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方法論記事

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光インビボ光学イメージング

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⸱

DOI:

10.3791/52136

⸱

2015年1月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

in vivoイメージングのための蛍光色素の使用は、オプソニン化、迅速なクリアランス、低い検出感度、および宿主に対する細胞毒性の影響によって大幅に制限される可能性があります。フィルムの水和と押出しによって蛍光色素をリポソームにカプセル化すると、蛍光の消光と保護が可能になり、高い検出感度でin vivoイメージングが可能になります。

要約

光学イメージングは、幅広い診断モダリティを提供し、生物医学イメージングのツールとして多くの関心を集めています。現在、膨大な数のイメージング技術が利用可能であり、機器化が進歩しているにもかかわらず、in vivoイメージングに適した高感度プローブが依然として必要とされています。利用可能な前臨床蛍光プローブの典型的な問題の1つは、in vivoでの迅速なクリアランスであり、イメージング感度を低下させます。急速なクリアランスを回避し、標的部位の色素分子の数を増やし、それによってバックグラウンドの自家蛍光を減らすために、近赤外蛍光色素DY-676-COOHのリポソームへのカプセル化と、炎症のin vivoイメージングの可能性の検証が行われました。DY-676は、高濃度で自己消光する能力で知られています。まず、自己消光に適した濃度を決定し、次にこの消光濃度をPEG化リポソームの水内部にカプセル化しました。リポソームの消光および活性化能を実証するために、カプセル化された色素に影響を与えることなくリポソーム膜の損傷につながる過酷な凍結方法を使用しています。高レベルの蛍光消光を特徴とするリポソームは、Lip-Qと呼ばれました。さまざまな細胞株を用いた実験により、Lip-Qの取り込みは主に食作用によるものであり、その結果、マウスモデルにおける炎症のin vivoイメージングのツールとしての可能性を特徴づけることが可能になったことが示されています。さらに、マウスのザイモサン誘発浮腫モデルを使用して、in vivoでの炎症の光学イメージングにおけるLip-Qの可能性を実証します。炎症による透過性と保持(EPR)の増強効果による取り込みの可能性を考慮し、DY-676-COOH(Lip-dQと呼ばれる)と遊離DY-676-COOHの消光しない濃度が低い常時オンのリポソーム製剤を動物実験でLip-Qと比較しました。

概要

リポソームは、集中的に調査し、臨床応用1,2に最も生体適合性の生物医学的な薬物送達システムの一つとして機能してきた。これらは、主に天然の細胞膜の一部を模倣する生体適合性化合物であり、その両方が、リン脂質およびコレステロールから構成されている。親水性物質は水性内部内に捕捉することができるが、親油性薬剤は、リポソームのリン脂質二重層3内に組み込むことができる。リポソームの水性内部内の ​​物質のカプセル化は、 インビボでの分解に対する保護を付与し、また、腫瘍細胞を破壊することを目的とし、例えば化学療法のための疾患の治療のために使用される細胞毒性薬剤の毒性作用からホストシステムを防ぐ。ポリエチレングリコール（PEG化）のようなポリマーとリポソーム表面の修飾は、さらにによる立体安定化を、インビボでのリポソームの血液循環時間を延長4。 Moreov小胞体、リポソームは、タンパク質、5,6-、親水性物質7,8および酵素9のようないくつかの物質の高濃度を隔離することができる。したがって、それらは、そのような癌治療のための4ドキソルビシンなどの細胞毒性薬剤の送達のための彼らの承認に値するとして信頼性の高い臨床治療および診断ツールを提供しています。それらの柔軟性のために、リポソームは、診断および画像誘導外科的目的のために蛍光色素をロードすることができる。

