ここでは、拒絶反応の免疫学を研究するためのプロトコルを提示します。手術モデルは、短い手術時間と簡潔な技術のレポートを提示しました。ドナーとレシピエントの系統の組み合わせによっては、移植された腎臓は、間質性線維症と尿細管萎縮によって定義される急性細胞拒絶反応または慢性同種移植片損傷を発症する可能性があります。
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この記事について
サマリー
要約
移植された腎臓の拒絶反応は、依然として罹患率と死亡率の主要な原因です。腎移植のマウスモデルは、ヒト腎移植で発生する技術的プロセスと病理学的プロセスの両方を密接に再現しています。腎臓以外の臓器における同種拒絶反応のマウスモデルが存在し、技術的にはより実現可能ですが、異なる臓器が異なる拒絶モードとダイナミクスを誘発するという証拠があります。たとえば、心臓と腎臓の同種移植片における拒絶反応の時間経過は、特定の系統の組み合わせで大きく異なります。このモデルは、技術的な課題にもかかわらず、多くの理由で魅力的なツールです。近交系マウス系統のハプロタイプは十分に特徴付けられているため、MHCクラスIおよびII遺伝子座に移植することにより、ドナーとレシピエントの組み合わせを選択して急性同種移植拒絶反応をモデル化することができます。逆に、類似のハプロタイプを持つ株間で移植することにより、同種移植腎臓が間質性線維症および尿細管萎縮を発症した場合に慢性的なプロセスを誘発することができる。手術時間を短縮し、手術のしやすさを向上させるために手術技術を変更しましたが、モデルを忠実に再現するためには、まだ学習曲線を克服する必要があります。この研究は、外科的処置の要点を提供し、この技術を確立するプロセスを支援します。
概要
腎不全の治療のために成功した腎移植は、まずそれ以来、人生2の長さと品質の両方で改善を提供し、世界中の末期腎不全患者のための革新的な治療法となっており、1一卵性双生児の間で1955年に記載された。しかし長期的な移植片の生存は、慢性同種移植片損傷3をもたらし病理学的プロセスの多数によって妨げられてきた。
ヒトでの移植された腎臓の拒絶はimmunosupporessiveレジメンの大幅な改善にもかかわらず、罹患率の主要な原因である。腎移植のマウスモデルを開発の目的は密接にヒト腎移植4で見つかったプロセスおよび病理を複製することである。 Skoskiewicz らは、最初に1973年5において腎移植のマウスモデルを説明した。高度な顕微スキルが必要とされているが、それは価値のあるtといくつかの理由からOOL：マウスゲノムは、十分に特徴付けられており、実験方法とマウスの研究のために利用可能な技術の多種多様があります。
腎移植のマウスモデルを使用して多くのグループがしかし、実験4の期間中、 その場に放置されている他の研究でレシピエントマウスのネイティブ腎臓の私達の記載された方法論1で、生命維持器官などの移植された腎臓を使用している。利点は、マウスが、それによって、マウスへの罹患率と第二の手順による死亡のリスクを低減シングル麻酔して、操作を受けるということです。さらにマウスが緩やかな腎不全の悪影響を受けない。
同種異系拒絶のモデルは、心臓、皮膚などの他の臓器に存在するが、これらは常に腎移植とは直接関係ありません。これらのモデルは、異なるモードとdyを誘発するという証拠がある拒絶反応のナミックスは、例えば、心臓同種移植、腎同種移植における拒絶反応の時間的経過は、特定の菌株の組み合わせ6で大幅に異なっている。私たちは、非トランスジェニックFVB / NJマウスにBALB / c系ドナーにおいて急性腎同種移植片拒絶反応パターンを記載して、このモデルは、T細胞およびマクロファージ7の蓄積による細胞媒介性傷害を示した。代替的に、私たちはまた、間質性線維症および尿細管萎縮を示し、慢性の同種移植片損傷のモデルを記載したこれらのマウスは、単一のMHCクラスII遺伝子座のミスによって特徴付けられるように、これは、C57BL / 6レシピエントにC57BL / 6 BM12ドナーからの腎臓移植から生じる-match 8。
