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方法論記事

転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖

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DOI：

10.3791/52087

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2015年1月12日

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Institute of Biochemistry and Biology, University of Potsdam, 3Institute of Molecular Biology, Medizinische Hochschule Hannover

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ゼブラフィッシュの心臓発生中の心臓遺伝子発現プロファイルを分析するために、総RNAを単離した心臓から抽出されなければならない。ここでは、心臓特異的mRNAを得るために、ゼブラフィッシュの胚からの迅速な手動の切開によって、機能/鼓動心を収集するためのプロトコルを提示する。

要約

ゼブラフィッシュ胚の心臓は胚全体のごく一部を表す、わずか数百の細胞から構成されている。したがって、グローバル胚トランスクリプトによってマスクされているから心臓のトランスクリプトームを防止するためには、さらなる分析のために心臓の十分な数を収集する必要がある。ゼブラフィッシュの心臓の開発が急速に進行していくまた、心臓の収集およびRNA抽出方法は、サンプルの均一性を確保するために迅速である必要がある。ここでは、ゼブラフィッシュの胚から機能/鼓動心を収集するための迅速な手動の解剖プロトコルを提示する。これは、トランスクリプトーム解析によって、このような定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCRの）として、心臓特異的な遺伝子発現レベルを決定するために、後続の心臓特異的RNA抽出のための必須の前提条件である。この方法は、他の組織と比較して、ゼブラフィッシュ胚の心臓の差動接着特性に基づいている。これは、迅速なPHYが可能になり流体せん断力の中断、段階的にろ過およびトランスジェニック、蛍光標識された心のマニュアルコレクションの組み合わせによる心外組織から心臓のsical分離。

概要

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） が広くによりサイズが小さく、蛍光タンパク質の組織特異的な発現を有するトランスジェニックレポーターラインの利用可能性と合わせて、高速で透明かつ子宮外胚発生、 インビボでの器官形成を研究するために発生生物学で使用されている。初期のゼブラフィッシュ胚の酸素は、心拍、血流に依存しないので、この小さな脊椎動物は、心臓発生を研究するために特に適している。これらの機能は、心血管の変異体1,2の多数の特徴付けを可能にしたとゼブラフィッシュは現在、心疾患3を研究するための広く認識モデル生物である。

胚発生の間の遺伝子発現を研究するために、転写物は一般にホールマウントin situハイブリダイゼーション （WISH）4によって分析され、RT-qPCRを5、マイクロアレイ6、または次世代シークエンシング（RNA配列）7。同時にWISHは全体胚内の遺伝子発現の空間的·時間的な分析を可能にする、転写レベルは通常、RT-qPCRを、マイクロアレイまたはRNA-配列アプローチによって評価される。しかしながら、これらの方法は、特異的な遺伝子発現プロファイリングのための組織の濃縮を必要とする。

ゼブラフィッシュ胚の心臓は全体の胚のごく一部を表すので、心臓の開発中にトランスクリプトーム研究は心の解剖と濃縮のためのプロトコルが必要。また、生理学的に関連するデータを得るためには、RNA抽出まで、完全に機能的心臓組織を維持することが重要である。ここでは、急速に生理的に通常の単離及び効率的にさらなる分析のための高品質なRNAサンプルを得るために、ゼブラフィッシュの胚の数百人から心を打つためのプロトコルを記述します。本発明の方法は、バーンズとマクレー、2006年8によって報告されたプロトコルに基づいています。心臓組織の充実のために、両方の方法は、トランスジェニック心筋のレポーターラインを使用する他の組織に対するゼブラフィッシュ胚の心臓の差動接着特性を利用する。簡単に言えば、狭いピペットチップを通して上下に多くの胚をピペッティングすることにより、心臓を同時に胚の体から解放され、その後、2急速ろ過段階で胚の破片から分離。蛍光標識した心は、手動で残りの破片から選別し、さらなる処理のために収集されます。

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プロトコル

このプロトコルは、ドイツのベルリン州法の動物のケアのガイドラインに従います。ゼブラフィッシュの取り扱いは、動物保護のための地方自治体（LaGeSo、ベルリン·ブランデンブルク）によりモニターした。

