正常および疾患米国でフィブリンクロット構造を調べるための実験とイメージング技術

サマリー

>jove_content<この原稿では、血液調製、共焦点顕微鏡法、溶解速度分析などの実験的手法が紹介されており、病気の状態による正常な血餅構造と異常な血餅構造の形態学的な違いを調べます。

要約

Fibrinは、血栓の構造的完全性を維持する役割を担う細胞外マトリックスタンパク質です。フィブリンについては、過去数年間に多くの研究が行われており、これには、血栓の合成、構造機能、および溶解の研究が含まれます。しかし、疾患患者から生じる血栓の形態学的および構造的特徴については、まだ多くのことがわかっていません。本研究では、糖尿病や鎌状赤血球貧血などの疾患状態による異常な血餅構造の形態学的差異を調べるための実験的手法を紹介します。私たちの研究は、さまざまな実験的アッセイと共焦点顕微鏡法を使用して形態学的違いを評価するためのフィブリン血栓の調製と評価に焦点を当てています。さらに、フィブリン血栓の溶解速度を連続的にリアルタイムで計算できる方法も記載されています。本明細書に記載の技術は、糖尿病または鎌状赤血球症の患者における心筋梗塞、虚血性心疾患、および脳卒中などの併存する血栓性病状を解明しようとする研究者および臨床医にとって重要である。

概要

血管の内皮内層に損傷は止血応答、または血栓の形成を通じて修復される。血液は、細胞外マトリックスに浸透すると、組織因子は、凝固カスケードの開始を容易に血流中の血小板を活性化する。この治癒過程の重要な機械的な構成要素は、高弾性であるフィブリン繊維からなるフィブリンマトリックスであり、かつ大きな力^1-4を維持することができる。多くの研究が盛んに過去数十^5-13フィブリンの形成構造、および機能を研究している。

例えば、糖尿病および鎌状赤血球のような疾患を有する患者は、心筋梗塞、虚血性心疾患、および脳卒中^14-19として血栓性合併症を発症するリスクを有する。 200万人以上の人が新たに米国で毎年糖尿病と診断されている。タイプI：糖尿病には2つの種類があります本体は、体がインスリン抵抗性となり、インスリン、およびタイプII、十分な量を生産することができない。糖尿病患者では、心血管疾患（CVD）は、疾患^20,21に関連する罹患率および死亡率の80％の原因である。

鎌状赤血球症（SCD）は、米国²²で10万人以上の人々に影響を与える遺伝的血液疾患です。 SCDは難しい細胞が血管系²³を通過できるようにすること、三日月形になるように、赤血球を引き起こす点突然変異疾患である。これらの疾患状態の両方は、体内のア​​テローム血栓性の状態を発症する可能性を高める。この理由の一つは、疾患状態^14,24-26における変化したフィブリン構造と機能の結果である。

糖尿病や鎌状赤血球症の両方において、アテローム血栓症および心血管疾患（Cを誘導し、凝固亢進とhypofibrinolysis活動がありますVD）健康な患者^17,27,28と比較した。これはhypofibrinolysisは、アテローム性動脈硬化症の進行を促進し、早期冠動脈疾患を有する患者について²⁹再発虚血イベントを拘禁することが知られている。現在の原稿では、この特定の設定で、フィブリンの物理的特性の役割を調べた。非疾患患者におけるフィブリン血餅の構造は、薄い繊維、より大きな孔、及び一般に低密度の^14,24で構成されている。健康な患者における気孔率の増加及び低密度のフィブリン塊は、線溶^16を容易にすることが見出されている。糖尿病及び鎌状赤血球症などhyperthrombotic条件で、健康な患者^30-33に2.5 mg / mlの正常レベルから増加するフィブリノーゲン濃度を引き起こすフィブリノゲン産生の増加がある。健康な、非直径と比較して、糖尿病患者に形成されたフィブリン塊は、以上の分岐点を有する、より高密度、より剛性の、多孔性の低いことが見出されているbetic患者^{14,24,33-35。}改変されたフィブリン構造が血栓形成に関与するタンパク質中に存在する糖化メカニズムの結果である。グルコース分子が適切に架橋グルタミンおよびリジン残基^33,36,37からのヒト第XIIIa因子（活性化XIII因子）を阻害フィブリノゲン分子、上のリジン残基に結合したときに非酵素（不可逆）糖化が起こる。