移植の複数の態様は、急性拒絶反応、細胞性および体液性拒絶反応、虚血再灌流障害、および新規治療薬を試用を含む腎移植のマウスモデルを用いて研究されている。 私たちは、外科トンを変更した運転時間を短縮し、手術の容易性を向上させるechnique。特に、私たちは、同時ドナーとレシピエントの準備および連続大動脈パッチ吻合を利用することによって単純化された血管吻合技術を記載している。このビデオと原稿が、この技術の確立を支援するために重要なポイントを提供します。
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プロトコル
適切な国や地方の機関倫理、動物実験を行う前になされるべきである。受信者の外科医は2.1 2.8に出演しながら、具体的に、英国で以下の実験は、ドナー外科医が行うべき2 microsurgeonsが同時に動作するために利用可能である動物（科学的手続）法1986の下で実施された、1.1から1.16、その後3.1から3.5のステップ。一人のオペレータのためのステップを順次追跡することができる。
1ドナーの準備
注：ここで紹介する手順は、ドナーC57BL / 6 BM12と受信者の20グラムよりも大きい体重を8から16週齢歳のC57BL / 6雄マウス用です。しかし、この手順は、再現性のマウス系統の多様で行うことができる。代表的な結果のセクションに示したデータは、C57BL / 6、C57BL / 6 BM12及びBALB / cマウスから得た。
- 行動手順を使う可能な限り無菌の動作領域を維持するための努力とgの無菌手術器具や消耗品（オートクレーブ処理）、。 2外科医が利用可能な場合に、受信者の準備と同時に、ドナーの準備を行います。
- メデトミジン（0.5ミリグラム/ kg）および塩酸ケタミン（/ kgを200 mg）を腹腔内注射（31G針）でマウスを麻酔。全体の手順のために十分な時間を提供する4時間維持される麻酔薬平面におけるこの結果は、実行される。補足麻酔は必要ありません。
- マウスは（つま先のピンチへの応答）を麻酔していないことを確認してください。
- マウスの腹部を剃ると粘着テープを持つ任意の抜け毛を取り除く。
- 無菌ドレープ加熱されたマットの上に仰向けにマウスを置き、ゆるく無菌マスキングテープで手足を固定化する。
- 熱傷のための手順全体を通して、マウスを監視します。可能であれば、非電気の熱源を使用しています。
- 眼の潤滑剤とSAを適用します希薄ヨウ素溶液と腹壁をnitize。
- 腹膜腔に入り、3センチメートルゴシック腹部開創を挿入するために腹部正中切開を行います。
- しっとり腸や手術領域を維持し、内臓の不必要な乾燥を避けるために温め、生理食塩水を適用します。
- 無菌ドレープでマウスを覆い、大動脈、大静脈と左腎臓を露出させるために、オペレータの左（マウスの右）に腸を動かす。
- 胃にラチェット鉗子を適用し、完全に主要な血管や左腎臓を露出するように上方に引っ張る。そのような肝葉、精嚢、および腸のように、離れて手術領域からの組織を後退させる腹部に無菌の綿棒（2mm×2mmと）を減衰させる梱包してください。
- 周囲の外膜、脂肪とぶっきらぼうに先端の細いピンセットを用いて結合組織を切開することにより腹腔内左副腎から左腎臓を分離します。 NEエリア間鉗子の閉じた先端を置きますedは分離され、ゆっくりと鉗子先端がスペースを解剖するために開くことを可能する。
- 結紮した後、9 / Oナイロンで左副腎静脈と左性腺静脈を分割することにより左腎静脈を分離します。腎静脈に近い縫合糸を配置します。
- ライゲーションおよび縫合糸を残して膀胱に近い7 / O絹縫合糸で尿管を分割するには、長い終了します。腎臓を採取し、尿管吻合のために必要な時にこれらの長い縫合糸端部が使用される。
- 動員し、完全に腎動脈と静脈に大動脈と大静脈上方および下方を分析するには、ぶっきらぼうに血管の正面と側面からリンパ管や脂肪を切開する先端の細い鉗子を使用しています。
- 大動脈と大静脈の間の組織面を見つけて、ゆっくりと鉗子を広げた。ゆっくりと、最小限の外傷で組織を広げるために細かい傾いて鉗子の先端を開きます。