1.ハート抽出のためのゼブラフィッシュ胚の取得

  1. そのようなTgは（myl7：EGFP）などのクロス心臓レポーターゼブラフィッシュtwu34ジェニックライン9ハート固有のGFP発現を持つ胚を得るために。
  2. 希望胚段階10,11まで28.5℃で、卵の水で胚を維持する。収集された胚の集団が遺伝子発現の変動を制限するために、両方の遺伝的および発達段階によって均質であることを確認してください。
  3. 手動で胚をDechorionate。

2.解剖ゼブラフィッシュ胚ハーツ

注：氷の上のすべてのソリューションを保管してください。可能な場合は、チームワークを行います。1人はEMBから心を解剖ryos別の人は、蛍光実体顕微鏡下で心をソートしながら。これは、数時間で胚の数百の処理を可能にする。

  1. 1.5ミリリットルの遠心チューブに約100の胚を転送します。トリカイン（E3培地中0.16 mg / mlで）で胚を麻酔。胚を明確に麻酔をされると進みます（彼らは泳ぐとチューブの底に沈殿物が、その心はまだ暴行されていません）。
  2. トリカイン/ E3ソリューションを削除し、1ミリリットルL-15/10％FBS培地で1回の胚を洗浄し、氷上で維持する。
    注：L-15/10％FBS培地の心はをRNAlaterまたはトリゾールに移されるまで、全体の解剖手順の間に生きている臓器や細胞を維持することが重要である。
  3. 卵黄が完全に破壊されるまで、ラウンドゲルローディングチップで胚およびピペット上下に5-8回に1ミリリットルL-15/10％FBS培地を追加します。胚が滴下溶液の表面上に、ドロップが破裂するように、ピペット胚を穏やかに破壊される。
    注：どのように積極的に、どのくらいの頻度胚が上下にピペッティングしなければならないことは胚の発達段階に依存し、 すなわちより多くのピペット操作（ 例えば 56 HPFで）後期段階で必要とされている。
  4. 解剖胚の最初のバッチのために、あまりにも静かにピペットであれば、いくつかの心は胚に付着したままかもしれないので、胚の整合性と実体顕微鏡下で解剖の心の割合を評価する。それに応じて解剖の次のラウンドのためにピペット操作の仕方を調整します。
    注：プラスチック製にこだわり心を最小限に抑えるために、低保持ピペットチップとマイクロチューブを使用してください。
  5. 50ミリリットルの遠心チューブに置か100μmのフィルター上にサンプルを適用します。 1ミリリットルL-15/10％FBS培地で1.5mlチューブをすすぎ、その後（いくつかの心臓は、チューブの壁に付着しているかもしれません）サンプルの損失を最小にするために、フィルタにこれを適用する。 1ミリリットルLで二回フィルターを洗浄-15 / 10％FBS。このステップでは、心臓は、フィルターを通過し、50 mlチューブに回収する。
  6. 15ミリリットルの遠心チューブの上に配置さ30μmフィルター上にフロースルーを適用し、1ミリリットルL-15/10％FBS培地で1回フィルターをすすぐ。この第2の濾過工程においては、心臓は、フィルタ内に保持され、より小さな破片を洗い流す。
  7. 逆さまにフィルターを回して、1ミリリットルL-15/10％FBSで3つの連続した​​回の洗浄を適用することにより、1％アガロースでコーティングされたシャーレにフィルタの外心をフラッシュする。
  8. 蛍光実体顕微鏡下にピンセットで非蛍光胚破片（ 例えばアイレンズ）から手動で独立したGFP陽性心と皿の中央でそれらを集中する。ステップ3に従ってそれらを収集します。
    注：胚が24 HPFよりも古い場合は、心は組織がまだ生理的に正常であることを示す、暴行されるべきである。

