「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

サマリー

小胞や細胞小器官などの貨物の細胞内輸送は、分極した微小管を追跡する分子モータータンパク質によって行われます。このプロトコルは、ニューロン内を移動する個々の貨物粒子の輸送の方向性と、関連するモータータンパク質の相対的な量とタイプとの相関関係を説明しています。

要約

分子モーターは、ニューロン内の小胞の貨物を輸送するために彼らの活動を調整するメカニズムを理解することは、単一の小胞レベルでのモータ/貨物協会の定量分析を必要とします。このプロトコルの目的は、組成物及び貨物に関連付けられているモータの相対量は、ライブ貨物の移動（「マップ」）の位置と方向を相関させるために、定量的蛍光顕微鏡を使用することである。 「カーゴマッピングは「ライブのライブ運動の記録中に化学固定に続いてマイクロ流体デバイス上で培養した軸索に移動、蛍光標識された貨物のイメージング、およびモータに対する抗体を用いた、まったく同じ軸索の領域のその後の免疫蛍光（IF）染色で構成されています。貨物およびそれらに関連するモータ間の共局在は、サブピクセル位置を割り当てることによって評価される回折李にガウス関数をフィッティングすることにより、モータ及び荷役チャンネル座標個々の蛍光点光源を表すmited点広がり関数。固定された貨物とモータの画像は、その後、彼らの追跡軌跡にそれらを「マップ」するために、荷動きのプロットに重畳される。データは、生細胞内の小胞貨物の輸送の両方を記録するために、これらのまったく同じ小胞に関連したモータを決定する場合は、このプロトコルの強さは、ライブの組み合わせですと。この技術は、これらの方法は、単一の移動貨物上の組成物を明らかにしないように、精製された不均質バルクベシクル集団の平均運動の組成を決定するために、生化学的方法を使用して、前の課題を克服する。さらに、このプロトコルは、それらのタンパク質組成を有する個々の細胞内構造の動きを相関させるために他の細胞型で他の輸送及び/又はトラフィッキング経路の分析に適合させることができる。このプロトコルの制限事項は、培養の低いトランスフェクション効率に起因する比較的低いスループットである一次ニューロンおよび高分解能イメージングのために使用可能な制限された視野。将来のアプリケーションには、蛍光標識された貨物を発現するニューロンの数を増加させる方法を含むことができる。

概要

細胞内輸送は、種々の細胞ドメイン¹へのタンパク質、膜、細胞小器官、およびシグナル伝達分子を送達するための全ての細胞型において非常に重要です。ニューロンは、批判的にさまざまな軸索マイクロドメインへの長距離配信のために不可欠な貨物の細胞内輸送に依存して長く、偏予測と高度に特殊化した細胞である。二つの大きな分子モータータンパク質のファミリ - - この輸送はキネシンとダイニンによって媒介される貨物に結合すると、それぞれ、順行と逆行方向に偏光した微小管に沿って追跡する。逆行移動は主にダイニンによって媒介されるが、順行方向の移動は、キネシンモーターの大きい、機能的に多様なファミリーによって促進される。その結果、軸索貨物の順行性輸送は、キネシンスーパーファミリー^1-5の様々な家族によって媒介される可能性があります。一部の貨物は、どちらの方向にも持続的にメートルを移動しますがOST貨物は双方向に移動し、その最終的な目的地^1,5-13に向かう途中で頻繁に逆転。さらに、示されている、貨物同時に指向性会合に対向する貨物の移動が規制反対の極性モータ^5-7によって調整されるかという疑問を上げるモーター。一緒に、軸索貨物の輸送はモーターと順番に様々なアダプタおよび規制上の結合パートナー¹⁴に依存している彼らの特異的な生化学的な活動、の組成によって調節されている協調プロセスです。