- 角度の付いた罰金を渡すことで、腎動脈に上位および下位大動脈周囲の緩い7 / Oシルクネクタイ血管の前後を通して縫合糸を引くの周り先端鉗子。これらの縫合糸はウィスコンシン大学液の逆行性灌流を可能にするために、腎臓の取得の前に強化される。
2受信者の準備
ドナーの準備のフォローあたりとしては1.2〜1.8を繰り返します。
- 大動脈、大静脈を露出させるために、オペレータの右（マウスの左）に腸を移動します。滅菌生理食塩水に浸した綿棒で腸をカバー。
- 右腎動脈を連結することにより、右腎摘出術を行い、7/0絹縫合糸と一緒に静脈、その後分割します。
- 7 / O絹縫合および除算と右尿管を連結。
- 動員し、ステップ1.14と1.15で説明したように、完全に腎動脈と静脈に劣る大動脈と大静脈を解剖。大動脈と大静脈間の完全な解剖を確認してください。大静脈とaortの前方に動作する内部精巣動脈を保つように注意してくださいリンパ管の束と一緒に。
- 、大静脈と静脈から脊椎に後腹膜で実行されている腰椎の血管を識別し、連続9 / O絹糸で結紮、血管を分割する必要はありません。
- 血管吻合のための間にスペースを微小血管クランプを配置するために十分なスペースを特定します。
- 背側陰茎静脈を介して静脈内ヘパリン（5単位）を管理します。
3ドナー腎臓検索
動脈循環から腎臓を分離するために劣ると優れた大動脈の周囲に配置された7 / Oシルクネクタイを締めます。
- 大動脈に針（31G）とウィスコンシン大学溶液0.5ml - 逆行冷たい0.2を注入。
- 縫合糸内の大動脈を分割し、腎臓と大動脈の長さの腎動脈を除去するために大静脈との接合部で腎静脈を分割。大動脈から生じる腰椎血管を分割し、それらが存在する場合、wのithoutライゲーション。
- 培養皿中の滅菌綿棒で冷生理食塩水で腎臓を置きます。
- 頸椎脱臼によってドナーマウスを安楽死させる。
4。腎臓移植 - 腎臓の準備
- 腎動脈の向かい縦方向に直接大動脈壁を分割することにより、大動脈パッチを作成します。動脈吻合を行う際にライゲートまたは回避する必要があるパッチ内の任意の血管の内腔を特定します。
- 下方上方腎静脈内腔の外側から内側に10 / O縫合糸を配置し、第2の別の縫合糸。副腎静脈および性腺静脈を分割するために使用される縫合糸は、容器を方向付けするために使用することができる。
- 受信者の右脇腹（ 図1.1）に腎臓を置き、血管吻合は綿棒や他の楽器に絡めなるの縫合することなく完了することができることを確認するために、縫合糸が十分に配置されていることを確認してください。
5。腎臓Transplanテーション - 血管吻合
最初に下方その後上方大静脈と大動脈を取り囲む微小血管クランプを適用します。
- 大静脈の前壁を穿刺することによって針（31G）でventomyを行います。 0.9％NaClを約50μLを注入して大静脈から血液をフラッシュ。
- 長さはドナー腎静脈の直径に相当になるように静脈切開内でそれらを開くことによって、先端の細いピンセットを用いて静脈切開を広げる。
- 静脈切開（ 図1.2）の頂点に最初の（腎静脈の内腔に既にある）10 / O優れた縫合糸を配置し、劣っ頂点に達するまで（ 図を実行している縫合糸での吻合の後壁に参加1.3）。
- 10 / O劣る縫合糸を配置した後、後壁から実行している縫合糸に結びつの結び目（ 図1.4）で最初に接続します。
- 劣った縫合糸を使用したフロントWALを作成吻合lの連続縫合で（ 図1.5）と優れた頂点（ 図1.6）で、優れた縫合糸端に接続します。
- 鉗子で大動脈壁を拾うとハサミで楕円形のパッチを（ほぼ大動脈切開は大動脈の周囲の長さで三回腎動脈内腔の第五でなければならない）切断することによって大動脈切開を作成します。
- 外部から内部への大動脈パッチの優れた点（ 図1.7）で10 / O縫合糸を配置し、大動脈切開の優れた頂点に血管外に結ぶために大動脈を通過する。
- 受信者の大動脈にドナーパッチを実行している吻合縫合糸が上方に始まると動脈吻合（ 図1.8）を作成します（ 図1.9）きつすぎる縫合糸を結びつけることによって吻合を収縮しないように注意してください。
- （腎臓を再灌流まず、優れたクランプ劣る血管クランプを取り外し図1.10および1.11）。尿管に十分な血液供給が達成されている場合尿管の蠕動可視多分見。