蛍光イメージングは、しかしながら、いくつかの基本的な要件を要求するインビボでの診断ツールでコスト効果の高い、非侵襲的に提供する。これは、in vivoイメージングのための最高に合う蛍光色素は、光分散及び散乱ならびに水由来の組織の自己蛍光およびヘモグロビンが低い範囲の特性吸収と発光極大を有することが証明できた。したがって、そのようなプローブは、650と900 nmの10の間に彼らのABS /全角最大を持っている。オプソニン化および急速なクリアランスが大きくインビボ画像11のためのそれらの適用を制限することができ、この他に、in vitroおよびin vivoの両方での蛍光色素の安定性は、重要である。そのような貧しい安定性と低感度やインドシアニングリーン（ICG）12-16で見られるように標的器官に細胞毒性作用などの他の効果は、望ましくないとin vivoイメージングのためのプローブを設計する際に考慮に入れなければならない。これらの観察は、いくつかの前臨床NIR蛍光色素、ナノ粒子、ならびに炎症プロセス、癌のin vivoイメージングのための、画像誘導手術17-20のための新しい技術の開発が活発につながっている。ほとんどの前臨床NIRF（近赤外蛍光）の安定性にもかかわらず、染料インビトロ 、肝臓および腎臓を介してそれらの迅速な灌流およびクリアランス疾患および炎症プロセスのインビボ光学イメージングにおけるそれらの使用を妨げる。

ntentは">したがって、我々はそのようなよく特徴付け近赤外蛍光色素DY-676-COOH、比較的高濃度のリポソームで21で自己クエンチする傾向のために知られているような蛍光色素のカプセル化のためのプロトコルを提示する。高濃度でH-二量体形成および/または蛍光色素分子間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に互いのフェルスター半径結果内に位置するフルオロフォア分子間のπスタッキング相互作用、低濃度では、フルオロフォア分子の間隔が増大し、それによって、πスタッキング相互作用を防止しHダイマー形成および高い蛍光発光をもたらす。高および低濃度および添付蛍光消光及び活性化との間のスイッチは、光学イメージング22に利用することができる有望な戦略である。この点で、NIRF染料高濃度のカプセル化DY-676-COOHリポソームの水性内部には多くのFAです遊離色素よりもin vivoイメージングのためのvorable。この方法の課題は、染料を高濃度でカプセル化から生じる利益の検証において、第二に、正しいカプセル内のすべての第ある。遊離色素のそれでクエンチしたリポソームの結像特性を比較し、また、色素の濃度が低い非クエンチリポソーム製剤とすることが不可欠である。私たちは、リポソーム中DY-676-COOHの消光濃度のカプセル化が可能であり、代替凍結融解サイクルと組み合わせるシンプルな、しかし非常に効果的なフィルムの水和と押し出しプロトコルによって示している。そのような逆相蒸発法23と同様にエタノール注入法24としてのリポソームを調製するために使用される他の方法は、多くの親水性物質のための高い封入効率を有するリポソーム製剤を可能にする。しかし、カプセル化される物質の性質は、カプセル化効率に影響を与えることができる。実際には、ここで紹介するフィルムの水和と押し出しプロトコルは、DY-676-COOHのカプセル化のための最高の効率を明らかにした。 DY-676-COOH、数時間以内に、炎症過程の研究を可能にするザイモサン誘導浮腫モデルのリポソームカプセル化の利点を説明するために、使用された。ここでは、カプセル化されたDY-676-COOHの高濃度を有するリポソームが遊離色素または低染料濃度を有する非クエンチリポソーム製剤よりも炎症過程のインビボ光学イメージングに全身に適していることが実証される。したがって、基本的なプロトコルは、 インビトロおよびインビボの両方でクエンチし、蛍光リポソームおよびそれらの活性化およびイメージング可能性の検証を生成するための簡単かつ迅速な方法を提供する。