忠実に特定の貨物軸索輸送のメカニズムを説明するために、その輸送の基礎となる規則を発見するためには、ライブの輸送中に、個々の貨物に関連付けられたモータータンパク質とその調節結合パートナーの組成を決定するために最も重要である。他の方法は、例えば生化学的アプローチのために、平均のmotの推定値を提供するまたは精製された異種のベシクル集団上の組成が、これらの推定値は、単一の移動小胞に関連するモータの種類や金額を明らかにしない。また、in vitroで 、予め組み立てられた微小管に沿った小胞輸送の再構成は、単一の小胞のレベル¹⁵で、モータの一種の量を測定可能にした。しかし、これらの実験は、直接これらの小胞の輸送特性のモータの量を相関し、細胞調節因子の非存在下での輸送を測定しなかった。

内因的に測定する（IF）データはモータータンパク質を発現した免疫蛍光からの個別の移動小胞の運動組成物（タイプとモーターの相対的な量）を決定し、ニューロンにおける正確に同じ小胞のライブトランスポートにこれらのパラメータを関連付けるここに提示されているプロトコル^16。この方法は、IF存続荷物移動データの正確なマッピングを必要とする。これはgrowinことによって達成される確立されたプロトコルの^17-19を以下のマイクロ流体デバイスにおけるG海馬マウスのニューロン。これらのデバイスは、固定とライブ光学顕微鏡モダリティにおける軸索および単一可動貨物の識別と相関関係 （「マッピング」）（ 図1）を可能にします。培養されたニューロンは、その輸送kymographsにプロットされている詳細な移動情報を取得するために、高い空間分解能及び時間分解能で画像化された蛍光標識された貨物のタンパク質をトランスフェクトする。画像化の過程で、神経細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、その後、内因性のモータータンパク質に対する抗体で染色した。固定された貨物とモータの画像は動きが¹⁶軌道ライブ貨物にそれらを「地図」（共局在）するライブ移動kymographsに重畳されている。モータータンパク質との会合を持つ貨物のライブの動きを相関させるために、共局在は、「Moを呼ばれるカスタムメイドのMATLABソフトウェアパッケージを用いて分析されているTOR共局在^」16,20。蛍光標識された貨物とモーターが部分的に重複することができ、回折限界点状の特徴を生成する。涙点の重複の位置を解決するために、ソフトウェアが最初に自動的にそれらの正確なXYサブピクセル位置座標を決定するために、個々の蛍光涙点を表し、それぞれの点広がり関数をガウス関数に適合し、強度が^21-23振幅。モータや貨物の位置である続いて共局在^16,20を決定するために、互いに比較した。したがって、この方法は、より正確に、他の方法²⁴に比べて、蛍光涙点間の共局在を割り当てる。

この方法の強みは、ライブの移動軌跡（例えば、それらは定着時に移動された方向）のrecされているために、固定された細胞内の個々の貨物とモータの共局在化を評価する能力であるorded。この方法では、キネシンおよびダイニンは、（のPrP ^Cの -cellular）双方向に移動させ、あるいは軸索¹⁶で静止したままでneuronally富化貨物を正常なプリオンタンパク質を運ぶ小胞に同時に関連付けることが見出された。この分析は、貨物に関連しながら、順行（キネシン）と逆行（ダイニン）モータがどちらの方向に小胞を移動するか、静止したままにするために彼らの活動を調整するPrP ^Cから小^胞の動きの調節をワーキングモデルの定式化を可能にした。この方法の別の強さは、目的の任意の他のタンパク質（単数または複数）と、実質的に任意の細胞型の中で移動する多数の蛍光標識された貨物の共局在化/会合を特徴付けるためのその潜在広い適用である。多くの個々の蛍光を移動する粒子が所望のページを介して分析することができる標識したがって、生/固定された相関関係は、潜在的に、一過性のタンパク質 - カーゴ相互作用の検出を可能にすることができ時間のeriod。幅広い適用性と、このメソッドが対処できる質問の種類を考えると、このプロトコルは、ニューロンまたは他の細胞型のもの勉強人身売買および輸送を含む細胞生物学者の幅広い視聴者を対象としています。