6腎臓移植 - 尿管吻合
- 腹壁から膀胱の添付ファイルを分割します。
- 両方の壁を介して膀胱の左から右へ針（21G）を渡します。
- 針管腔内にストレート鉗子先端を置き、鉗子が今膀胱の左側から右から左に通過しているように、膀胱を通って両方がバックに渡す。
- 尿管が右サイドから次に左膀胱不良で通過するように、膀胱を経てドナー尿管上の縫合糸を描画します。
- ラウンドボディの針で9 / Oナイロン縫合糸のエントリポイントを中心に3つの結節縫合で膀胱の外膜への尿管の外膜を縫合。
- こうして目を開いて、合字に尿管の近位にカット電子の尿は、尿が流れると尿管の端部が膀胱の体内に引っ込めることができるように許可する。尿の可視生産はペリ尿管の血管からの出血と一緒に観察することができる。
- シングル中断された9 / O絹縫合糸で右側膀胱不良を閉じます。
7。回復と術後ケア
元の向きで腹部に胃腸内臓を交換して、6 / O吸収性縫合糸で直筋を近似することにより腹壁を閉じます。
- 金属の皮膚クリップで皮膚に近似している。
- 部分的atipamazole塩酸塩（10μL/ g）を皮下注射による麻酔を逆転。
- 皮下の0.9％NaCl 1mlを皮下ブプレノルフィン塩酸塩（0.05ミリグラム/ kg）を、流体支援注入に鎮痛を管理します。
- 24〜48時間、28℃で加温キャビネットにマウスを回復します。までの病気のためのマウスを観察します実験終了。
- 10日に作動ポスト - 金属の皮膚クリップ7を削除します。
- 実験が完了すると、頚椎脱臼によりマウスを安楽死させる。
- 取り外し、組織学的分析のための対側腎臓および同種移植片を収集します。
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結果
腎臓の同種移植片拒絶は、移植された腎臓（ 図2）のmethacarn固定パラフィン包埋組織切片の組織学的分析によって評価することができる。腎臓の虚血再灌流障害における同系マウスの結果の間に腎臓の同系移植移植は、しかし、4週間までに細管を回収し、ネイティブの腎臓への組織学的に同等であるしている。急性拒絶反応は、BALB / cレシピエントにC57BL / 6腎臓移植によってモデル化することができる、1週間以内に拡散し、単核細胞浸潤は、間質、糸球体及び細管を含む、腎実質全体に存在する。慢性同種移植片の損傷が、C57BL / 6レシピエントに移植したC57BL / 6 BM12腎臓によってモデル化することができる、これは間質性線維症および段階的な尿細管の損失からなるヒト病態に見られる典型的な特徴になる。ハイパワーフィールド（×200倍率）あたりの総細管数は（Fiを提供して機能的ネフロン塊の定量化を可能にするグレ3）、尿細管の損失が拒絶に起因する細管障害を反映している。間質性線維症は、汎コラーゲン染色ピクロシリウスレッド（ 図4）を
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ディスカッション
動脈吻合を実行するために、最もよく説明した方法は、受信者の大動脈にエンド·ツー·サイド方式では、継続中の腎動脈に、ドナーの遠位大動脈を使用することです。私たちは、より便利であると私たちは信じている人間の腎臓移植で行われる「カレルパッチ」ミラーリングと同様、大動脈パッチの使用を記載している。ドナーとレシピエント手術時間の文献の報告が疎であるが、私たちは、受信者の大動脈に代わりに、エンドツーサイドドナー大動脈の受信者の大動脈に大動脈パッチを利用することが望ましいと考えています。パッチを使用すると、すべての腰椎のドナーの大動脈の枝を解剖する必要性を否定し、また時間が自然にこれらを除外するパッチを吻合するように、個別に連結するように注意。
このモデルを達成するための重要なステップは、動脈パッチ吻合内の腎動脈以外の他の動脈の内腔がないことを確認するために世話をして含まれ、それら微小血管クランプが削除されたときにリークします。吻合を構築する縫合糸は密接に関連しますが吻合を絞り込み、虚血を引き起こしたり、任意の血流を阻害することができる巾着効果を認識して、実用性に私たちは楕円形の大動脈切開を...