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プロトコル

注：すべての手順は、地域の動物委員会や動物の倫理的な使用に関する国際的なガイドラインに従って承認されている。

材料と楽器の作製

  1. 自然発生的に形成された小胞分散液の調製（SFV）
    1. 溶解すると、以下のリン脂質のストック溶液を調製する：214 mg / mlの卵ホスファチジルコリン（EPC）、134 mg / mlのコレステロール、122 mg / mlの1,2- distearoyl- のsn -glycero -3- phosphoethanolamine- N - [メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（アンモニウム塩）（のmPEG 2000 -DSPE）および2mg / mlの1,2- dioleoyl- のsn -glycero -3- phosphoethanolamine- N - （7-ニトロ- 2-1,3-benzoxadiazol-4ガラスバイアル中でクロロホルムストア内イル）（アンモニウム塩）（NBD-DOP​​E）。
    2. 丸底フラスコ中で約3ミリリットルのクロロホルムを提出し、EPからなるリポソームを調製する丸底フラスコに、リン脂質のストック溶液の適切な容量を転送するC：3：0.5のChol：6.5のモル比でのmPEG 2000 -DSPE。リポソームの二重蛍光標識のために脂質溶液に0.3モル％NBD-DOP​​Eを追加します。
    3. ロータリーエバポレーターを用いて55℃で減圧（300ミリバール）下で、有機リン脂質溶液からクロロホルムを蒸発させる。
    4. 均一なリン脂質膜を形成した後、残留クロロホルム堆積物を除去するために1〜2時間10ミリバールの圧力を低下させる。
    5. クロロホルムが蒸発している間、10 mMトリス緩衝液（pH7.4）にDY-676-COOH（6.181μM）を溶解し、液体窒素デュワー瓶を埋める。超音波浴に切り替え、50℃に設定。
    6. DY-676-COOH（6.181μM）自然発生的に形成された小胞（SFV）の分散が形成されるまでドライリン脂質フィルム、激しく渦を水和する丸底フラスコに、溶液の適切な容量（0.5〜ml）を転送します。リン脂質の全てが脂質の損失を回避するために、分散していることを確認してください。
    7. 慎重にTRA液体窒素中SFV分散体を含有する丸底フラスコnsferと3-5分間分散をフリーズ。その後分散を解凍1-2分間激しく分散を渦に50℃の超音波浴に丸底フラスコを置きます。 7凍結融解サイクルの合計を作り、この手順を6回繰り返します。
  2. 均質なリポソーム小胞を形成するためのSFVの押出
    1. 1mlシリンジ（注射器-a）の中SFV分散液を移し、シリンジ-bの中にLiposoFastベーシック押出機を用いて100nmのポリカーボネート膜を通して分散液を押し出す。
    2. サイクルを10回繰り返した後、バックシリンジ-Aに、注射器-bから分散を押し出す。押し出し、時間との明確な分散物に曇った外観から注射器の変化で溶液に起因する。 10サイクル（20シングル押し出しステップ）した後、デバイスから注射器-Bを削除し、直接、滅菌シリンジ-から最後の時間のための分散を押し出す1.5ミリリットルの反応管。
  3. リポソームの精製は、無料の色素からDY-676-COOHをカプセル化
    1. 10 mMトリス緩衝液pH 7.4（カラム長28センチメートル、直径0.8センチメートル）に浸しG25ビーズを用いたゲルクロマトグラフィーカラムを準備する。
    2. ゲル床の上に押し出された小胞体分散液の0.5ミリリットルを転送し、ゲルマトリックス内に試料の消耗をしましょう​​。
    3. 10mMトリス緩衝液（pH7.4）（ 図1A）を有するリポソームを溶出し、カラムから完全に遊離色素ドレンまでカラムを洗浄する。必要であれ場合は、収集し、製造業者の説明書に従って脱塩し、脱水によって遊離色素をリサイクルする。
    4. 超遠心により溶出リポソームを濃縮する（20万×gで、8℃で2時間）、その後、滅菌10mMトリス緩衝液の適切な容積でそれらを分散させる、7.4。
  4. カプセル化されたDY-676-COOH濃度の定量
    1. DY-676-COOH（0、82、124を溶解することにより検量線を作成し、10mMトリス緩衝液、0.1％トリトンX100を含有するpH7.4の247、494、988 nM）を有する。
    2. 小胞を破壊し、封入された染料を放出するように、1％トリトンX100を含有する100μlのトリス緩衝液中、室温で5分間リポソームを2μl（50ミリモル/ Lのストックの100 nmolの最終脂質）を溶解する。 0.1％の最終のTriton-X100濃度を10mMトリス緩衝液、pH7.4中の試料を希釈（v / v）の全量1mlを作る。重複してすべてのサンプルを準備します。
    3. 励起λ= 645 nmおよび放出λ= 700 nmで（無料DY-676-COOHおよびTriton-X100は、リポソームを処理したもの）すべてのサンプルの吸収および発光を測定します。確立し、封入された染料の濃度を決定するために、遊離色素の検量線を使用する。
  5. リポソーム特性評価
    1. 動的光散乱法によりリポソームのサイズとゼータ電位を決定します。交流の滅菌フィルター（0.2μm）を10 mMトリス緩衝液（pH7.4）とリポソームサンプルを希釈100から300μM（脂質）のoncentration。低容量の使い捨てキュベットに希釈した試料を移し、製造業者の説明書に従って、サンプルを測定する。
    2. 標準的なプロトコルに従ってリポソーム小胞のサイズ、完全性および均一性を実証するために、電子顕微鏡でリポソームを特徴付ける。

