この作業は、MALDI-TOF MSを使用して細菌を迅速に同定するための手順を詳述しています。同定手順には、スペクトル取得、データベース構築、およびフォローアップ分析が含まれます。類似係数ベースの方法とバイオマーカーベースの方法の2つの同定方法が提示されます。
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方法論記事
MALDI-TOF質量分析およびカスタムデータベースを使用すると、ユニークな洞窟環境（カーチェナー洞窟、AZ、USA）を常在菌を特徴づけるために
この記事について
サマリー
要約
MALDI-TOF質量分析は、属や種、場合によっては菌株レベルで細菌を特定するための迅速で信頼性の高いツールであることが示されています。識別を容易にするために、市販のオープンソースソフトウェアツールが開発されています。ただし、文献にはユニバーサル/標準化されたデータ分析パイプラインは記載されていません。ここでは、MALDI-TOF質量分析計を使用した細菌同定手順の包括的かつ詳細なデモンストレーションを提供します。質量スペクトルは、米国アリゾナ州Kartchner Cavernsから単離された15の多様な細菌から収集され、16S rDNAシーケンシングによって同定されました。データベースはBioNumerics 7.1で構築されました。クラスター分析、ピークマッチング、統計分析など、質量スペクトルのフォローアップ分析を実施しました。同定は、これらの15個の細菌から無作為に選択されたブラインドコードサンプルを使用して行いました。類似係数ベースの方法とバイオマーカーベースの方法の2つの同定方法が提示されます。結果は、両方の同定方法が細菌を種レベルで識別できることを示しています。
概要
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析(MS)は、属、種、場合によっては菌株レベル1-4の細菌を同定するための迅速で信頼性の高いツールであることが示されています。MALDI-TOF MSは、細胞表面、細胞内膜、および細菌全細胞またはタンパク質抽出物からのリボソームに由来する生体分子(通常はタンパク質)をイオン化します1,5。結果として生じるピークは、分析された細菌の特徴的なパターンまたは「指紋」を形成します1。細菌の同定は、これらの質量から電荷までの「指紋」に基づいています。
最も一般的に使用される同定戦略の2つは、ライブラリベースとバイオインフォマティクスベースの戦略です1。ライブラリベースのアプローチでは、未知物質の質量スペクトルを、データベース/ライブラリ内の既知の細菌の以前に収集された質量スペクトルと比較し、同定します。BioNumerics、Biotyper、SARAMISソフトウェアパッケージなどの市販ソフトウェアや、SpectraBank6などのオープンソースソフトウェアツールが利用可能で、未知物質の質量スペクトルと参照細菌の類似性の比較と定量化が容易です。バイオインフォマティクスに基づくアプローチでは、通常、完全に配列決定された細菌のゲノムを同定することに依存しています。特定のピークの生物学的性質の同定を伴わないラ....
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プロトコル
注意 ：どのような環境からの未確認細菌は病原性とすることができ、適切なバイオセーフティプロトコルを使用して、慎重に処理する必要があります。ライブ文化との仕事は生物学的安全レベル2（BSL-2）の手順を使用して、クラスII安全キャビネットで実行する必要があります。 BSL-2手続きの詳細については、CDC / NIHのタイトルのマニュアル、「微生物学的および生物医学研究所でバイオセーフティ、「ページ33-38で利用可能です。ドキュメントは、オンラインで利用可能ですhttp://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf 。白衣/ガウン、安全眼鏡、及びニトリルまたはラテックス手袋など適切な個人用保護具（PPE）は、着用しなければならない。標準微生物学的慣行や注意事項に従わなければならず、バイオハザード廃棄物は適切に廃棄しなければならない。
このデモで使用される細菌は、カーチェナー洞窟から単離した、AZ、USA、ドライ鍾乳石、フロー石、湿った鍾乳石や鍾乳石のドリップ（ 表1）を含む4つの環境から。すべての分離株は、16S rDNAの塩基配列決定によって同定され、25％グリセロール、R 2 B培....
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結果
このデモで構築したデータベースは、「すべてのレベル」、「種」、それぞれ「生物学的複製」と「技術複製」、（ 図1A）を含む、最高に最低レベルから、4つのレベルを持っていた。 「技術の複製」レベルは技術的反復のすべての前処理されたスペクトルを含んでいた。 「生物学的複製」と「種」レベルはコンポジット（サマリー）スペクトルを含んでいた。 「すべてのレベル」は、すべての技術的複製スペクトルだけでなく、すべての複合スペクトルを含んでいた。
スペクトラム集約手順は代表的ピークを用いて、図1に示されている。各メンバー質量スペクトルは、薄い灰色の線として表示されます。複合スペクトルを赤色に着色線として表されている。隣接するピークは容易に目視検査（ 図1B）を可能にするために別の色でマークされています。
、表1に示されている。最も再現性バチルス種 Bについて98.0±1.4であり、最も低い再現Curviba.......
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ディスカッション
このデモでは、特性評価およびMALDI-TOF MSおよびカスタム·データベースを使用して、細菌の同定の詳細な手順を示した。例えば、伝統的な分子的方法、16S rDNAの塩基配列決定と比較して、MALDI-TOF MSベースのフィンガープリント法は、多様な細菌のより迅速な識別を容易にする。 、そのロバスト性のため、この技術は、広く環境から臨床現場1,14-16細菌、ウイルス、真菌および酵母を特徴付けるために使用される。また、MALDI-TOF MSは、いくつかの場合において、より高い分類学的解像度1を得たことが報告されている。例えば、 バチルス·エスピー。 、B、D、及びEは、一緒に（ 図2）をクラスタ化する傾向があるものの、明確に分離し、異なるB.種のスペクトルの間の類似性。 80％未満である（ 図2）であった。対照的に、これらの分離株の16S rDNA配列は、これらの分離株を区別するために使用することができなかった高い類似性を有していた種レベルで。 B. SP .......
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開示事項
著者のVranckxとJanssensは、このビデオで使用されているデータ分析ソフトウェアのメーカーであるApplied Maths NVの従業員です。Applied Maths NVは、このビデオで取り上げられている一部のソフトウェアモジュールと、このビデオに関連する出版費用の一部を提供しました。
謝辞
この作業は、アリゾナ州立大学のニューカレッジオブインターディシプリナリーアーツアンドサイエンス、Applied Maths NV、およびNational Science Foundation(ROA Supplement to Award No.MCB0604300)。この資料で表明された意見、調査結果、結論または推奨事項は著者のものであり、必ずしも全米科学財団の見解を反映しているわけではありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| &α;-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸 | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%, CAS 28168-41-8 |
| Bruker FlexControl ソフトウェア | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bruker FlexAnalysis software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bionumerics software | Applied Maths | version 7.1 |
参考文献
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al.
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再版と許可