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開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
腎臓研究英国、エジンバラの外科ロイヤルカレッジと臓器移植の欧州協会からの資金調達は、この研究を支持した。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 手術器具 | |||||||
| 鈍い解剖はさみ | ファインサイエンスツール | 14072-10 | 皮膚切断用 | ||||
| 湾曲したCastoviejoはさみ | ファインサイエンスツール | 15017-10 | 組織切断用 | ||||
| スプリングハサミ – ストレート | ファインサイエンスツール | 15000-08 | 縫合切断用 | ||||
| 歯付き鉗子 1x2 歯 | ファインサイエンスツール | 11021-12 | |||||
| 2 x ファインチップ鉗子 (Dumont No.5) | ファインサイエンスツール | 11251-20 | |||||
| 角度のついた細い先端の鉗子(Dumont No. 5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | 鈍い解剖用 | ||||
| 湾曲したFine Tip 鉗子(Dumont No.7) | Fine Science Tools | 11273-22 | 血管の周りを通過するのに便利 | ||||
| Curved Crile Haemostat | Fine Science Tools | 1300-04 | |||||
| ロック付きマイクロクリップアプリケーター | Fine Science Tools | 18056-14 | |||||
| 2 x マイクロ serrefines スプリング幅 2mm、顎の長さ 4mm | ファイン サイエンス ツール | 18055-04 | マイクロ血管クランプ | ||||
| 2 x Colibri 3cm ワイヤー リトラクター | ファイン サイエンス ツール | 17000-03 | |||||
| ロック付きカストロビエホ ニードル ホルダー | ファイン サイエンス ツール | 120660-01 | |||||
| 傷口クリップ アプリケーター | ファイン サイエンス ツール | 12031-07 | |||||
| 7mm 傷口クリップ | ファイン サイエンスツール | 12032-07 | 手術後7〜10日で取り外し | ||||
| Equipment OPMIピコ顕微鏡 カールツァイス S100 先端の細かいガイガー付きサーマル焼灼ユニット ガイガー 150A 熱電子パッド Cozee Cumfort n/a Euroklav 23-S Melag n/a オートクレーブ | 使い捨て | ||||||
| 7/O シルク編組縫合 | Pearsall | 30514 | |||||
| 10/O ダフィロン(ポリアミド)縫合 | B-ブラウン | ||||||
| 6/O Vicryl (プリガレクチン) | Ethicon | W9537 | |||||
| レギュラーベベル針、1インチ、21G | ベクション、ディキンソンアンドカンパニー | 305175 | 尿管アナスタモシス用 | ||||
| レギュラーベベル針、5/8インチ、25G | ベクション、ディキンソンアンドカンパニー | 305122 | |||||
| レギュラーベベルニードル、1/2インチ、30G | ベクション、ディキンソンアンドカンパニー | 304000 | |||||
| インスリン針1ml、29G | ベクション、ディキンソンアンドカンパニー | 324827 | |||||
| インスリン針0.3ml、30G | ベクション、ディッキンソンアンドカンパニー | 324826 | |||||
| 1mlシリンジスリップチップ | ベクション、ディキンソンアンドカンパニー | 300184 | |||||
| 5mlシリンジスリップチップ | ベクション、ディキンソンアンドカンパニー | 302187 | |||||
| ワイポール紙綿棒 | キンバリークラーク | L40 | オートクレーブによる滅菌 | ||||
| コットンウールのつぼみ | ジョンソン・エンド・ジョンソン | n/a | オートクレーブによる滅菌 | ||||
| プレーンドレープ | ガーディアン | CB03 | オートクレーブ滅菌 | ||||
| 細胞培養皿 60mm x 15mm | コーニング 430166 | ||||||
| 分注ピン | B-ブラウン | DP3500L/413501 | NaCl 0.9% | ||||
| Re-agents and Drugs | |||||||
| (Lacri-Lube) ホワイトソフトパラフィン 57.3%、鉱物油 42.5%、ラノリンアルコール 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |||||
| (Videne) ポビドンヨード 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |||||
| (Vetalar V) ケタミン塩酸塩 | ファイザー アニマルヘルス | Vm 42058/4165 | 100mg/ml 溶液 (用量 200mg/kg)( | ||||
| ドミトール) メデトミジン塩酸塩 | オリオンファーマ | Vm 06043/4003 | 1mg / ml(用量0.5mg / kg)( | ||||
| 獣医学)ブペルノルフィン塩酸塩 | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml (用量 0.05mg/kg) | ||||
| (アンチセダン) アチパメゾールヒドロコリド | オリオンファーマ | Vm 06043/4004 | 5mg/ml (用量 2mg/kg) | ||||
| ウィスコンシン大学 ソリューション | ベルザー ブリッジ トゥ ライフ | n/a | 用量 約 500 マイクロリットル/マウス | ||||
| NaCl 0.9% | バクスター | FKE1323 | |||||
| ヘパリン 硫酸塩 | 非独占的 | N/A | 5000ユニット/mL (投与量 5ユニット/マウス) | ||||
参考文献
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