2.蛍光消光の検証と調製されたリポソームの活性化

  1. 蛍光消光及び活性化の物理化学的分析
    1. リップ-Qのための2つの1.5ミリリットルチューブ、無料のDY-676-COOHのための2のチューブを準備します。転送100ナノモルの全脂質対応するチューブに（カプセル化されたDY-676-COOHの138μg/ mlのを含む42ミリモル/ Lリップ-Q原液の2.38μL、）。リップ-Q（使用されるX 2.38μlのリップ-Q 138μgの/ 1,000μLから例の結果0.38μgの）の染料含有量に無料でDY-676-COOH相当を転送します。 1タブをインキュベート4℃での各プローブのeおよび-80℃で一晩（16時間）で第2のチューブを凍結する。
    2. 30℃に加熱ブロックを加熱する。砕いた氷で冷却ボックスを充填し、室温に10 mMトリス緩衝液（pH7.4）のアリコートを平衡化。
    3. 4℃からプローブを除去し、5分間、30℃で-80℃からプローブ（光から保護するためにアルミホイルで包まれた）、すぐに解凍し、室温で平衡化。 （また、光から保護するためにアルミホイルで包まれた）を室温にそれらを転送する前に1分間氷上で解凍したプローブを冷やす。
    4. 100μlの最終容量にプ​​ローブの各々に10mMトリス緩衝液（pH7.4）を加え、室温で10分間、すべてのプローブを平衡化する。
    5. ピペット80の低容量のガラスキュベットに各プローブμlの分光計400~900ナノメートルから各プローブの吸収を測定する。それらに対応するチューブにプローブを返します。
    6. 適切なガラスキュベットに各プローブの80μlのを転送674 nmで励起するプローブによる蛍光光度計での蛍光発光を測定し、694-800ナノメートルの蛍光を測定する。
  2. 細胞取り込みおよび蛍光活性化
    1. 標準条件（37℃、5％CO 2および95％加湿雰囲気）に応じて、それらの対応する培養培地中で以下の細胞株を取得し、培養する。ここで、U-118MG（必須ビタミンを含有するMEMおよび10％（体積/（ダルベッコ改変イーグル培地、10％（v / v）ウシ胎児血清を補充した）、ヒト膠芽腫細胞株をマウスマクロファージ細胞株J774A.1を使用v）のウシ胎児血清）およびヒト線維肉腫細胞株、HT-1080（5％FCSを含むRPMI）。
    2. コー​​トポリ-L-リジンとの8ウェルチャンバースライド（各ウェルに100μlの0.001％ポリ-L-リシンを追加し、10分間37℃でインキュベートする。吸引除去液とチャンバースライドは、少なくとも4用に乾燥させ無菌作業台上で、室温で時間。チャンバースライドをすすぐ3必要とされるまで、200μlのハンクス緩衝食塩水回、その後、4℃でパラフィン及びアルミ箔とストアでそれらを密封する。
    3. チャンバースライドが枯渇している間に必要とするまで、4℃でリポソームと染料溶液とストアをフィルター滅菌する。
    4. インビボでの NIR蛍光イメージングシステムにおける全身プローブ取り込み分析のために、3つの試験細胞株の各々について5小さな培養フラスコ（合計15フラスコ）を準備する。シード2×10 6 J774A.1、U-118MGおよび（5倍に）のそれぞれの培地を5 mlの培養フラスコ当たりのHT-1080細胞および16-24時間成長する。 、培養フラスコに平行なそれぞれのチャンバースライドの2ウェルに各細胞株（J774A.1およびHT-1080）または20,000細胞（U-118MG）の30,000細胞を播種し、16〜24時間、500μlの培養培地中で増殖。
