
8. マウスが自然発生的に（通常の100〜150呼吸/分、ない逆説的または浅い呼吸）がスムーズな方法で呼吸していることを確認してください。
9. 解剖顕微鏡下で発生しやすい位置にマウスを置きます。
10. 機械的にげっ歯類人工呼吸器（150呼吸/分、7ミリリットル/ kgの一回換気量）を使用して、マウスを換気する。
11. 4 ^番目と5 ^番目の肋骨の間の肋間スペースを見つけるために肋骨を数える。
12. エリアBの上に無菌のフィールドを作成します。yは徹底的にアルコールやポビドンヨードで拭く。無菌の外科用ドレープで適切に手術野をカバーしています。

3.マウスの手術

1. 皮膚の0.25％ブピバカイン（200μl）を局所注射した後、解剖ハサミを使用して、肋間空間にわたって横断皮膚切開（約1cm長）を作る。
2. 肋間筋に0.25％ブピバカイン（200μL）を注入した後、細かい小さなハサミを使用して4 ^番目と5 ^番目の肋骨の間の筋肉の切開を作る。
3. 完全に左肺を可視化するために、リブの間の解剖リトラクターを挿入します。
   1. 細かい鉗子を使用して、左肺の中央の臓側胸膜の小さな領域（1×1mm角）をこすり。
   2. 出血や空気の漏れが完全に制御されるまで滅菌綿棒を使用して領域に穏やかな圧力を適用します。
   3. フィブリノゲン/トロンビン（フィブリン糊）の新鮮な混合物（ステップ1.1.2。20＆＃少量を入れて181、p200とピペットチップを使用して領域にわたってリットル）。
4. 優しくエリア（ 図1b）の上に小さな鉗子を用いて1フィブリンゲル（ステップ1.2）を配置。
   1. ゲルが十分に肺の呼吸運動中にエリア上に固定されていることを確認します。
5. どちらも大規模な空気漏れや肺からの出血があることを確認してください。
6. 削除する必要はありません吸収性縫合糸、との緊密な切開（筋肉と皮膚層）。
7. 気胸を防ぐために27 G針および1mlシリンジを使用して胸腔を吸引する。
8. 機械的な換気を終了します。

4.マウスの回復

1. マウスが自然発生的にスムーズな方法（定期的な100〜150呼吸/分、ない逆説的または浅い呼吸）で呼吸していることを確認してください。
2. IP脱水を防ぐために、予め温めておいた0.9％のNaClを1ml注入する。
3. マウスは、循環温水パッド上で回復できるようにする。
4. endotracheを削除マウスが安定した呼吸を持っていることを確認した後、他のチューブ。
5. 術後の鎮痛剤として3日間、メロキシカム（5 mg / kgを皮下注射（SC）を注入する。
6. それは（その胃の上にロールバックすることが可能と直立のまま）胸骨で、意識的になるまで丁寧に15分間隔の最小のマウスの動きを監視します。
7. 回復後、手術をせずにマウスから単離された新しいケージにマウスを返す。
8. 毎日、以下の感染の兆候（発赤、腫脹、放電）、動物の基本的な生物学的機能（食品や水の摂取、排尿、排便、体重増加）だけでなく、臨床徴候苦痛のための手術部位（立毛、縮小運動）を監視外科的手技。

5.収穫肺

1. 7〜30日間、移植後、圧縮ガスの供給源を介してCO _2を使用して、マウスを安楽死させる。
2. 剣状突起の先端と胸骨の間に切開を作るノッチ（胸骨正中切開）と気管を切断し、心臓、肺、気管へのすべての接続を解剖することにより組織学的および生化学分析のために注入されたゲルと収穫肺全体。
3. 、、4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒド溶液で肺に移植されたゲルを固定OCT化合物に埋め込み、厚さ30μmの連続段部を取る。
4. 共焦点顕微鏡^22,37,40を使用して（アクアポリン（AQP）5と界面活性タンパク質（SP）-B：CD31、上皮マーカー内皮マーカー）組織学的（ヘマトキシリン及びエオシン染色）および免疫組織化学的分析を実行します。
5. 3D画像解析ソフトウェア^37を使用して、肺の内皮および上皮細胞の三次元画像を形成する光学切片（厚さ30μm）のスタックをコンパイルする。
6. 画像解析ソフトウェア^46を使用して、新しく形成された血管の投影面積を定量化する。

結果

ホスト肺由来の血管形成は、肺に移植生体材料の中に要約されているかどうかを調べるために、主要な血管新生因子のVEGFおよびbFGF（0、10および100ng / mlの各）を補充したフィブリンゲルのように生きたマウスの肺の表面に移植したマトリゲル^22を用いて報告した。 図1aに示すように、これらの血管新生増殖因子を含むフィブリンゲル^47を作製した。開胸後、左肺表面の小さな領域は、鉗子を用いて掻き取り、そして製造されたフィブリンゲルは、FDAが承認され、広く停止させる効果的なシール材として使用されるフ​​ィブリン接着剤の少量を用いて、成体マウスの肺に移植した空気漏れや肺手術^48,49（ 図1b）の出血減らす。ほとんどのマウスは、重篤な呼吸器症状（ 例えば 、気胸、呼吸困難）することなく回復した。七日、移植後、マウスを安楽死させ、肺をハーヴあったSTED。注入されたフィブリンゲルは、7日間注入（ 図1c）の後に、宿主の肺に取り込まれた。共焦点蛍光画像の3D再構...

ディスカッション

この記事では、成体マウスの生体の肺表面上の生体材料を注入するための新しい方法を紹介します。このシステムでは、ホスト肺由来の血管新生は、正常に材料内部に要約されている。このシステムは、研究者は内皮細胞、他の細胞（ 例えば 、上皮細胞、間葉系細胞、免疫細胞）とローカル血管新生^50〜53と肺胞の再生^24,54のために必要とされる様々なECM成分の間のクロストークを探索することができます。従来のin vivoでの皮下ヒドロゲル移植は、血管新生の研究^37-39に広く使用されてきたが、これらの方法は、器官特異的血管形成を再現しない。ヒドロゲルは、肺表面に直接移植されるこのシステムは、成体マウスの肺における血管形成および肺再生における肺特異的微小環境の役割を探求する研究者を可能にする。これらのゲルは、様々なECMに富むbiomateから製造することができるリアル種々の化学的因子（ 例えば 、血管新生因子、成長因子^）55,56、前駆細胞および/ ​​またはiPS細胞を補充することができる（ 例えば

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヒト胎盤由来フィブリノーゲン	Sigma	F4883
ウシ血漿由来フィブリンゲルの作製 トロンビン	ΣT9549		フィブリンゲルの作製
組換えマウス VEGF 164	R&D	493-MV	フィブリンゲル
コンビナントマウスbFGF	R&D	3139-FB	フィブリンゲルへの補給用
げっ歯類挿管スタンド	Braintree Scientific INC	RIS 100	挿管用
光ファイバー光源	Fisher Scientific	12-565-35	挿管用
21 G 弾性カテーテル	B.Braun	4251652-02	挿管用
MiniVent 人工呼吸器	ハーバード装置	CGS-8009	換気
ステミ DV4 胸像顕微鏡	フィッシャーサイエンティフィック	12-070-515	手術用
アブソバブル縫合	エチコン	PDP304	CD31に対する外科用縫合
糸	BD バイオサイエンス	553370
AQP5	アブカム	AB78486
SP-B	に対する免疫組織化学抗体アブカム	AB40876	免疫組織化学

リ糸 に対する免疫組織化学抗体