プロトコル

全ての実験は、承認されたプロトコールに従い、研究動物の人道的なケアのための施設のガイドラインに従って行った。新生児マウスは断頭により安楽死させた。

細胞培養のためのマイクロ流体デバイスの作製

1. ハリスと同僚^17-19によって記載されているように海馬ニューロンの成長のためにポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体デバイスを準備します。下の貨物マッピングプロトコルに適応させたいくつかの変更があります。
   注：マイクロ流体デバイスはまた、（材料リスト）は市販されている、製造設備への、したがってアクセスは不要である。
2. それらを100％エタノールで3回洗浄し、水で3回洗浄し、アセトンで3回洗浄することによって番号1.5カバーガラス（24×40 mm）を準備する。使用するまで4℃の水に保管してカバースリップ。これらの治療はカバースリップはCELのメッキを妨害する可能性のある破片からクリーンであることを確実に助けるlsは、汚染、および生存。
   注：アセトン、エタノールを吸入、経口摂取のため、可燃性や眼への接触（刺激性）の皮膚接触（刺激物）の場合には危険である。公式規則に従って廃棄してください。
3. 場合には、使用のマイクロ流体デバイスあたり60ミリメートル細胞培養皿一つのカバーガラスを配置し、それを空気乾燥は、汚染を避けるために生物学的安全キャビネット内で45分間覆わせて準備ができて。
4. デバイスがマスターとパンチから切り出された後、殺菌のために45分間のUVランプを装備した安全キャビネット内部のマイクロ流体チャネル側アップでそれらを置いて、貯水池（ 図1A、B）を作成するためにカットされている。
   注：2時間よりも長い間UV処理中のデバイスを残すことはPDMSの完全性に影響を与える可能性がある。
5. マイクロ流体チャンネルが下向きになるように60ミリメートルのプラスチック細胞培養皿の内側に各カバーガラス上に一つのデバイスを配置することによって、デバイスを組み立てる。トップOに穏やかな圧力をかけるデバイスfをカバーガラスにデバイスの非常任シールを提供する（マイクロチャネルには手を触れないでください）​​。ふた付き各60ミリメートル細胞培養皿をカバーしています。
6. マイクロピペットを用いて、水が通って流れることを可能にする、上の2つのマイクロ流体リザーバ（ 図1A中の1と2）の細胞培養グレードの水を加えることによってデバイスを水和する。マイクロピペットで水を除去し、マイクロ流体リザーバー1（200μL）および2（100μL）に1 mg / mlのポリ-L-リジンを追加します。体積差は、マイクロチャネル（ 図1A、B）を介して流れるように、ポリ-L-リジンを可能にする。
7. 60ミリメートルの細胞培養皿内のデバイスは、37℃のインキュベーターの内部に転倒しないように150mmのプラスチック製の細胞培養皿にデバイスを含む3つの60mmの細胞培養皿に置き、蓋付き皿を覆う。 5％CO _2、37℃のインキュベーター中でO / Nインキュベートする。典型的には、チャネルの90％以上は、デバイスごとに使用可能であると行う気泡または物理的閉塞が含まれていませ。
8. 翌日、水とポリ-L-リジンを交換し、少なくとも1時間インキュベーター内でデバイスを残す。この洗浄を3回繰り返します。水を除去し、各デバイスにたNeurobasal-（2％、B-27サプリメント及び500μMのグルタMAXを含む）増殖培地を追加します。 5％CO ₂で37℃のインキュベーター内でO / Nのままにしておきます。
9. 後述のように次の日に、海馬細胞をプレート。

マイクロ流体デバイスでのマウスの海馬初代神経細胞の2めっき

注：新生児ラットから培養海馬神経細胞の調製は、以前にJoveの²⁵に掲載されました。以下の微小流体デバイスでプレートマウス海馬神経細胞に適応させたいくつかの変更があり、それがトランスフェクションのために最適であった。