3. DissecからmRNAを単離しテッドハーツ

  1. 0.75ミリリットルのRNAlater（氷上）を含む1.5ミリリットルチューブに可能な限り最小容量（ 例えば 、10μL）で心とピペットを収集します。何の心は、蛍光実体顕微鏡下でそれを見ることによって、ピペットチップに残っていないことを確認します。
  2. あるいは、化学フードは蛍光顕微鏡のすぐ近くに利用可能である場合、化学フードの下のTrizol（注意）に集め心を移す。これはピペットチップにし、また心の遠心分離中にこだわりの心の損失の可能性を回避する（3.4、3.5および3.7ステップ）。トリゾールと同じチューブに分離のいくつかのラウンドからの心をプールし、3.8のステップに直接進む。最終体積は元のトリゾール容積の10％を超えてはならない。
    注：使用前にトリゾール製品安全データシート（MSDS）をお読みください。ボンネットの下にTrizol試薬を処理し、推奨される個人用保護具を着用する。皮膚、目やclothiとの接触を避けてくださいNG。発火のすべてのソースを削除します。
  3. RNA単離の効率が採取した組織の量を使用すると向上として、（氷上）RNAlaterで同じチューブに分離のいくつかのラウンドからの心をプール。全試料体積は、元のRNAlater体積の10％を超えると、（氷上で）保存のために0.75ミリリットルRNAlaterで追加のチューブを使用する。
  4. 遠心機で4℃で20分間15700×gで試料は心を沈降する。
  5. 蛍光実体顕微鏡下では、3ミリリットルL-15/10％FBS培地を含む1％アガロースでコーティングされたシャーレにできるだけ丁寧に限り多くの上清を回収したが、遠心分離管の底に沈殿し、心を乱すことがありません。心の最大15％がRNAlaterでの高粘度のために上清中に残ることができるのでステップ3.7で説明したように、それらを取得。
  6. 化学フードの下で、沈降した心を含むチューブに0.5ミリリットルのTrizolを追加し、氷上に保つ。
  7. 蛍光microscoの下でPEの、希釈する3ミリリットルL-15/10％FBSを有する別の1％アガロースでコーティングされた皿にRNAlater中/ L-15/10％FBS溶液を含む1％アガロースでコーティングされた皿から（ステップ3.5）からの心臓を転送RNAlaterを出。ペトリ皿の中央に心を収集し、化学フードの下のTrizol中で沈降した心のチューブに小さな音量でそれらを転送する。
  8. 心を破壊し、室温で5分間インキュベートし、トリゾールで心を含む渦1.5mlチューブ。
  9. 化学フードの下で、100μlのクロロホルム（注意）を追加し、完全に混合し、1.5ミリリットルに事前に紡糸しPLGチューブ（使用前に最大速度で遠心30秒）をトリゾール/クロロホルム溶液を転送する。室温で3分間インキュベートする。
    注：使用前にクロロホルムのMSDSを参照してください。ボンネットの下にクロロホルム試薬を処理し、推奨される個人用保護具を着用する。皮膚、眼、そして衣服との接触を避ける。金属、アルカリなどの非互換性から遠ざけること。
  10. Centrifugeと4℃で15分間15700×gでのサンプルと新しい1.5mlチューブへ水相を転送する。
  11. 5〜10μgのグリコーゲンとイソプロパノール（-20℃で）予冷250μlのを追加します。よく混ぜ、-20℃で一晩インキュベートする。
  12. 遠心機で4℃で30分間15700×gでサンプルし、上清を廃棄する。
  13. 、1ミリリットルを75％エタノールでペレットを洗浄し、4℃で15分間15700×gで遠心分離し、上清を捨てる。
  14. それは（10〜15分間、例えば ）の白色になるまで室温でペレットを乾燥させてエタノールを蒸発さう。
  15. ペレットに20μlのRNaseフリーのddH 2 Oを追加し、RNAを溶解させ、55℃で10〜15分間インキュベート。その後氷上に保つ。
  16. 吸光度測定によってRNA濃度および純度を評価。 1％アガロースゲル上でサンプルを実行して、RNAの完全性を評価する。