フィブリンネットワークの構造解析は、最近広く研究されている。特に、研究者は、電子顕微鏡および血管（内皮）細胞および血管外（線維芽細胞および平滑筋）双方の細胞がフィブリン構造^40を分析するフィブリン構造³⁹を利用粘弾性スペクトル解析にどのように影響するかを調べたフィブリンネットワーク³⁸の3D再構成などを利用している実験を使用してフィブリン構造と機械的特性との間の相関を開発し、計算は^、41に^近づく 。現在の研究の焦点は、シミュレートされた糖尿病及び鎌状赤血球症条件下血餅構造を定式化し、疾患状態における血塊の構造および機能の検査のために、共焦点顕微鏡を使用することであった。フィブリン塊は、ヒトフィブリノーゲン、ヒトトロンビン、および活性化XIII因子から形成された。血栓は、プラスミンを用いて溶解した。糖尿病状態をシミュレートするために、フィブリノゲン濃度の増加は、 インビトロでのフィブリノーゲン糖化を誘発するためにグルコース溶液中でインキュベートした。鎌状赤血球症凝固条件をシミュレートするために、増加したフィブリノゲン濃度は、我々のグループ⁴²によって、以前に行われたように患者から採取した鎌状赤血球ヘマトクリットと混合した。これらの方法は、構造および機能病的条件下でのフィブリン塊の形成及びフィブリン溶解に関与するだけでなく、CVDを誘導するメカニズムを調べた。これらの疾患についての現在の情報に基づいて、糖化されたフィブリン塊構造は、少数のAでより高密度であったND小さな孔。鎌状赤血球患者からの赤血球（RBC）とフィブリン塊はまた、より高密度でありRBCおよび凝集フィブリンクラスターの凝集を示した。これは、以前に⁴³決定された十分に確立された現象である。また、線維素溶解率が健全な、正常なフィブリンと比較して減少しプラスミンとない糖化フィブリン塊に有意に低いであろうと仮説を立てた。結果は、糖化フィブリン塊のために、著しく異なる溶解速度の結果だけ減少プラスミン濃度の条件下で観察されたことを示した。細胞およびタンパク質が凝固活性のリアルタイムビデオのキャプチャを可能にするそれらの天然の状態で残っているため、共焦点顕微鏡を使用して、この実験的手法は、他の撮像方法を超える有意な利点を提供する。合成的に誘導凝固のこの方法は、患者のサンプルを取得し、個々のフィルタリングより効率的で安価でより多くの時間であるタンパク質および酵素。サンプル間のばらつきは、プラズマ中の他のタンパク質の結果として存在しなかったように、また、血栓を合成するために分離されたタンパク質および酵素を使用することにより、血栓を標準化した。

プロトコル

注：以下のプロトコルは、ジョージア工科大学の治験審査委員会（IRB）によって設定されたガイドラインに準拠しています。

1.採血およ​​び赤血球単離法

1. 10ミリリットルのヘパリン化バキュテナーチューブ中にドナーからの血液の40〜120ミリリットルを収集します。コレクションの4時間以内にPBMC（末梢血単核細胞）の分離を開始します。この時間中、RTで血液を保つ。
   注：これは下PBMCの収量になりますようにRTまたは4℃における血液のO / Nストレージが推奨されていません 。
2. 氷冷（4℃）を滅菌PBSで1：全血の1希釈する。
3. ピペット空、無菌の50mlの円錐チューブに氷のように冷たい親水性多糖類の10ミリリットル。静かに親水性多糖類の上に希釈した全血を移す。
4. 非常にゆっくりとチューブの側面に沿ってゆっくり設定やピペット血液中の25ミリリットルピペットを使用してください。血液が前にセントリに糖類と混合されていないことを確認してくださいfugation親水性多糖類は、細胞に対して毒性とそうでない場合であるため、PBMCの収率が低くなります。
5. 4℃で400×gで30分間遠心血液サンプル。可能な場合は、遠心分離後の良好な分離のための最大値の半分に遠心分離機のブレーキ速度を低下させる。
6. 遠心分離した血液サンプルの血漿/血小板分画から吸引する。慎重に直接パックRBC層の上に親水性の多糖類の層を吸引除去する。
7. パックされたRBCの8〜10ミリリットルを収集し、1希釈する：非無菌の0.9％NaCl生理食塩水で1を。