1. マウス脳を解剖前に、前加温ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を含む10％ウシ胎児血清（FBS、抗生物質を含まない）、混合物A（125 mgのDL-システイン、125 mgのウシ血清アルブミン（BSA）およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）500ml中のD-グルコースの3.125グラム、フィルタは0.22μmフィルターを通して滅菌） 37℃の水浴中で：、およびデオキシリボヌクレアーゼI溶液（50 DNアーゼI 20mgおよび1.2 100におけるMをMgSO ₄溶液mlのハンクス平衡塩類溶液（HBSS）フィルターを0.5ml、0.22μmのフィルターを通して滅菌DNアーゼI）。
   1. 前加温するNeurobasal-pHを平衡化するために、5％CO _2、37℃インキュベーター内の成長培地。
2. 確立されたプロトコール²⁶に従って1-3日齢の新生児マウスから海馬を解剖。氷の上で、（10mMのHEPES pH7.4の、50mMグルコース、100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを含むHBSS）10ミリリットル解剖緩衝液を含む15ミリリットルコニカルチューブ内で海馬を保つ。 15ミリリットルコニカルチューブあたり4海馬まで置く。
3. 残りのプロトコルを実行すると、無菌状態下にあるバイオセーフティキャビネット内のsである。
4. 混合物Aを5mlのパパインの45単位を希釈、ボルテックス、及びパパイン粉末が溶解するまで37℃で5分間インキュベートする。 DNアーゼI溶液の1ミリリットルを追加します。 0.22μmのシリンジフィルターユニットを通して混合物を濾過する。
5. 15ミリリットルコニカルチューブを含む海馬から慎重に吸引HBSS」。追加10ミリリットルの冷（4℃）HBSS海馬に、それらを、チューブの底に沈殿させ。慎重に15ミリリットルコニカルチューブからHBSSを吸引。
6. 私は最大4海馬に混ぜ、37℃で20〜30分間インキュベート1ミリリットルパパイン/ DNアーゼを追加します。ミックスと海馬を入浴コニカルチューブを5分ごとに傾けます。代わりに穏やかに振盪（〜100 rpm）で37℃水浴シェーカーで海馬を置く。
7. 吸引パパイン/ Iを混合し、10％FBSを含有する予め温めたDMEM（37°C）で海馬回洗浄アーゼ。
8. 2回目の洗浄の後、2海馬、10％のFBSを含有する予め温めたDMEMを加え、ピペッティングにより手動粉砕物海馬を追加上下〜ニューロンを解離た1mlピペットチップを用いて10〜12倍である。
9. これは非解離ニューロンはコニカルチューブの底に沈殿することを可能にするように粉砕物は、〜1分間沈降しましょう​​。含むトランスファー上清をチューブの底に沈降した大きな組織の移動を回避する新たな15ミリリットルの円錐管にニューロンを解離。
10. 2分間千×gで細胞をスピンし、慎重に細胞ペレットを乱すことなく上清を除去。穏やかにピペッティングすることによって80μlの神経基本成長培地中で細胞を再懸濁する。
11. マイクロ流体リザーバー1,1 'からメディアを取り出します。マイクロ流体リザーバー1への細胞を20μl（〜275000）を適用し、それらが通過流れるようになります。 20分間、5％CO _2、37℃インキュベーター内の場所デバイス。
12. 細胞がカバーガラスに付着していることを確認するために顕微鏡下で見てください。すべての貯水池をオフに先頭にしたNeurobasal-増殖培地を追加します。 5％のCOを用いて37℃のインキュベーターに細胞を持つデバイスを返す _2。
13. 蒸発を避けるために、デバイスごとに〜2〜3日としたNeurobasal-（グルタMAXなし）を含む2％のB-27サプリメントでトップオフ貯水池を確認してください。ニューロンは〜2-3日、めっき後のマイクロ流体チャネルを介してその軸索を拡張するために開始します。 7-10日めっき後、通常、トランスフェクションの対象とニューロン。