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結果

独占的に心筋（図1）内twu34トランスジェニック系統9、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する：ここでは、ゼブラフィッシュのTg（GFP myl7）を使用して、代表的な心臓の解剖実験について説明します。我々は、解剖心、それらが心臓サンプルの純度を評価するために誘導された胚の両方を収集した。簡単に言えば、ホモ接合のTg（myl7：GFP）は、すべての胚の心臓をGFP標識したように、ゼブラフィッシュ9は 、野生型と外部交配しtwu34。いくつかの500の胚（56ゼブラ）を1.5 mlチューブに移した（約100の胚を各）（図1A1、図1B）。プロトコルセクション（ステップ2）および図1（a）に記載したように各チューブを加工した。ハーツは、ピが発表し、上下に数回（図1A2）した後、100μmのフィルターに塗布した（図1A3）。胚組織の大きな部分は、このフィルターに保持された。この画分を取得し、foをトリゾールに入れ「胚心なし」のRNAサンプル（図1A3）を取得するには...

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ディスカッション

このプロトコルは、遺伝子発現解析のためのゼブラフィッシュ胚の心臓組織の迅速な濃縮を可能にする。 RNA精製だけで十分で動作しますので、心の喪失は、プロトコルのすべての段階で阻止される場合は、最初の、試料の量が大幅に改善されている：心臓特異的RNAサンプルの量と質が大幅にいくつかの重要なステップに依存します出発材料。次に、実験者に完全に依存したサンプルの純度は、ソートや厳密に他の組織を除外して、ペトリ皿内の心臓を収集することにより決定される。第三に、サンプルの品質は、批判的に胚の破壊の際に発生する可能性がRNAの分解を制限することに依存します。これは、細胞死を回避するために、細胞培養培地を使用し、サンプルを氷上で維持することによって達成される。心をRNAlaterまたはトリゾールに転送された後にRNAの分解が停止される。心はシャーレに暴行されていることを強力に実証する心臓トン問題は、解剖後に生理的に正常です。

私たちは、十分なRNAが安全に（一緒に5〜10μgのグリコーゲンと）沈殿させることができる、そこから少なくとも300の心（ すなわち約500胚）で始まることを...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この精製プロトコルの基本原理を概説してくださったC. Burns氏、C. McRae氏、そしてこの方法を私たちの研究室で最初に実装してくださったF. Priller氏に感謝します。S.A.-S.は、ドイツ研究振興協会(DFG)のハイゼンベルク教授職によってサポートされています。本研究はDFG grant SE2016/7-1の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
魚の飼育と卵の収集のための機器 詳細はゼブラフィッシュBook11
蛍光実体顕微鏡
冷蔵微量遠心機
UV分光光度計例えば Thermo Scientific Nanodrop 2000
核酸電気泳動チャンバー
ペトリ皿4cmØ、E3媒体
ピペットとチップ(P20、P100、P1000)
1.5ml遠心分離チューブ15ml
と50ml遠心分離チューブデュ
モン#5鉗子
のペアでコーティングExactaCruz™滅菌ラックの丸型ゲルローディングのヒント、1-200μl サンタクルスsc-201732
100 μmフィルター (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)BD Biosciences352360
30 μmフィルター(プレセパレーションフィルター-30µm)Miltenyi Biotec130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes プライム2302810
エッグウォーターミディアム60μg/ml インスタント オーシャン シー ソルト ddH2O、0.00001% (w/v) メチレン ブルー
E3 培地 5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino 安息香酸エチルエステル)Sigma-AldrichA-50404 mg/ml Tricaine Stock Solution, pH 7
1% Agarose (in E3 medium)
1% アガロースゲル (TBE buffer 中)
Leibovitz´s L-15 ミディアム Gibco21083-027
FBS (ウシ胎児血清)SigmaF4135
RNAlaterAmbionAM7020
TrizolAmbion1559606
グリコーゲン Invitrogen10814-01020 µg/µl RNaseフリー水
クロロホルム
イソプロパノール
75% エタノール (DEPC-ddH2O中)
ヌクレアーゼフリー水または滅菌済み DEPC 処理済み ddH2O
TBE(トリス/ホウ酸塩/EDTA)バッファー
をご覧ください マイクロ 電気泳動用核酸ローディングバッファー

参考文献

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