2.共焦点顕微鏡評価糖化の血塊構造（模擬糖尿病血塊）

1. 37℃でのヒトフィブリノーゲンおよび蛍光標識されたヒトフィブリノゲン結合体を解凍。
2. マイクロ遠心チューブを卒業した0.5ミリリットルに次のようにピペット。
   1. 健康、通常のフィブリノゲンの塊については、10％の蛍光標識したヒトフィブリノーゲンヒトフィブリノゲンをミックス5 mg / mlの濃度で50mMのトリス/ 100mMのNaCl緩衝液中のコンジュゲート。
   2. 人工的に糖化フィブリノゲンは、（糖尿病血栓をシミュレートするため）6.8 mg / mlでの得られた濃度50mMのトリス/ 100mMのNaClに溶解したグルコースの5 mM溶液中のヒトフィブリノーゲンおよび10％の蛍光標識されたフィブリノゲン結合体をインキュベートする。
3. 光への曝露を避けるために、不透明材料を用いたマイクロ遠心管を覆う。 48時間、37℃の水浴中でチューブをインキュベートする。
4. スライドの2側面に薄い接着剤を貼り付けてガラス顕微鏡スライド上室を作る。
5. 48時間のインキュベーション期間の後、RTで活性化XIII因子およびヒトαトロンビンを解凍することによってフィブリン形成のための試薬を調製する。
6. 5のCaCl ₂のバッファに80 U / mlに活性化XIII因子を希釈します。
7. 5のCaCl ₂のバッファに4 U / mlにトロンビンを希釈します。
   1. 通常の血栓のために、フィブリノゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度は2.5メートルであることを確認G / mlで、20 U / mlで、それぞれ50μlの容量で1単位/ ml、。
   2. 糖化血栓のために、フィブリノゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度がそれぞれ50μlの容量で、3.4 mg / mlの、20 U / mlとし、1単位/ mlであることを確認してください。
8. すぐに接着剤によって形成されたチャンバー内にフィブリン溶液を30μlのピペット。
9. 接着剤の2層の上に0.15ミリメートルの厚さの22ミリメートル×22 mmのガラスカバースリップを置きます。乾燥からフィブリン塊を防止するための明確な接着剤で開放側をシール。接着剤はフィブリン塊と相互作用しないことを確認してください。
10. フィブリン塊は、共焦点イメージングの前に2時間21〜23℃で重合することができるようにします。
11. 488nmのアルゴンレーザーを40X / 1.30オイルM27レンズを共焦点顕微鏡を用いて血栓の共焦点顕微鏡画像を取る。

鎌状赤血球患者からRBCを含むフィブリン塊の3共焦点顕微鏡評価

1. 37℃でのヒトフィブリノーゲンおよび蛍光標識されたヒトフィブリノゲン結合体を解凍。
2. マイクロ遠心チューブを卒業した0.5ミリリットルに次のようにピペット。
   1. 健康な、正常なフィブリン塊のために、5mg / mlの濃度で50mMのトリス/ 100mMのNaCl緩衝液中の10％の蛍光標識されたヒトフィブリノーゲン複合体とヒトフィブリノゲンを混ぜる。
   2. SCD RBCを含む塊、ヒトフィブリノーゲン及び50mMトリス/ 100mMのNaClフィブリノーゲンの得られる濃度が10 mg / mlであるような、10％、蛍光標識されたヒトフィブリノゲン結合体を混合する。
3. 細胞標識溶液を使用して（通常のとRBC分離プロトコルから取得した鎌状赤血球患者からのもの両方）を単離したRBCにラベルを付けます。
   1. 任意の選択された無血清培地1ml当たり1×10 ⁶の密度で細胞を懸濁。
   2. 細胞標識溶液に細胞懸濁液の5μL/ mlのを追加します。優しく穏やかにピペッティングでよく混ぜる。
   4. 37℃で5分間1500 rpmで標識されたサスペンションチューブを遠心する。
   5. 上清を除去し、静かに37℃の培地中の細胞を再懸濁。
   6. 洗浄手順（3.3.4および3.3.5）をさらに2回繰り返します。
4. 5のCaCl ₂のバッファに80 U / mlに活性化XIII因子を希釈します。
5. 5のCaCl ₂のバッファに4 U / mlにトロンビンを希釈します。
   1. 通常の血栓のために、フィブリノゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度がそれぞれ50μlの容量で、2.5 mg / mlの、20 U / mlとし、1単位/ mlであることを確認してください。
   2. SCD RBCを含む塊については、フィブリノーゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度は、50μlの容量でそれぞれ5 mg / mlの、20 U / mlであり、1 U / mlであること。確実
6. フィブリン溶液へのラベルRBCのピペットを10μl。ピペット顕微鏡ガラス上のRBCとフィブリンの30μL（GLのための準備をスライドを参照してくださいycated血栓）。
7. フィブリンは、共焦点イメージングの前に2時間21〜23℃で重合することができるようにします。
8. 共焦点顕微鏡を使用して血餅の共焦点画像を撮影し、蛍光標識したフィブリンおよび赤血球を励起して488nmと633nmの波長の励起レーザを利用する。