マイクロ流体デバイスで栽培海馬ニューロンのトランスフェクション3

1. デバイスごとに、30μlのたNeurobasal-Aの1.2μlのリポフェクタミン2000のミックス、および30μlのたNeurobasal-Aの0.5μgの蛍光貨物融合プラスミドのミックスを調製し、室温で5分間インキュベートする。リポフェクタミンをDNA混合物に混合し、RTで20分間インキュベート加える。 DNAにしたNeurobasal含有4％、B-27サプリメント60μlのを追加/リポフェクタミンは、チューブをフリックで混ぜ混ぜ。
2. 「マイクロ流体貯蔵器2及び2からすべてのメディアを取り外し、慎重に媒体int型の上にこぼすことなく、2％のB-27サプリメントを含むたNeurobasal-Aと井戸を埋める他の区画O。
3. マイクロ流体リザーバー1,1 'からメディアを取り出します。マイクロ流体リザーバーを1に混ぜ、それが流すのDNA /リポフェクタミン120μlのを追加します。 3-4時間、5％CO ₂で37℃のインキュベーターにデバイスを返します。
4. 「マイクロ流体リザーバー1,1からすべてのメディアを取り出し、24時間たNeurobasal-含む2％のB-27サプリメントと交換（または直前まで、画像へ）。典型的には、マイクロチャネルを通じて成長5-7軸索は約海馬培養細胞²⁶に公開の効率と一致1~3％のトランスフェクション効率を表すもの条件下でトランスフェクトされる。

