で微小管ダイナミクスを測定するためにplusTipTrackerソフトウェアを使用したアフリカツメガエル成長円錐

サマリー

MATLABベースのオープンソースソフトウェアパッケージ、plusTipTrackerは、微小管動態を定量するために蛍光標識+先端の画像シリーズを分析するために使用することができる。

要約

微小管（MT）プラスエンド追跡タンパク質（+ヒントは）MTの成長プラス端に局在し、MTのダイナミクス^1,2を調節する。最もよく知られており、MT動態を分析するため+広く利用されるチップの一つは、全ての成長MTプラス端を結合するエンドの結合タンパク質EB1、であり、従って、MTの重合¹のマーカーである。成長円錐内のEB1の挙動の多くの研究は、個別のMT ^1-3を分析するために時間がかかり、バイアスされたコンピュータ支援、手追跡の方法を使用している。私たちのアプローチは、培養された胚の成長円錐⁵におけるタグ付きEB1の高解像度、ライブ画像の取得以下、plusTipTracker ^4、ソフトウェアパッケージを使用して、MTダイナミクスのグローバルパラメータを定量化することである。このソフトウェアは、蛍光標識された+チップの映画のための自動検出、追跡、可視化、および分析を組み合わせた、MATLABベースの、オープンソースの、ユーザーフレンドリーなパッケージです。ここでは、plusTipTを使用するためのプロトコルを提示する培養されたアフリカツメガエルの成長円錐での蛍光標識+ヒント彗星の分析のためのラッカー。しかし、このソフトウェアは、さまざまな細胞タイプ^6-8のMT動態を特徴付けるために使用することができる。

概要

この方法の目的は、生きた成長円錐微小管（MT）プラスエンド追跡タンパク質（+ TIP）ダイナミクスに関する定量的情報を得ることである。 MT +ヒントはMTが^9,10のプラス両端に局在するタンパク質の一群である。彼らは、重合、大災害、救助のレートを含むMT動的不安定¹¹のパラメータを調整するためにさまざまな機能を実行します。 MTのダイナミクスを分析するための1つのよく使用される方法は、MT ^1,12プラス終わる成長に特異的に結合する+ヒントのEB1の行動を追跡することである。 EB1は^13,14をプラス終了し、最近では、MTの成長と破局周波数^15,16の両方を促進し、MT成熟因子¹⁵として確立されている。成長しているMTにいくつかの他のタンパク質を動員することが知られている

成長円錐内のMTダイナミクスの多くの研究がEB1のlocalizatiように時間^1-3オーバーEB1-GFPのダイナミクスの変化を測定するために手の追跡方法を利用しているMT上にプラスの端部は、MTの重合のためのマーカーとして使用することができる。 MTの成長のためのプロキシとしてEB1-GFP彗星を調べるための主な利点は、MT動態でも有意なMTの重複領域で測定することができることである。ハンドトラッキングEB1-GFP彗星の方法は、MTに有用な洞察を提供してきたが^{1-3ビヘイビア} 、それは時間がかかり、バイアスすることができる。さらに、異常な成長円錐の行動はMTの小さなサブセットのみを分析し、可能性が高い細胞骨格のダイナミクスの微小シフトの結果であるように（通常は必要に応じて手でトラッキング）重要な情報を見逃すことがあります。

そこで、高解像度、培養された胚の成長円錐⁵でタグ付けされたEB1のライブ画像を取得した後、ソフトウェアパッケージ、plusTipTracker ^4を使用してグローバルMT動態パラメータを測定する。 Danuser研究室で開発されたこのソフトウェアは、さまざまな細胞型^6-8のMT動態を特徴付けるいくつかの研究で使用されている。それは、私たちのオープンソースであるERに優しい、蛍光標識+チップの映画のための自動検出、追跡、可視化、分析が含まれ、MATLABベースのパッケージ。 MT力学の特定のパラメータは、このソフトウェアによって計算されたの長いリストが（詳細は文献4を参照）、成長円錐のMTダイナミクスの解析のために、最も有用なパラメータは（ミクロン/分で）MT成長軌道速度である、成長軌道（秒単位）、寿命、および（ミクロン単位）成長軌道の長さ。ソフトウェアは、（「ソフトウェア」の下）DanuserラボのWebサイトから直接ダウンロードすることができます。 Danuser Labは現在、2.0のu-トラックと呼ば​​れるソフトウェアパッケージに組み込まれている+ TIPのトラッキング分析のための新しいインターフェースをサポートしていますが、オリジナルの、スタンドアローンのソフトウェアが利用可能なままになります。二つのプログラムの間に根本的なアルゴリズムは、インターフェースや分析出力の唯一の違いは、（少なくとも2014年現在）と同じである。少しMATLABおよび/または計算分析experiと初心者ユーザーのためにレンスは、plusTipTrackerは、自動化された統計的パラメータ出力など、よりユーザーフレンドリーな機能を備えています。