糖化クロット構造における線維素溶解料金の4共焦点顕微鏡評価

1. 糖化血栓における線維素溶解率評価のための糖化血栓（プロトコルステップ2）の共焦点顕微鏡プロトコルを繰り返します。
2. 明確な接着剤を用いて、チャンバの両端をシールしないでください。フィブリン塊は、脱水を防ぐために、250mlの水を含む密閉筐体に21〜23℃で1.5時間重合することができるようにします。
3. 重合後、共焦点顕微鏡を用いて血栓の画像を得る。
4. チャンバーの開放端にピペットプラスミンおよび毛管作用を介して、血餅を介してプラスミンを分散させる。
   1. のために通常の濃度は、ピペット室の​​開口部にプラスミン200μgの/ mlの25μlを、正常と糖化線維素溶解実験。
   2. 減少した濃度、ピペット室の​​開口部には50μg/ mlで25μlの糖化血栓のために。
5. 時系列機能を使用する血餅を溶解するプラスミンのリアルタイムのビデオ映像をキャプチャするために、共焦点顕微鏡ソフトウェア（ 図1参照）。
   1. 取得モードをクリックし、選択して "時系列"をサイクル数と記録時間間隔を選択します。

5.フィブリン溶解料金の計算

1. 面積（2500ミクロン^2）を設定し、血餅の固定領域を溶解するのに必要な経過時間を計算することにより、溶解速度を決定する。以下の式（ 図2）を使用して、溶解率を計算する。
   

フィブリン溶解料金の6.統計解析

1. 統計分析ソフトウェアを使用して溶解データを分析する。一方向ANOVAおよび事後テューキー·クレーマー検定^44,45を実行します。

結果

糖化フィブリンクロット構造の共焦点顕微鏡分析

正常および糖化血栓の共焦点顕微鏡画像を図3に示されている。通常の糖化血栓の共焦点顕微鏡分析は、糖化血餅とし、血餅重合中の活性化XIII因子を添加せずに両方の正常な凝血塊よりも小さい孔を有するより緻密であることが明らかである。 図3Aおよび3Bに、より高いフィブリン濃度（ 図3C及び3D）と糖化血栓未満の緻密な構造を作成低いフィブリン濃度が存在する。

糖化血餅で観察大きな密度（単位面積当たりの繊維の数）は、糖尿病患者で起こる増加フィブリノゲン濃度の結果である。正常な凝血に、フィブリン繊維がより線形であったと活性化XIII因子で重合時に長い繊維を形成しているそう繊維間の架橋を形成する活性化XIII因子の結果である。糖化血餅の場合、繊維はさらに活性化XIII因子を添加して、短いように思われた。これはおそらく起因フィブリノー...

ディスカッション

疾患状態における凝固機構の構造についての意味のあるデータを得るためには、これらの条件下でのタンパク質および細胞の効果を決定するために、凝固に関与する因子を単離することが重要である。このプロトコルは、in vitroで 、糖尿病およびSCDの状態でフィブリン塊の構造を調査する目的で開発された。

改変された条件は、凝固亢進、アテローム血栓症、およびCVDを引き起こすので、それは、疾患状態におけるフィブリン形成およびフィブリン溶解に関与するメカニズムを理解する必要がある。この実験で得られた共焦点画像から、亢進活性が増加したフィブリノーゲン濃度を引き起こし、糖尿病およびSCDの状態で起こることが明らかである。ネットワーク全体でより多くの分岐点と小さい細孔を有する密度の高いフィブリンネットワークにおける増加フィブリノーゲン濃度の結果。 SCD患者フィブリンネットワークでは、より多くのフィブリン存在府があるだけでなくそれがクラスタにフィブリンを閉じ込めるようにT鎌状赤血球患者から赤血球の集約性質もネットワークの構造を変更します。鎌状赤血球患者の赤血球の塊は、ネットワーク内のフ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (親水性多糖類)	GE Healthcare	45-001-749
10 ml ヘパリン化真空チューブ	BD Biosciences	366643
Human Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 ヒトフィブリノーゲン結合	分子プローブ	F13191
0.5 ml 目盛り付きマイクロ遠心チューブ	フィッシャー サイエンティフィック	05-408-120
グルコース粉末	ライフ テクノロジー	ズ 15023-02
FXIIIa	酵素研究所	N/A
VIS 共焦点顕微鏡	ツァイス LSM 510	LSM 510
50 mM トリス	ロンザ	S50-642
塩化カルシウム (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD 細胞標識溶液	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
塩化ナトリウム (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
統計モデリングソフトウェア	IBM	SPSS Statistics 22