4.「貨物マッピング」分析

1. 荷動きのライブイメージング
   1. 37℃のインキュベーターとCO ₂制御室を備えた倒立落射蛍光光顕微鏡で撮影を行う。
   2. MICRで栽培海馬ニューロンとカバースリップをマウント顕微鏡ステージ上にofluidicデバイス。神経細胞死を回避するためには、もはやより1時間顕微鏡でサンプルを維持するために迅速に動作します。
   3. 高分解能対物レンズ（100X）を使用して、マイクロ流体チャンバのチャネルを通って延び、トランスフェクトされた軸索が検出されたチャネルの数を記録してトランスフェクトされた細胞の軸索を見つける。ハンドタリーカウンターを用いてチャネルの数を数える。
      1. ライブの動きとその後の共局在解析の最適な記録のために、ほとんどの小胞のイメージングがフォーカスして行うことができるようにチャネルを介して比較的平坦な成長軸索を選択します。
   4. 1ミリリットルプラスチック製トランスファーピペットと貯水池2,2 'からの媒体のほとんどを除去。 kymographs上の移動軌跡と定着画像のその後の位置合わせを容易にするために、画像化（ 図1B、C）の間に視野を有するマイクロチャネルの右端を揃える。
   5. フィクサンを容易にするために撮影時のサンプルのgが、2人とライブイメージングを行う。ライブイメージングは​​、一人の人間によって実行される場合に代替的に、ドリフト補正を備えた顕微鏡システムを使用する。
   6. （ 図2および物質一覧の伝説に指定されているYFP-PrP ^Cから^を画像化するための顕微鏡の仕様や設定）タイムラプス分析されている貨物の輸送ダイナミクスに固有の仕様にイメージングライブ貨物移動を開始。
   7. 十分なライブ運動データが収集された後、一人が、細胞を固定するために0.04グラム/ mlのショ糖を含むPBS中で予め温めておいた4％パラホルムアルデヒドで「リザーバ2,2を埋める必要があります。これはライブイメージングの焦点を混乱されるように、マイクロ流体デバイスに触れないようにしてください。固定剤が添加されている間、他の人はピントを合わせる必要があります。運動の即時停止が観察されたときに固定が成功した。その後1,1 'をリザーバ固定液を追加します。
      注：一時photoblea貨物蛍光のチンも観察されることがありますが、モータータンパク質のためのIF染色は（次のステップ）を完了した後に蛍光が持続する。
      注：パラが皮膚と接触して、吸入による有害である、と飲み込む。眼、呼吸器系および皮膚を刺激する。公式規則に従って廃棄してください。
2. 共局在化分析のためのモータータンパク質の染色IF
   注：個々の移動貨物に関連付けられたモータータンパク質の相対レベル（抗体染色によって決定される）の定量のために、検証および抗体 - 抗原結合が飽和されていることを確認するために抗体を滴定する。これは、目的のタンパク質がノックアウトまたはノックダウンのどちらかであったものであり、抗体濃度を増加させて分析IF実行することによって神経細胞を用いた抗体の特異性を決定することによって行われる。陰性対照のために、神経細胞は、一次抗体の非存在下における二次抗体で染色する。より詳細な抗体の検証の説明はEncalada ら ^16、及びSzpankowski ら ²⁰に見出すことができる。
   1. 顕微鏡ステージからマイクロ流体デバイス中で成長海馬ニューロンとカバーガラスを外します。マイクロチャネルは、ライブおよび定着画像を重ね合わせるために無傷のままする必要があるように、カバースリップからマイクロ流体デバイスを取り外さないでください。湿度チャンバ内で、次の手順を実行します。
   2. マイクロチャネル内の溶液の流れを確保するために、少なくとも30μlにリザーバ1,1 '、及び2,2'との間のバッファ量の差を維持する。後続のすべてのステップで。例えば、マイクロ流体リザーバー2,2に100μlのメディアボリュームを追加」、およびマイクロ流体リザーバー1,1〜70μlのメディアボリューム」。
   3. マイクロ流体デバイスのチャンバーから固定液を取り出し、洗浄の間で10分待って、PBSで細胞を3回洗浄する。
   4. 0.1％トリトンX-100 DILUを加えることにより細胞を透過すべての貯水池への5分間PBS中テッド。
   5. すべての貯水池から溶液を除去し、PBSで洗浄する。洗濯の洗浄の間に10分を待って3回繰り返します。
   6. すべてのリザーバーからの溶液を除去し、PBS中10％正常ロバ血清および3％プロテアーゼフリーおよび免疫グロブリンG（IgG）のフリーのBSAを含有するブロッキング緩衝適用し、室温で少なくとも30分間インキュベートする。