ここでは、培養されたアフリカツメガエルの成長円錐にEB1-GFPダイナミクスの画像を分析するための手順を説明します。このプロトコルは、MTのダイナミクス^17を検査する最近の論文で利用した。 EB1-GFPを発現する培養成長円錐に関する詳細手順については、ロウリーら 2012 ^5をも参照してください。この論文は、主に成長円錐におけるEB1-GFP動態を調べることに焦点を当てているが、同一のプロトコルは、他の細胞型¹⁷のために使用することができる。全ての細胞型では、フレーム間の時間間隔は、最適+ヒント追跡のための0.5〜2秒の間であるべきである。フレーム間の最大4秒の時間間隔が可能であるが、これは、追加の追跡誤差のインターバル時間の結果を増加させた。

プロトコル

このプロトコルやビデオをより詳細⁴にソフトウェアパッケージを記述する元の紙だけでなく、DanuserラボのWebサイトでソフトウェアのダウンロードが付属していますテクニカルレポートにコンパニオンとして機能するように意図されている。読者は、ソフトウェアを使用してに関する追加の質問がある場合は、慎重にこれらの文書をレビューすることをお勧めします。

画像解析の前に1。

1. TIFF（タグ付き画像ファイル形式）の画像ファイルのシーケンスに各タイムラプスムービーを変換します。指定された映画、独自のイメージシーケンスを作成するための最初の収穫各成長円錐/セル内の複数の成長円錐/細胞が存在する場合。
   注：これは必要ではなく、個別の関心領域（ROI）をplusTipTracker内で選択することができる。しかし、より小さな画像の寸法を使用すると、演算処理の速度が向上しますので、画像が大幅に空白スペースがある場合は、この手順をお勧めします。
2. 自身の中で、各TIFFシリーズを保存MATLABは、アクセス権に設定されているパス内の「画像」というフォルダは、（ "画像"は大文字と小文字が区別されることに注意してください）​​。新しいパスを追加するには、「現在のフォルダ」ウィンドウ内の該当するファイルのディレクトリに移動して、ディレクトリのアイコンを右クリックし、「パスに追加 - 選択したフォルダやサブフォルダ」を選択してください。これは、plusTipTrackerソフトウェアフォルダが同様に、パスに追加されることが重要である。

2 plusTipGetTracks

注：画像解析の最初のステップは、EB1-GFP彗星を検出するトラックに彗星をリンクし、微小管動力学のパラメーターを決定することである。これは、コマンド^{「plusTipGetTracks」4}で得られる。

1. 分析、オープンMATLABアプリケーションを開始し、コマンドウィンドウに「plusTipGetTracks」を入力します。これは、新しいダイアログボックスが表示されます。
2. 「セットアップ新規プロジェクト」をクリックして、1（またはMORを選択e）の適切な「画像」フォルダ（または「画像」フォルダ）を含むディレクトリを選択することで、以前のTIFF画像シリーズ。このステップが完了すると、ファイル·ディレクトリ（roi_1）は、将来のデータファイルが含まれています（ "画像"を保持している同じフォルダに）作成されます。注：「設定新規プロジェクト」ステップは、別のセッションの間に、事前に完了させることができる。
3. 「最後の点を右クリックし、多角形を選択して、「マスクを作成」をクリックし、「新しいウィンドウが表示されます。 「OK」をクリックします。選択した画像シリーズの最初の画像は表示されます。クリックして、成長円錐の全体を包含するポリゴンを作成するためにマウスを使用しています。ダブルポリゴンを閉じるために、マウスをクリックします。
4. ポリゴンが閉じられた後は、ダイアログボックスが表示されます： "あなたは別のROIを選択しますか？」イメージは、「はい」を選択し、分析するための別の成長円錐を持っている場合。そうでない場合の「いいえ」を選ぶ。
5. 直ちに分析されたプロジェクトを選択します。 「プロジェクトの選択」をクリックし、分析するために、フォルダ（roi_X）を選択します。
6. listSelectGUI画面が表示されます。画面の左側からプロジェクトを選択して、画面の右側にそれらを上に移動。 「OK」をクリックします。プロジェクトリストを保存して「保存」をクリックする場所を選択してください。
7. 「検出」、「トラッキング」を選択し、「後処理」。これらの選択が行われた後は、ダイアログボックスの右側には、設定可能になります。各オプションを設定します。
   1. これらのパラメータは、MTのトラックに検出された彗星をリンクするために使用される。追跡のためのこれらの制御パラメータを選択するための詳細は、ページソフトウェアパッケージのダウンロードに付随する技術報告書をPDFの9-10に含まれています。問題が発生した場合は、この報告書を注意深くお読みください。 がxenopにおけるEB1-GFP彗星を追跡する目的のために私たちは、成長円錐は、使用ツメガエル以下トラッキングセッティング：検索半径範囲（ピクセル）5-12、最小サブトラック長（フレーム）3;最大ギャップ長（フレーム）8;マックスファクター収縮0.8、フォワード最大角度50、後方最大角度10、ゆらぎ半径2.5。これらの設定は、 図1に示されている。
   