    5. 翌日、細胞株につき2フラスコに、チャンバースライド上の各細胞株の1つのウェルにリップ-Qの100ナノモル（最終脂質量）を追加します。直ちに4℃、バックインキュベーターに第二のフラスコに細胞株あたり1フラスコを転送する。
      NOTE：チャンバースライド上の濃度作り、プローブの容量がフラスコに添加し、チャンバースライドが同じである10倍高い（5 mlを500μlの培養培地である）。顕微鏡的検出をフラスコからの細胞ペレットを結像さNIR蛍光イメージングシステムよりも感度が低いので、これが必要である。
    6. その後直ちに細胞株あたり1フラスコを転送する、細胞株当たり2フラスコ中の細胞へとチャンバースライド上の各細胞株の1つのウェルにリップ-Q染料含有量に相当する濃度でフリーDY-676-COOHを追加4℃（エネルギー枯渇）とバックインキュベーターにチャンバースライドと一緒に他のフラスコに。対応する条件で24時間、すべての細胞をインキュベートする。プローブなしのフラスコ中の細胞を未処理の対照として役立つ。
  3. NIRFイメージングと半定量分析
    1. 24時間のインキュベーション期間の後、ハンクスで細胞を2回洗浄することによってフラスコ中で細胞を採取、その後500μlのチューブ内で遠心分離（200×gで5分間）で、500μlのHBSS、ペレット中の細胞をこすり取る塩溶液（HBSS）をバッファリング。
    2. 励起（615から665 nm）を放出（> 700 nmのカット）のフィルタを使用して、NIRFイメージャと画像内の細胞ペレット（及びHBSS）でチューブを置きます。
    3. 自家蛍光を控除し、製造者の指示に従って、自家蛍光対ターゲットの強さを評価する。これは、測定値が互いの間で比較可能となるように、露光時間、カメラゲイン、ビニングおよびビット深度のためのスケーリング後のカウントレベルを表す平均信号として蛍光強度（スケーリングされたカウント/秒）の半定量的レベルを与える。
  4. 共焦点顕微鏡分析
    1. 24時間のインキュベーションの後、500μlのHBSSで2回洗浄することにより、チャンバースライド上で細胞を回収。
    2. CEを修正RTで30分間、3.7％（v / v）のホルムアルデヒドを含む200μlのHBSSとLLS。
    3. 固定が起こっている間、DNA染色マウントソリューションで、ヘキスト-33258 1:50に希釈する。
    4. 固定後、その後HBSSで細胞を2回洗浄したスライドガラスからチャンバーを分離する。チャンバースライドのウェルに対応する各スポット上のDNA染色を含む50μlのマウントソリューションを追加します。ガラスカバースリップで細胞をカバーし、室温で10分間（暗い）用の透明なマニキュアと空気乾燥でエッジをシールする。
    5. 適切な蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡上で画像セル。核（ヘキスト-33258：励起405nmで、放射420から480 nm）で対応するコンポーネントの可視化のための以下の励起および発光の設定を使用します。 NBD-DOP​​E（リポソーム脂質：励起488nmで、放射530 nm）を。 DY-676-COOH（NIR蛍光色素：励起633から645 nmの、放射650〜700ナノメートル）。
      注：いることを確認して蛍光顕微鏡Availableは、より高い630 nmより波長の励起および発光を可能にする適切なフィルターが装備されている。