   7. 沈殿物を除去するために5分間20,000×gで一次抗体ストック溶液をスピン。ブロッキング緩衝液中で適切な濃度に抗体を希釈する。抗体溶液をマイクロ流体デバイスからブロッキングバッファーを交換してください。 4℃でRTまたはO / Nで2時間のためのサンプルをインキュベートする。
   8. すべての貯水池から溶液を除去し、PBSで3回洗浄し、洗浄の間に10分を待っている。
   9. 沈殿物を除去するために5分間20,000×gで二次抗体ストック溶液をスピン。ブロッキング緩衝液中で適切な濃度に抗体を希釈する。二次抗体溶液を含むPBSを交換してください。インキュベートRTで1時間のサンプル。
   10. すべての貯水池から溶液を除去し、PBSで3回洗浄し、洗浄の間に10分を待っている。
   11. 直接リザーバを接続通路の開口部にマウンティング培地をピペッティングすることにより〜10-20μlの封入剤を含むPBSを交換してください。室温で1時間 - 〜20分間メディアドライをマウントしてみましょう。
   12. 染色の二日（最大1週間）以内に退色を避けるために、光から保護し、4℃で保存する装置、および画像軸索。
   13. 染色が完了した後、顕微鏡ステージ上にマイクロ流体デバイス中で成長海馬ニューロンとカバースリップをマウントします。ステップ4.1.1-4.1.7で撮像されたトランスフェクトした軸索の地域を探します。
   14. 高解像度の目的（ 例えば、高開口数油または水客観）を使用して、貨物、モータ1、モータ2：3つのチャンネルそれぞれに対してZスタック画像（300nmのステップ）を取得する。
       注：軸索がしばしば完全に平坦に成長しないように、Zスタックの取得が重要ですマイクロチャネル及びませんので、全ての蛍光涙点において同じ焦点面内にある。
3. 貨物マッピング
   1. 画像解析ソフトウェアを使用して貨物の移動カイモグラフを生成する。 Rietdorfとザイツ（EMBL）によって開発されたImageJのプラグインがkymographsを生成するために推奨されます（ダウンロードのために参照してください。 マテリアルリスト）。
      注：ImageJの保健^27,28の国立研究所で開発されたパブリックドメイン、Javaベースの画像処理プログラムである（ダウンロード用物質一覧を参照してください）。
   2. 市販のグラフのソフトウェアプログラム（材料を使用して、固定します（ 図2A、B）の時点でのカイモグラフにおける軌跡の位置にそれらを重ね合わせて手動で（ステップ4.2.14で生成された）は、蛍光貨物の固定画像を整列リスト）。最初カイモグラフ上に固定された貨物の画像を重畳し、手動で上の特定の軌道に相当貨物涙点を選択することで、手動での位置合わせカイモグラフ。最良のアライメント結果を得るには、マッピングされた貨物のための最良の焦点が合っているのZスライスを使用しています。いくつかのZスライスを使用してもよい。
   3. XY座標確立アルゴリズムを使用して各蛍光涙点についての強度の振幅が表す点広がり関数に2次元ガウス分布に適合するように決定し、それぞれのZスタック画像（ステップ4.2.14で生成された貨物は、モータ1とモータ2）つのチャネル^16,20,21（ 図2D）のそれぞれにおいて、各点光源。
      注：XY座標取得するには、「モータ共局在」と呼ばれるカスタム構築されたMATLABソフトウェアパッケージはJaqaman、Danuserと同僚^21-23によって開発されたガウシアンフィッティングアルゴリズムを組み込んだ^、16,20を開発した。その使用のためのソフトウェアパッケージと詳細な手順は、要求に応じて得ることができる。
   4. カイモグラフ上のモバイルまたは静止軌道上にマッピングされた個別の貨物涙点のそれぞれについて、tを選択彼は"モーター共局在」プログラムの結果からの座標と強度振幅（これらの貨物は、個別に、図2Bのラベルが貼られていて）XY。別の焦点面上に見られるより多くの貨物をマップするステップ4.2.14で取得されたいくつかのZスタック画像）を使用します。
   5. 個々のXY対応するZスライス（ 図2D）におけるモータチャネルのそれぞれについて得られたものにマッピングされた貨物の座標を比較する。貨物の300nmの半径内にあるXYモータ座標を決定し、選択します。貨物と同じ焦点面内の信号を持っているモータの場合、300 nmの半径内に配置されている涙点を決定するために、「モータ共局在」ソフトウェアパッケージを使用しています。