   注：マックス収縮ファクターは「後方ギャップ」として、検出された「逆方向のギャップ」の数を減らすために設定されているトラックの連携における混雑した状況や可能性の誤差を考えると、成長円錐のコンテキストで分析するのに有用ではない。成長円錐のMTは、成長及び収縮に加えて、小さな頻繁な転座を示し、これらの制御設定値を増加させると、連結工程の間に、この増加した運動を可能にするように加えて、両方の最大順方向角度と同様に変動半径は、比較的高く設定されている。
   1. 所望の特定の画像取得設定に応じ後処理の設定を入力してください。
8. 設定が設定されたら、「スタート」をクリックしてください。ソフトウェアは、選択された方の設定が実行されます。これにより、選択したプロジェクトとその大きさの数に応じて、数分から数時間かかることがあります。コマンドウィンドウは、各関数の推定残り時間が表示されます。 plusTipGetTracksステップが完了すると、コマンドウィンドウは、「完了！」と表示されます
   注：MT力学の特定のパラメータの長いリストになりました（詳細は文献4参照）、このソフトウェアによって計算されているが、成長円錐のMTダイナミクスの解析のために、検査するための最も有用なパラメータは、ミクロン単位でのMT成長軌道速度（ある/分：秒）、成長軌道寿命（）、およびミクロン単位で成長軌道の長さ（）。

3 plusTipSeeTracks

注：ここで微小管トラックが定義されていることを、関数「plustipSeeTracksは「トラックの視覚⁴のために使用される。この関数空間的なMTダイナミクスマップとスピードムービーなど、視覚化のために複数の出力を提供しますが、ここでは、焦点は、もっぱら成長円錐の画像に重畳されたMTトラックを表示するには、「トラックのビデオ」を使用して上にあることができます。 plusTipGetTracks一度に複数のムービーを分析することができますが、plusTipSeeTracksは一度に一つの映画を分析することができます。

1. コマンドウィンドウに「plusTipSeeTracks」と入力します。
2. ダイアログボックスがロードされた後、「プロジェクトの選択」をクリックしてください。視覚化し、「フォルダを選択」をクリックして、プロジェクトを含む親ディレクトリを選択します。新しいウィンドウが表示されます：「あなたが視覚化するプロジェクトを選択」。視覚化し、「OK」をクリックするファイルを選択してください。
3. 次に、「セレクト保存ROI」をクリックしてください。前のステップで選択したものと同じroi_Xフォルダに移動し、「roiYX」という名前のファイルを選択します。
4. wを指定する場合は、「出力ディレクトリの選択」をクリックしますここでMATLABは、トラックの可視化ファイルを保存します。注：私たちは残りのデータを含む同じフォルダを使用することをお勧めします。
5. 「トラックのムービーを作る」を選択し、画面は+ヒント彗星から算出したトラックplusTipGetTracksのすべてを表示する表示されます。このステップは、ファイル "allTracks_X_X_X」で、ムービー形式で追跡時系列を保存します。 AVIなどの動画を保存するためのオプションがそれ以外の場合は、デフォルトの形式はQuicktime.movファイルとしてある、あります。