3.リポソームベースの炎症のin vivo蛍光イメージングで

  1. 動物や材料の調製
    1. 食物および水を自由に標準条件下で約36 250gのハウスは、8-12週齢の雄性NMRIマウス。
    2. 実験の開始前7日間の組織自己蛍光を低減するために、すべてのマウスを低フェオフォルビド食を与える。
    3. 二十四時間後、各実験の開始前に、所望の領域にマウスを削る（ 例えば、後肢浮腫のイメージングを使用する場合に、裏面全体面積）。
    4. 動物の重量を測定し、体重kg当たり10マイクロモル（脂質濃度）で（リップ-Qとリップ-DQマウスあたりに噴射されるプローブの量を計算し、無料のDY-676-COOH使用リップ-Qのコンテンツを染色する（等価） 。
    5. 画像の動物細胞ペレットを使用したのと同じ設定で全身NIR蛍光イメージャ。この測定は、動物の自己蛍光を提供しています。
    6. 1mlの等張生理食塩水を10 mgのザイモサンAを溶解し、4℃で一晩保存する。
  2. 炎症のおよびin vivo NIRFイメージングにおける誘導
    1. 次の解決策を含むマウスあたり3注射器を準備します。 50μlのザイモサン溶液（10mg / ml）と50μlの等張食塩水で第2のシリンジを有する1つのシリンジを充填する。対照動物のためのリップ-Qとリップ-DQ（10マイクロモル/ kgの体重（脂質））（LIP-Qの​​ように濃度）試験動物とフリーDY-676-COOHのために指定されていることにより、プローブを、第3注射器を埋める。プローブは、150μlの最終容量に無菌のHBSSで希釈することを確認してください。
    2. （乾燥を避けるため、彼らは深く眠っているまで2％のイソフルランで動物を麻酔し、足に触れたときに反応しないように動物の眼にアイクリームを適用しますこれは）約2分かかります。
    3. （まだ麻酔下）暖かいマットの上にマウスを置き、右後肢にザイモサン - 溶液を皮下と左後脚に生理食塩水を注入する。 （tは0時間を=のように）注入/測定の記録時間をすぐに静脈内にプローブを注入して、その後の画像動物。画像キューブなどの結果の画像を保存し、他のすべての動物とそれぞれのプローブのための上記の手順を繰り返します。
    4. 画像動物測定室の段階（たとえば、下に暖かいマットを置くことによって）、ウォームであることを確認し、10時間後に注入するための2時間、次いで、24時間後の注射、低体温を回避するためである。各測定後、餌と水を自由にケージに動物を配置し、温帯動物チャンバー内にケージを置く。動物はもはや触れなくなるまで反応し、その後、5〜10分間、二酸化炭素で安楽死させる2％イソフルランで麻酔第によって動物を安楽死させる動物が完全に呼吸が停止し、死後硬直が発生していることを確認してください。
    5. 標準のオンライン評価することが可能なプロトコル（http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/）と画像の臓器に応じてマウスを解剖。
    6. 最初の自己蛍光のために関心領域を割り当て、その後、動物の全体的な蛍光（非混​​合）を控除することにより、製造業者の指示に従って測定した結果を評価する（生理食塩水後肢左）および炎症領域（ザイモサンAと右後肢）の蛍光を標的とする。

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結果

そのようなNIRF染料DY676-COOHのような蛍光色素、高濃度のカプセル化は、リポソームの水性内部にここで使用される蛍光消光の高いレベルをもたらす。蛍光消光、高濃度で、多くのフルオロフォアで見られる現象は、標的領域の高感度で信頼性の高い検出が要求されるインビボイメージング用途のいくつかで利用することができる。リポソームの使用はまた、in vivoでの適用のために不可欠である染料の保護を提供する。リポソームの完全な特徴付けが必要であり、そのようなリポソームのカプセル化された染料、安定性およびサイズのレベルなどの要因、 インビトロでもインビボ画像化の目的のために適用可能でカプセル化された色素の蛍光消光及び活性を含む。遊離色素の比較、DY-676-COOH及び急冷リポソーム（リップ-Q）、並びに非常に低いコンセント非クエンチリポソーム（リップのdQ）カプセル化された染料の比は、特にin vivoでの特徴付けのためにきわめて重要である。

押出前に、連続する凍結融...

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ディスカッション

リポソームはまた、蛍光色素のための送達システムとして機能することができるので、それらは、標的疾患の画像化を可能にする。このようなここで使用NIRF染料、DY676-COOHのような蛍光色素、高濃度の封入は、封入された色素の蛍光消光の高いレベルをもたらす。蛍光消光、高濃度で、多くのフルオロフォアで見られる現象は、対象領域の高感度で信頼性の高い検出が要求されるインビボイメージング用途のいくつかで利用することができる。リポソームの使用はまた、in vivoでの適用のために不可欠である染料の保護を提供する。