結果

図1は、海馬神経細胞を成長させるために使用されるマイクロ流体デバイスの概要を示している（ 図1A、B）。ニューロンは、チャネルの長さは、軸索コンパートメントまでずっと交配からの樹状突起を防ぎつつマイクロチャネルの大きさは、軸索コンパートメントに細胞体（細胞体）の拡散を防止するリザーバ1にプレーティングする。培養液中で〜2-3日後に、ニューロンは軸索コンパートメント（ 図1B、C）にマイクロチャネル全体でその軸索を拡張し始める。黄色蛍光タンパク質（YFP-のPrP ^C）で標識された正常なプリオンタンパク質を発現するトランスフェクトされた軸索は、蛍光顕微鏡（ 図1C）によって同定することができる。プラスミドトランスフェクションを使用して、蛍光標識されたタンパク質の発現は、変化したタ​​ンパク質のコンフォメーションへの実験的なアーティファクトを導入可能性が過剰発現などの適切な細胞内局在と機能のためにチェックする必要があります。したがって、colocalizatイオン実験は、生化学的共沈...

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、ライブニューロンにおける相対的なタイプと関連したモータータンパク質の量と個々の蛍光微小管ベースの移動貨物粒子の運動の方向性との相関を可能にします。以前は、軸索水疱貨物の総運動組成物は、生化学的に精製された小胞およびオルガネラ^9,15の不均一な集団で検定した。しかし、細胞内での貨物のシングルタイプの特徴づけるモーター組成が原因均質ベシクル集団を精製することが困難である挑戦されています。モータストール力の測定は、ショウジョウバエ胚においてアクティブモーター数の推定値を提供しながら、また、それは動きの方向を安定して貨物またはへ/積荷¹²から活性モータの迅速な会合/解離に束縛されるモータと相関するかどうかは不明であった。そのため「貨物マッピング」プロトコルはdescriここのベッドは、さらに種類や個別のライブニューロンで貨物を移動するために関連したモータの相対数との相関関係を調査するために開発されました。

首尾よく「貨物マッピング」からデータを取得...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリ-L-リジン	シグマ	P5899-20mg
D-MEM(ダルベッコ's Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Pyruvate Sodium (1x)	Life Technologies	11965092
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	10082147
Neurobasal-A Medium (1x)	Life Technologies	10888022
B-27 Serum Free Supplement	Life Technologies	10888022
GlutaMAX I Supplement (100x)	LifeHBSS	35050061
(1x) (Hank's Balanced Salt Solution)	ライフテクノロジー	24020117
DPBS(ダルベッコ)リン酸緩衝生理食塩水、マグネシウム、カルシウム不使用 (1x)	Life Technologies	14190250
ペニシリン/ストレプトマイシン (100x)	Life Technologies	15140122
Corning cellgro Water for Cell Culture	フィッシャーサイエンティフィック	MT46000CM
パパイン	USBコーポレーション	19925
DL-システインHCl	シグマ-アルドリッチ	C9768
BSA(ウシ血清アルブミン)	シグマアルドリッチ	A7906
D-グルコース	グマアルドリッチ	G6152
DNAse IグレードII	ロシュ応用科学	10104159001
リポフェクタミン 2000	ライフテクノロジー	ズ
ホルムアルデヒド溶液16%EMグレードの	フィッシャー科学	50980487	注意:吸入、皮膚との接触、飲み込んだ場合、有害です。目、呼吸器系、皮膚に刺激を与えます。公式の規則に従って廃棄してください。
ショ糖	フィッシャーサイエンティフィック	S5-500
HEPES	シグマ	H-3375
ノーマルロバ血清	ジャクソン免疫研究	017-000-0121BSA
脂肪酸およびIgGフリー	ジャクソン免疫研究	001-000-162
トン	フィッシャーサイエンティフィック	BP2403-4
エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	BP2818-100
ProLong Gold 色あせ防止試薬	Life Technologies	P36934
カバーガラス 1 1/2. 24 x 40 mm	Corning	2980-244
Axis microfluidic device, 450 & micro;m	ミリポア	AX450
Adobe Photoshop	Adobe
Nikon Eclipse TE2000-U	ニコン
CoolsnapHQカメラ	ローパーサイエンティフィ
60 mm細胞培養ディッシュ	フィッシャーサイエンティフィック	12-565-95
150 mm細胞培養ディッシュ	フィッシャーサイエンティフィック	12-565-100
抗体:
抗キネシン軽鎖、V-17	サンタクルス	sc-13362	KLC1-/-ニューロンを用いて特異性を確認(文献16)、推奨希釈率1:100。
対ダイニンヘビーチェーン1、R-325	サンタクルーズ	sc-9115	shRNAを用いたDYN1HC1に対する特異性の検証(文献16)、推奨希釈率1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody	Life Technologies	A10042	推奨希釈率1:200。
Alexa Fluor 647 ロバ抗ウサギ IgG (H+L) 抗体	Life Technologies	A31573	推奨希釈率1:200。
Alexa Fluor 568 ロバ抗ヤギ IgG (H+L) 抗体 IgG 抗体	Life Technologies	A11057	推奨希釈率1:200。
Alexa Fluor 647 ロバ抗ヤギ IgG (H+L) 抗体	Life Technologies	A21447	推奨希釈率1:200。
プラグインとマクロ
ImageJ			http://imagej.nih.gov/ij/index.html.
ImageJ Kymograph Plugin			http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.