4。plusTipGroupAnalysis

注：この最後の機能は、分析及びそれらのMTトラックパラメータの比較のために映画のグループを作成するために使用される。

1. コマンドウィンドウに「plusTipGroupAnalysis」と入力します。手動で比較するためにグループを選択するには、最初の「階層から自動グループ」を選択解除。次に、「プロジェクトの選択」をクリックしてください。すべてroi_Xフォルダを含む親ディレクトリに移動します分析する。
2. listSelectGUI画面が表示されます。画面の左側からグループに含めると、画面の右側にそれらを上に移動するためのすべてのプロジェクトを選択します。 「OK」をクリックします。プロジェクトリストを保存して「保存」をクリックする場所を選択してください。
3. ウィンドウが表示されます：「リストから最初のグループを選択してください」。 「OK」をクリックします。 listSelectGUIウィンドウが再び表示されます。今回は、一緒にプールされるべき第一のグループに対応したファイルのみを選択します。 「OK」をクリックします。
4. 次に、グループ名を入力し、「OK」をクリックしてください。ウィンドウが表示されます：「別のグループを選択します？」は、それに応じて応答し、グループを選択し続ける。ウィンドウが表示されます：「あなたのグループのリストを保存する場所を選択」。場所に移動し、「保存」をクリックしてください。
5. 出力フォルダがされ​​る場所を選択するために、「出力ディレクトリの選択」をクリックします格納された。
6. 実施する基分析の種類を選択 - MTトラックを行うべき各グループまたは細胞分析ごとにプールすべきかどうか。推奨される統計的検定は、すでに指定されている。分析におけるすべてのトラックを含めるには、選択解除」ムービーの最初/最後にトラックを削除 "。それ以外の場合は、選択したこのボックスを持つことは、ムービーが開始または終了などのプロセス内にあるすべてのMT成長トラックを削除します。
7. グループの分析の選択が行われた後、「グループの比較」を選択します。

結果

ここで説明するように、このソフトウェアを使用すると、生きた細胞内+ TIP動態を定量化、情報のいくつかのファイルを提供します。

関数plusTipGetTracks（ 図1に示される例の設定を使用して）トラックを識別し、その後+ヒント·トラックに関するパラメータを提供する。ソフトウェアが取得した情報を表示するには、ステップ2.2で作成されたroi_Xディレクトリに移動します。 「偉業」フォルダが検出された彗星を示す一連の画像である「overlayImages "を、含まれています。彗星検出の精度を示すことができる画像解析ソフトウェアを使用してこれらの画像を調べる。 「メタ」フォルダには、「projData」ファイルだけでなく、「統計」ファイルを含む+ヒント彗星の統計に関する詳細な情報が含まれています。 「統計」ファイルを表示するには、スプレッドシートアプリケーションの開いたワークシートにドラッグします。このファイルには、計算が含まれています各ムービー（ 図2）dの微小管のパラメータ。上述したように、MTダイナミクス...

ディスカッション

PlusTipTrackerを迅速かつ自動的に、細胞または成長円錐において、実質的にすべての可視EB1-GFP彗星を検出するトラックに彗星をリンクし、MTパラメータを計算する簡単なグラフィカルユーザインタフェースを提供する。その他の刊行物は、（例えば、マルクスら成長円錐¹⁸内のタグ付けされたEB1ダイナミクスのもまた利用定量分析）ソフトウェア同様のタイプの設計を報告している。しかし、このソフトウェアは、それが自由に細胞生物学的社会にとって有用なオープンソースの、ターンキーソフトウェアの設計を専門とDanuserラボのウェブサイトからダウンロードされるように、アクセスの容易さでユニークであるように思われる。 MATLABへのアクセスが必要であるが、一方がソフトウェアを利用するためにこのコンピュータアプリケーションに完全に精通している必要はない。しかし、使いやすさのために対処する必要があるいくつかのポイントがあります。

SOFを使用した場合に発生する最も一般的な問題の一つ、まず初めてtware及びコンピュータアプリケーションは、ファイルパスに...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
plusTipTrackerソフトウェア	Danuser Lab	http://lccb.hms.harvard.edu/software.html	このソフトウェアは、将来、他のウェブサイトによってホストされる可能性があります。 掲載されているサイトが存在しない場合は、ウェブ検索エンジンで「Danuser Lab Software」と検索して探してみてください。
MATLAB ソフトウェア	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/