膜水和及び押出技術は、必要に応じて、異なるサイズ範囲を有するリポソームの成功した製造を可能に広く用いられている方法であり、そのような異なる物質25の多数のカプセル化などの修飾を可能にする。従って、リップの調製に適しているosomes画像化目的のためにNIR蛍光色素DY-676-COOHでカプセル。この方法は、染料の急冷濃度の範囲内である600から840μM膀胱内色素濃度、を有するリポソームが得られます。自然発生...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、ドイツ学術振興助成 HI-698 / 10-1とRU-1652 / 1-1によってサポートされていました。私たちは、彼らの親切なサポートのための優れた技術支援と会社DYOMICS社、イエナのためのドリーン·メイに感謝。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リポソームの調製のための材料と機器
卵ホスパチジルコリンAvanti Polar Lipids840051Pクロロホルムに溶解し、ガラスバイアル(214 mg / ml)コレステロールに保存
SigmaC8667クロロホルムに溶解し、ガラスバイアル(134 mg / ml)
に保存1,2-ジステアロイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-<>N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)Avanti Polar Lipids880120Pクロロホルムに溶解し、ガラスバイアル(122 mg / ml)
1,2-ジオレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(7-ニトロ-2-1、3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)(アンモニウム塩)Avanti Polar Lipids810145Pクロロホルムに溶解し、ガラスバイアル(2 mg / ml)
ザルトリウスMC1(d = 0.01 mg)ザルトリウスAGリサーチRC 210 P、リン脂質
RotavaporBüの計量に使用されます。chi Labortechnik AGR-114、リン脂質フィルムの
水和に使用されます ウォーターバスBüchi Labortechnik AGR-481、リン脂質フィルム真空
コントローラーBüの水和に使用されます。chi Labortechnik AGB-720、リン脂質フィルム
VacoboxBüの水和に使用されます。chi Labortechnik AGB-177リン脂質フィルムの水和に使用
循環チラーLAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230リン脂質フィルムの水和に使用
DY-676-COOHDyomics GmbH676-0010 mM Tris に溶解し、ストックを -20°C で保存します。C
トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタンApplichemA1086緩衝液 10 mM, pH 7.4
トリクロルメタンCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2リポソーム調製に使用
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 Hリポソーム調製に使用
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)Scientific Industries Inc.リポソーム調製に使用されるSI-0256
ファデックスG25培地 リポソームの精製に使用されるGEヘルスケアヨーロッパGmbH17-0033-01
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002ポソームを破壊するために使用されます 色素定量
のために LiposoFast-BasicAvestin Inc.リポソームの押出しに使用
ポリカーボネート製フィルター膜、100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)VWRLiposoFast-Basic
Fluostar OptimaBMG Labtech染料定量に使用
Zetasizer Nano ZSMalvernポソームサイズとゼータ電位の測定に使用
超遠心分離機 サンプルの濃縮に使用されるBeckmann Coulter GmbHXL 80
RotorBeckmann Coulter GmbHSW 55 TIの
リポソームの評価のための材料と機器
の
Zymosan-Aの希釈に使用されるFresenius GmbHPZN-2159621
動物の麻酔に使用されるIsotec4
IsofluraneActavis GmbH PZN-7253744麻酔
サーモマット プロ 20 Wラッキー レプタイル61202-HTP-20麻酔中に動物を暖かく保つために使用されます
Omnican-F (1 ml 注射) ブラウンPZN-3115465プローブの皮下および静脈内適用に使用される
パンテノールアイクリームイエナファームPZN-3524531麻酔中の動物の目の乾燥を防ぐために使用
ハンクス緩衝生理食塩水PAAラボラトリーズ/バイオクロムAGL2045mg 2 +、Ca2 +、フェノールレッド。プローブの希釈および細胞の洗浄のために
、BDバイオサイエンス354108細胞培養に使用され、その後顕微鏡検査が行われます 
細胞培養フラスコGreiner BioOne
細胞培養培地Gibco (life technologies GmbH)
ウシ胎児血清 Invitrogen
ポリ-L-リジン溶液 (0.01%, 50 ml)SigmaP4832細胞培養チャンバースライドのコーティングに使用
Mountant PermafluorThermoScientific S21022-3顕微鏡用埋込液
Hoechst-33258AppliChem顕微鏡用DNA染色剤
Hera-Safeヘレウスインスツルメンツ細胞培養用無菌作業台
ラ用 ヘレウスインスツルメンツ細胞培養用インキュベーター
LSM510-Meta共焦点顕微鏡
Maestro-TM in vivo蛍光イメージングシステムCRi, Woburn小動物の全身蛍光イメージングに使用
分光光度計 (Ultrospec 4300 pro UV)GE Healthcare吸収測定に使用
分光蛍光光度計 (Jasco FP-6200)Jasco発光
Animals
NMRIマウス(8-12週齢、雄)Elevage Janvier(フランスの炎症試験に使用
ははははセリ リサンプル濃縮に使用される 炎症誘導に使用されるSaccharomyces cereviciae Sigma Z4250-250MGのリポソームおよび光学イメージングZymosan-A Isoflurane Actavis GmbH ヘ細胞用ゼイス 蛍光の測定に使用)

参考文献

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